Förbereda Vidhäftande Cells för röntgen fluorescens avbildning av Chemical Fixering

Introduction

Röntgenfluorescens avbildning möjliggör både identiteten och mängden av element som förekommer i ett prov som skall spatialt upplöst. Incident röntgenstrålar, av en energi vald att vara större än den elektronbindningsenergin för den tyngsta elementet av intresse, övervinna bindningsenergin av inre-skal elektroner till kärnan ^1. Detta skapar ett "hål" i elektronskal. Som högre energi elektroner faller ned in i dessa hål, är fluorescensröntgenstrålar som avges vars våglängd är beroende av energi separationen av dessa orbitaler. Eftersom energiavståndet hos orbitaler är karakteristisk för ett givet element, har fluorescensemission röntgen även karaktäristiska våglängder, beroende på elementet. Det är denna emission vid en karakteristisk våglängd som möjliggör identifiering av de ämnen som förekommer. Kalibrering av fluorescensintensiteten medger kvantifiering av de närvarande elementen.

Röntgenfluorescens microscopy (XFM) har blivit allt utnyttjad, delvis på grund av utvecklingen av mycket lysande röntgen synkrotronexperiment källor, såsom de på Spring-8 i Japan, Europeiska Radiation Synchrotron Facility (ESRF) i Frankrike, och Advanced Photon Source ( APS) i USA ^2. Dessa källor ger mycket hög intensitet röntgenstrålar. Samtidigt, förbättringar i röntgenoptik, såsom zonskiva teknik, tillät fokuseringen av dessa balkar till submikrona fläckar, om än ganska ineffektivt ^3. Med mycket högintensiva balkar, även en relativt liten mängd ljus som kan fokuseras är tillräcklig för att excitera de endogena metaller i celler, som producerar signal som kan mätas med den tillgängliga detektorteknologi. Således studera kemisk biologi av metaller i cellen är ett program särskilt som använder många av den senaste utvecklingen i denna teknik ^4-10.

Det finns många viktiga faktorer som måste beaktas när appenliggande XFM att undersöka den elementära distribution och kvantifiering av odlade däggdjursceller eller andra biologiska prover. För det första måste det prov som skall hållas intakt, både strukturellt och med avseende på dess elementarsammansättning, för för mätningen skall vara meningsfull. För det andra måste provet också bevaras på något sätt så att den är härdig för strålningen skador som kan orsakas av en fokuserad röntgenstråle. Ett sätt att ett prov kan möta båda dessa kriterier på en gång är att snabbt fryses in i en glaskroppen, amorf is ^11,12. Snabb frysning uppnås ofta genom olika frysförvaring tekniker såsom dopp frysning eller högtrycks frysning ^13-16. Det är allmänt accepterat att frysförvaring bevarar övergripande cellulär arkitektur och kemiska sammansättningar i biologiska prover så nära naturliga tillstånd som möjligt. Kemisk fixering, å andra sidan, på grund av den långsamma och selektiv penetrering av fixeringsmedel in i celler och vävnader som well som efterföljande förändringar i membranpermeabiliteten, kan tillåta olika cellulära joner speciellt diffunderbara joner såsom Cl, Ca och K ska lakas, försvunna eller flyttas, vilket gör utredning av dessa element suboptimala ^17-19. Trots den klara fördelen med Cryo-fixering över kemisk fixering i allmänhet, för vidhäftande däggdjursceller i synnerhet, har frysförvaring olika begränsningar ^20-23. Den mest uppenbara är att inte varje forskningslabb har enkel tillgång till frysförvaring instrument. De flesta av dagens högtrycks frysar eller ens kasta frysar är kostsamma och ägs endast av en delmängd av cryo anläggningar, vilket kan vara långt från där cellerna inkuberas. Fördelen med frysförvaring kan handlas för nackdelen med resor stressen placeras på cellerna. Medan frysförvaring är säkerligen den mest rigorösa sättet att bevara prover för röntgenfluorescensanalys, är det verkligen inte den mest tillgängliga för alla forskare under alla omständigheter;inte heller är det alltid viktigt - om metallerna av intresse är hårt bundna till fastställbara makromolekyler, och den upplösning som provet kommer att avbildas är större än skadan på ultramikrostruktur som kan uppstå under torkning. Mindful av förbehåll ^24, kan kemisk fixering och torkning vara ett lämpligt val.

Andra faktorer i en framgångsrik röntgenfluorescens avbildningsexperiment inkluderar ordentlig analys. Röntgenfluorescens avbildning är i grunden röntgenfluorescensemissionsspektroskopi kombinerat med raster-scanning för att tillhandahålla rumslig upplösning. Röntgen fluorescens emissionsspektra insamlade innehålla en kombination av överlappande emissionstoppar, bakgrund och de elastiska och oelastiska spridnings toppar av den infallande strålen. Programvara som möjliggör de-faltning av dessa bidrag, liksom installation av utsläppstoppar, har varit en viktig utveckling för området ^25. Också, utveckling och kommersiell distrade distributionen av tunnfilmsstandarder av känd sammansättning, som används för att kalibrera fluorescensintensiteten i förhållande till materialmängden, har också varit mycket viktigt.

Protokollet ger en beskrivning av beredningen av vidhäftande celler genom kemisk fixering och lufttorkning. Ett viktigt steg i denna process är tillväxten av cellerna på kiselnitrid fönstren, som ofta inte följer också, vilket gör skonsam sköljning på ett speciellt sätt nyckeln till framgång.

Protocol

1. Beredning av Instrument, Substrat, Kultur Media och Rätter

1. Hantering av kiselnitrid (Si ₃ N ₄₎ fönster.
   1. Öppna kapseln något genom att klämma en ände innehållande fönstret på ett sådant sätt att inte pressa själva fönstret, under rotation den andra änden av kapseln med den andra handen.
   2. Kontrollera ett par back, till spetsig pincett enligt stereomikroskop se till att det inte finns några lim, luckor eller utbuktningar på spetsen. Annars kan fönstren brytas av pincett eller flyga bort av dem under de efterföljande stegen.
   3. Avlägsna fönstret från kapseln genom att försiktigt ta tag i ramen på fönstret med pincett, medan försiktigt klämma kapseln nära den öppna änden applicering av tryck i en riktning så att kapseln bredare där kanterna på fönstret måste komma ut.
2. Fönster pre-wash (tillval).
   1. Om så önskas, pre-tvätt fönster genom att försiktigt doppa demi destillerat vatten under 5 sekunder, följt av 2 min tvättning i 70% etanol och 2 min tvättning i 100% etanol.
3. Anbringande och sterilisering fönster på odlingsskålen.
   1. Att fästa fönstren, ställ fönstret med platta sidan upp på botten av kulturen skålen, placera en bit tejp på en ren glasskiva. Skär ungefär en fjärdedel tum remsa av ner långsidan av bandet. Ta en bit av tejpen kortsidan (vid ⅛ "med ¾") med en ren rakblad.
   2. Använd pincett för att tillämpa den del av bandet till kanten av gallret eller fönstret. Använd tillräckligt för att säkert hålla sig det utan att täcka fönsteröppningen själv. Manipulering den vidhäftade tejpen med pincett, ställa in fönster ner på botten av odlingsskålen. Använd spetsen av pincetten för att vidhäfta tejp på botten av odlingsskålen ordentligt.
   3. Applicera en annan tejpremsa till den andra kanten och vidhäfta detta till botten ordentligt med spetsen på pincetten.
   4. När alla fönster ärtejpade, sterilisera fönster i odlingsskålar med ultraviolett (UV) strålning. Uppnå detta genom att placera skålen under UV-lampan i en huv med laminärt flöde under ca 1 h.
   5. (Valfritt) Om fönstren ska i förväg belagd med poly-lysin, gör så följande fönster sterilisering. Coat fönstret med 10 | il av steril 0,01% poly-L-lysin lösning under 1 timme i en 37 ° C inkubator, och skölj den återstående lösningen av med odlingsmediet.
4. Förbered buffertar för sista tvätten innan XFM.
   1. Bered antingen en Tris-glukos eller piperazin- N, sackaros N'-bis (etansulfonsyra) (PIPES) buffert fri från alla spårmetaller med osmolalitet och pH motsvarar Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (D-PBS) utan kalcium och magnesium. Använd någon av dessa buffertar att skölja celler efter celler kemiskt fixeras.
      1. För att göra den Tris-glukoslösning (10 mM Tris, 260 mM glukos, 9 mM ättiksyra,) tillsätt 1,4 g glukos, 36 mg Tris-bas och16 pl av ättiksyra till 20 ml ultrarent vatten. Därefter, justera den slutliga volymen till 30 ml med ultrarent vatten. Det behövs ingen pH-justering. Förvara vid RT upp till en vecka.
      2. För att göra rören-sackaros (20 mm rör, 200 mM sackaros) till 0,18 g av rör och 2,0 g sackaros till 20 ml ultrarent vatten och justera pH till 7,4 med små mängder av koncentrerad ättiksyra. Därefter, justera den slutliga volymen till 30 ml med ultrarent vatten. Förvara vid RT upp till en vecka.
         OBS: anledning att undvika användning av PBS i det sista skölj är att koncentrationerna av fosfat, klorid och kalium i PBS är så hög att den kan störa XFM om den inte avlägsnas fullständigt innan lufttorkning.
5. Förbered buffertar för cell plätering.
   1. Förbered eller ta ut alla medier, såsom RPMI-medium 1640, 1x trypsin-EDTA-lösning, D-PBS, och alla andra reagenser som behövs för den särskilda vidhäftande cellinje som normalt skulle göras för passage av vidhäftande cellerna of intresse och värma dem till 37 ° C.

2. Plätering av celler

1. Till den steriliserade odlingsskål innehållande fönstren, i laminärt flöde huva, försiktigt lägga till media (10 ml för en 100 mm odlingsskål), längs sidan av kulturen skålen med det lutar. Undvik att skapa onödiga ytspänning eller släppa media direkt på ytan av kiselnitrid fönster. Som media sätts långsamt avlasta lutningsvinkel att belägga gallret och fönster med media.
2. Förbered vidhäftande cellinje av intresse lämpligt, trypsinizing eller skrapa cellerna bort av plattorna som vanligt för passage av cellinje. Utför någon cellräkning, eller annan beredning behövs innan du applicerar cellerna till färsk platta.
3. Lägg celler till odlingsskål med fönster på en celltäthet som behövs för att normalt nå 50% -70% sammanflödet inom 24-72 timmar, och inkubera vid 37 ° C i en fuktad inkubator med 5% koldioxid. Beakta cellernas tillväxt och då, med användning av ett inverterat ljusmikroskop, tills den önskade celltätheten (vanligen 50% -70% konfluens) har uppnåtts.

3. Fixering av celler

1. Bered färsk 4% paraformaldehyd i D-PBS genom att späda en köpt lager (såsom 25% paraformaldehyd) och justering av pH till 7,4 med ättiksyra (för att undvika att tillsätta överskott natrium till provet).
2. När cellerna har odlats enligt önskemål, och eventuella viktiga fläckar (t.ex. Hoescht) har tillämpats och avbildas, ta bort media genom försiktig uppsugning, luta skålen i 45 ° vinkel med ena handen, och aspire hand pipett med andra .
   OBS: I stället för pipetterspend media, är ett alternativ att plocka fönstret upp, doppa fönster in mikrocentrifugrör med D-PBS två gånger och sedan placera den i en ny kultur kärl med fäst lösningar under 20 minuter följt av 2 gånger PBS tvätt för att avlägsna de kvarvarande fixativ. Om detta väljs, gå dirrekt till steg 3,5.
3. Skölj skålen försiktigt med D-PBS och ersätta den borttagna vätskan omedelbart genom att försiktigt lägga den färska 4% PFA / PBS medan du håller skålen i 45 ° vinkel, pipettering mot sidan av skålen, och långsamt avkopplande lutningsvinkeln för att tillåta den fixeringslösning för att täcka windows. Behåll cellerna täckta med fixeringsmedel under 20 min vid RT.
4. Avlägsna vätskan genom försiktig uppsugning, igen som ovan, luta skålen något och aspire hand.
5. Byt bort vätskan genom att försiktigt lägga till några av rören / Sackaroslösning, med hjälp av tilt och pipetteringsmetod som beskrivs i steg 3.3.
6. Upprepa steg 3,4 och 3,5.
7. Förbered material för torkning.
   1. Samla luddfria handdukar såsom Kimwipes, och dra en ur lådan så det är praktiskt väldigt snabbt och enkelt.
   2. Förbered en ren, icke-nivå plats att ställa in fönstret för att torka. Anges en gummigallermatta av det slag som används i elektronmikroskopi, som har åsar såfönstret kan stöttas på en ände medan den torkar. Detta kommer att hålla fönstret från att fastna till torkytan när den torkar, och dränera eventuellt kvarvarande buffert till kanten av provet.
8. Försiktigt pincett tejpen fäst vid fönstret för att hålla fönstret upp ur vätskan. Hämta fönster som kommer upp på bandet genom att applicera en liten mängd RÖR / sackaros för att få dem att flyta och sedan plocka upp dem med de omvända pincett.
9. Noggrant (utan att röra själva fönstret) och grundligt smörja eventuellt överskott RÖR / sackaros från kanten av fönstret med en Kimwipe. Smörja även baksidan indragen området med hjälp av en rundad veck av en Kimwipe.
   OBS: Målet är att ha så lite kristallisation av salter eller buffertar på ytan av fönstret som möjligt.
10. Placera fönstret på nätet mattan. Se till att fönstret inte ligger plant på nätet mattan, men uppallad på en kant (med åsarna i nätet mattan) och röra så lite av nätetmatta som möjligt. Låt fönstret torr.

4. Prov Montering och Imaging

1. När provet har torkat, kontrollera närvaron av celler på fönstren med hjälp av en ljusmikroskop. Utför denna kontroll, innan förbereda prover för transport till en synkrotron.
2. Paket fönstren för transport till synkrotronljus beamline värd experimentet. Anbringa försiktigt fönstren med tejp på två sidor till en glasskiva, sedan fästa glasskiva med tejp till botten av en plastpetriskål. Tape petriskålen stängd.
   OBS: Innan denna punkt, dessa steg kan utföras i någon typisk lab. Följande steg skulle bäst göras på synkrotronljus beamline.
3. Ta bort tejpen från fönstret försiktigt med pincett. Använd nagellack, i en tunn jämn beläggning längs kanten av fönstret, för att säkra fönstren till en aluminiumhållare från strålröret medarbetare på synkrotronljus.
4. Sätt i aluminiumhållaren ien kinematisk montera, och sedan placera den på plats i röntgenmikroskop. Montera provet på en hållare som förbinder den motordrivna stadier, inuti provkammaren vid strålröret.
5. Efter att ha lämnat prov röntgenmikroskop instrumentområdet (en kaninbur gjord av bly fyllda väggar), installation genomsökningen. Använda beamline-specifika program, välj lämpligt område av provet för att skanna, medan du tittar på läget för röntgenstråle på provet med hjälp av en kamera utrustad med en video hårkors och pre-linje med en nedströms scintillator kamera.
6. Välj lämplig upplösning för provet, baserat på en uppskattning av storleken på den minsta inslag av intresse. För avbildning enstaka däggdjursceller (~ 20-40 mikrometer i storlek), använd en upplösning på 0,25-0,5 um. För avbildning områden vävnader, och skilja cellskikt från varandra, använd en upplösning på 2-20 um.
7. Välj lämplig uppehållstid för provet, baserat på en uppskattning av mängden av den träffadeal av intresse är närvarande. För en snabb överblick skanning, eller om stora mängder metaller är närvarande, använd flyga skannar med uppehållstider av 30-300 ms per pixel. Om lite material är närvarande, eller att mäta metaller med låg relativ förekomst, använd steg skannar med uppehållstider på 1-2 sek per pixel.
8. Programmera skannar in i strålröret specifika program. Skaffa en raster-scan bilden. Samarbeta med strålröret kollaboratörer att analysera data med programvara som kommer att identifiera de karakteristiska energitoppar för varje element.

Representative Results

Förmågan hos röntgenfluorescensavbildning att ge information om biologiska prover är knuten dessa prover förbereds på ett sådant sätt att de är robusta för strålskador på tidsskalan för experimentet, och ändå deras kemiska och strukturella egenskaper är väl bevaras. I visa resultatet av ett prov som har tagits fram enligt ovan och avbildas, är det möjligt att se att det finns variationer i elementen närvarande - vilket tyder på att fixering bevarat dessa aspekter av cellen (Figur 1).

Omvänt, tittar i stället på ett prov där denna process gick inte bra, och bufferten förblir närvarande under torkning, omfattande kristallbildning från molekyler skapar strukturell skada på cellerna och även stör insamling av röntgenfluorescensspektra ( Figur 2).

Dessa bilder genereras av per-pixel montering av röntgenfluorescensspektrum vid varje punkt i bilden. Detta innebär att varje spektrum, samlas in på varje pixel, rats har individuellt analyseras. Vid visning panelerna i dessa bilder som genereras från de inpassade uppgifter, är det värde som tilldelats till varje punkt i bilden den integrerade summan av en Gauss för den karakteristiska emissionen av en given del (t.ex., järn) som bäst passar den röntgenfluorescens spektrum samlats på den punkten. Till exempel, en enda pixel i bilden har ett värde (antal) för järn, som är summan av området under en Gauss kurva vid den karakteristiska energiutsläpp för järn, som passar och modeller data för emissionsspektrum av denna punkt på provet. Informationen visas med tröskelvärden ovanför varje bild (max och min) som tilldelar hög- och låg-ändarna av färgtabellen (längst ner på varje bild) till specifika värden i bilden.

tp_upload / 52370 / 52370fig1highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 1. röntgenfluorescens Bild på ett humant SH-SY5Y Cell. Varje panel i denna bild visar olika information om samma celler. Den första panelen, märkt DIC, är det optiska differentialinterferenskontrastmikrograf av cellerna. Följande paneler, vänster till höger, är fosfor (P), svavel (S), järn (Fe), och zink (Zn) bilder av samma celler, visar deras fördelning över ytan i cellen. Skalan bar som visas är 20 um. Klicka här för att se en större version av bilden.

Figur 2. Röntgen Fluorescence Bild på en råtta B103 Cell, beredd med dålig eller otillräcklig borttagande av buffertar. Två celler är synliga i fosfor (P) panel,och är något synliga i järn (Fe) och zink (Zn) paneler. Emellertid, närvaron av kristalliserad buffert, synlig som ett utstryk av partiklar genom centrum av bilden, skymmer det mesta av informationen. Skalan bar som visas är 20 um. Klicka här för att se en större version av bilden.

Discussion

Röntgen fluorescens avbildning är användbar inom många områden, bland annat geovetenskap, materialvetenskap och kemisk biologi ^26-34. Framsteg inom synkrotron röntgen, och deras fokus, har producerat mycket högintensiva strålar. Fokuserad röntgen balkar tillräcklig för att excitera de endogena metaller i cellerna nu finns, producerar signal som kan mätas med tillgängliga kisel drift detektorteknologi. Och studera kemiska biologin av metaller i cellen är ett program särskilt som använder många av den senaste utvecklingen på detta område.

Ändå, undersökning av biologiska material med användning av röntgen fluorescensmikroskopi presenterar också speciella utmaningar, i förhållande till andra material, eftersom de är hydratiserade. För att förhindra strålskador, helst proverna skulle frysas i glaskroppen is under mätningen. Men kemisk fixering och lufttorkning är mycket mer tillgänglig för nybörjare, och kan vara lämpligt om metallernaintresse inert bundna till fastställbara makromolekyler, och den upplösning som provet kommer att avbildas är större än skadan på ultramikrostruktur som kan uppstå under torkning.

Vid bedömningen substrat för vidhäftande cell XFM studier, behöver ett idealiskt substrat för att uppfylla följande grundläggande krav: 1) stödja robust celltillväxt utan omväxlande normal proliferativ och fenotypisk celltillväxt, 2) får inte ha röntgenfluorescens som överlappar med de element av intresse, 3) vara optiskt transparent för celltillväxt bedömning enligt ljusmikroskop före XFM, och 4) tåla någon fysisk och kemisk manipulation under odling och efterföljande fixering. Historiskt olika substrat, som sträcker sig från tunna polykarbonat folier / filmer ^35-37, Formvar belagda guld transmissionselektronmikroskopi (TEM) galler ^38-42 och kiselnitrid fönster ^5,17,43-46, har använts för att odla däggdjurscells och användes för röntgenfluorescensavbildning. I jämförelse mellan de befintliga och potentiella substrat för avbildning vidhäftande däggdjursceller genom XFM, kiselnitrid membran (Si ₃ N ₄₎ fönster är mest lämpliga på grund av deras låga fluorescens bakgrund och relativt enkel grundämnessammansättning ^4-6,47,48. Dessutom Si ₃ N stödjer ₄ fönster robust cellbindning och spridning. Jämfört med andra vanliga substrat såsom TEM galler, Si ₃ N ₄ fönster har också ett mycket större sammanhängande avbildning område som är en särskild fördel när dessa fönster används för röntgentomografi.

Si ₃ N ₄ fönster är kommersiellt tillgängliga från ett begränsat antal leverantörer. Arbeta med kiselnitrid fönster är en förvärvad färdighet. Fönstren är mycket bräcklig, och kräver stor omsorg för att inte skapa några vridkrafter samtidigt hanterar dem som kan krossa dem, eller för att släppa dem. Handling dem av kanterna med omvända pincett är en populär metod. De flesta fönster har tjocklekar från 30 nm till 500 nm och en bredd från 1 x 1 mm till 5 x 5 mm. I allmänhet gäller att tjockare membranet, den mer robusta de är för alla typer av maskiner för stress. Men med ökad tjocklek och mindre optisk transparens, kommer de att öka bakgrundsemission från provet. De 200 nm tjocka membran är helt perfekt. De har minimal inverkan på mätningen, men är robust nog för att kunna hanteras utan större brott.

Även många celltyper testade kan initialt fästa och robust växa på de sterila Si ₃ N ₄ fönster, celler som odlats på kiselnitrid fönster är i allmänhet mycket lätt upprörd än celler på traditionella cellodlingsplattor. De blir lätt lossnar, aggregerade eller avrundas uppåt även under rutinmedie förändringar. Vi hittade förtvättade fönster blev ofta mer hydrofil; celler fäster bättre och hade mindre chance att aggregera ihop. De åtgärder som beskrivs i protokollet ovan beskriva en mild-tvätt metod för att hålla cellerna på fönstret. Några andra åtgärder som får vidtas innefattar beläggning fönstren med poly-lysin, eller laminin, precis som man kan belägga en täck.

En annan aspekt av detta förfarande, som kan vara den framgång eller misslyckande för ett givet experiment är omröring av proven. I observera cellernas tillväxt på plastodlingskärl, inte det normala intervallet av agitation följd av pipettering och platttransporter verkar inte orsaka mycket skada. Men för celler som odlas på kiselnitrid fönstren, behövs extra vård under medieförändring och platt transport. För vissa lätt upprörd celler såsom musfibroblastceller NIH / 3T3, de odlingsplattor innehållande fönster måste hanteras varsamt. De har noggrant tagits ut ur inkubatorn och försiktigt inställd på mikroskop scenen eller skåp yta. Inte nödvändigtvis varje liten physical chock stör cellerna, men risken för cell lossnar ökar utan extra omsorg. Dessutom kan olika satser av fetalt bovint serum och kiselnitrid fönster har vissa effekter på vidhäftningen av celler på fönstret. Vissa källor av serum eller satser fönster verkar lättare att arbeta med, det vill säga, utan att se alltför mycket störningar från liknande vård. Så kan några försök och misstag för cellinjen av intresse rådas.

Med utvecklingen av kryogena stadier för röntgenfluorescensmikropelare, liksom ny forskning vid framställning av frysta hydratiserade biologiska prover, är det troligt att provberedning i framtiden kommer mycket mer alltmer omfattar frysta hydratiserade prover. Många av de samma utmaningar i att arbeta med de kiselnitrid fönstren, och behålla celladhesion existerar där. Ändå, behärska denna teknik är fortfarande ett mycket bra ställe att börja på att utveckla färdigheter innan frysförvaring, ennd många gånger, är ett perfekt lämpligt sätt att bildprover.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon nitride windows	Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom	SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200 nm. Frame size: 5 mm x 5 mm. Frame thickness: 200 µm.	Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.
Reverse tweezers	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	78520-5X	EMS 5X, NC – Ultra Fine Tweezers
Rubber grid mat	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	71170	Round Grid Mat
Acetic acid	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	338826	trace metals grade concentrated acetic acid
PIPES buffer	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052	P6757	solid PIPES buffer
Formaldehyde stock solution	Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450	RT 17113	10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde