Summary
Trabaja con virus Ébola infecciosas está restringido a nivel de bioseguridad 4 laboratorios. Tetracistronic replicación y transcripción del virus competente como partículas que contienen minigenoma-(trVLPs) representan un sistema de modelado del ciclo de vida que permite modelar de forma segura múltiples ciclos infecciosos bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones, depender exclusivamente de componentes del virus Ebola.
Abstract
Virus Ebola causan fiebres hemorrágicas graves en los seres humanos y los primates no humanos, con tasas de mortalidad de hasta el 90%. No hay vacunas aprobadas o tratamientos específicos para la enfermedad causada por estos virus, y trabajan con virus de Ebola infecciosas está restringido a nivel de bioseguridad 4 laboratorios, lo que limita significativamente la investigación sobre estos virus. Sistemas de modelado del ciclo de vida del modelo de ciclo de vida del virus bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones; Sin embargo, hasta hace poco tales sistemas se han limitado a cualquiera de los aspectos individuales del ciclo de vida del virus, o un único ciclo infeccioso. Minigenomas Tetracistronic, que consisten en regiones de virus Ébola no codificantes, un gen reportero, y tres genes de virus de Ébola implicados en la morfogénesis, en ciernes, y la entrada (VP40, GP 1,2, y VP24), se pueden utilizar para producir la replicación y transcripción partículas -competent similares al virus (trVLPs) que contienen estos minigenomas. Estos trVLPs pueden infectar continuamente las células que expresan el Ébolaproteínas responsables de la replicación del genoma y la transcripción, lo que nos permite modelar de forma segura múltiples ciclos infecciosos bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones virus. Es importante destacar que los componentes virales de estos sistemas son exclusivamente derivados del virus de Ébola y no de otros virus (como es, por ejemplo, el caso en los sistemas que utilizan virus pseudotyped), y VP40, VP24 y 1,2 GP no se sobreexpresa en este sistema , por lo que es idealmente adecuado para el estudio de la morfogénesis, y la entrada en ciernes, aunque otros aspectos del ciclo de vida del virus, tales como la replicación del genoma y la transcripción también pueden ser modelados con este sistema. Por lo tanto, el ensayo trVLP tetracistronic representa el sistema más completo de modelos de ciclo de vida disponible para los virus de Ébola, y tiene un enorme potencial para su uso en la investigación de la biología de los virus Ébola en el futuro. Aquí, le ofrecemos información detallada sobre el uso de este sistema, así como sobre los resultados esperados.
Introduction
Virus Ebola son el agente causante de la fiebre hemorrágica grave en los seres humanos y los primates no humanos con las tasas de mortalidad de hasta el 90% en los brotes humanos 1. Si bien ha habido avances significativos en los últimos años en el desarrollo de vacunas, así como tratamientos específicos (revisado en 2,3), estos no son aprobados para el uso humano. Partículas de virus de Ébola tienen un aspecto similar al hilo característica con una longitud de aproximadamente 1 m y un diámetro de 96 a 98 nm 4. Se forma la nucleocápside el núcleo de las partículas virales y consiste en 1) el genoma de ARN de cadena simple no segmentado de sentido negativo, que codifica los genes 7 ebolavirus (Figura 1), 2) la nucleoproteína NP, que encapsida el genoma, 3 ) el complejo de la polimerasa viral que consiste en la polimerasa L y su cofactor VP35, y 4) el activador transcripcional VP30. Además, se ha demostrado recientemente que la proteína VP24 también se asocia con la nucleocápsides 4. La nucleocápside está rodeada por el espacio de la matriz en la que la proteína de la matriz VP40, que es responsable de la morfogénesis y la gemación de los viriones, se encuentra. Las partículas de virus son envueltos adicionalmente, y embebidos en el sobre es la única proteína de la superficie GP 1,2, que es responsable de la unión del virión y la entrada.
Trabaja con virus de Ébola infecciosas tiene que realizarse en un laboratorio de contención máxima bajo nivel de bioseguridad (BSL) 4 condiciones, que restringe este trabajo a unas pocas instalaciones en todo el mundo. Con el fin de estudiar la biología de estos virus o para desarrollar nuevas terapias en condiciones BSL2, los investigadores se basan ya sea en la sobreexpresión recombinante de proteínas del virus de Ébola, o en sistemas de modelado del ciclo de vida, los cuales pueden ser trabajados con en ausencia del virus de Ébola infecciosa. La expresión recombinante de las proteínas del virus Ébola se logra ya sea a partir de plásmidos de expresión o vectores virales. Un caso especial de esta estrategia es elgeneración de viriones o partículas similares a virus basado en virus distintos del virus de Ébola (más comúnmente retrovirus o virus de la estomatitis vesicular) en presencia de GP recombinante expresada 1,2, que conduce a la generación de partículas pseudotyped, que se puede utilizar para estudiar la proceso de entrada de los filovirus y pantalla de inhibidores de la entrada 5. Alternativamente, los virus recombinantes (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular) que codifican el virus Ebola GP 1,2 en lugar de su propia glucoproteína pueden ser generados y utilizados para estudiar la entrada del virus bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones 6.
Sistemas de modelado del ciclo de vida son formas de sistemas de genética inversa que ofrecen el uso de análogos truncados del genoma del virus de Ébola (minigenomas), que son producidos inicialmente a partir de cDNA y luego replicados y transcritos por las proteínas del virus de Ébola proporcionadas en trans. El primer sistema de minigenoma del virus Ébola fue desarrollado hace más de 15 años 7, Y desde entonces ha sido utilizado para estudiar la replicación del genoma del virus de Ébola y la transcripción (revisado en 8,9). En este sistema un minigenoma monocistronic que consta de un solo gen reportero flanqueado por las regiones terminales no codificantes del genoma del virus de Ébola (llamado el líder y remolque) (Figura 1) se expresa en células de mamífero (por lo general mediante transcripción usando ARN polimerasa de T7) junto con las proteínas virales L, VP35, VP30 y NP. El minigenoma se encapsidated por NP, y luego replica y se transcribe por las otras proteínas de la nucleocápside utilizando señales que actúan en cis localizados en el líder y el remolque, que conduce a la actividad del indicador que refleja estos dos aspectos del ciclo de vida del virus (Figura 2).
Con el fin de modelar pasos adicionales del ciclo de vida viral, transcripción y replicación competente partícula similar a virus sistemas (trVLP) se han desarrollado, que se basan en sistemas de minigenoma clásicos, pero una característica delexpresión complemen taria de las otras proteínas virales VP24, VP40 y GP 1,2 de plásmidos de expresión 10,11. La presencia de VP40 conduce a la formación de trVLPs, que llevan GP 1,2 en su superficie, y llevar a una nucleocápside que contiene minigenoma-en el interior. Estos trVLPs pueden usarse para infectar células diana, que o bien han sido pretransfected con plásmidos de expresión para L, VP35, VP30 y NP, para facilitar la replicación y transcripción de minigenomas introducidos en las células diana dentro de trVLPs 11, o las células diana son ingenuos (es decir sin expresión plásmido impulsado de proteínas del virus Ébola) 10. Esto resulta en la actividad del indicador en las células diana, lo que refleja la replicación de los minigenomas en las células productoras, la morfogénesis y la gemación de trVLPs, su entrada en las células diana, y 1) en el caso de las células diana pretransfected también la replicación y transcripción del genoma secundario ( es decir, la transcripción de proteínas virales produced en las células diana) en las células diana, o 2) en el caso de las células diana no tratados previamente también la transcripción primaria (es decir, la transcripción por las proteínas virales introducidos en células diana dentro de trVLPs) (Figura 3). Es importante destacar que estos sistemas sólo se han utilizado para modelar un único ciclo infeccioso, y se basan en la sobreexpresión de todas las proteínas virales, que en el caso de VP24 y VP40 es particularmente problemático, ya que estas proteínas han demostrado ser fuertes reguladores negativos de la replicación del genoma y la transcripción cuando se sobreexpresa a partir de plásmidos 12,13. Además, las preparaciones trVLP producidos en estos sistemas contienen una alta proporción de partículas no infecciosas, que presenta desafíos para el análisis bioquímico de trVLPs infecciosas 14.
Con el fin de superar estos problemas, hemos desarrollado recientemente un sistema de minigenoma tetracistronic que, además de un gen reportero, también contiene los genes que codifican para VP40, GP y 1,2VP24 (Figura 1). Similar al sistema minigenoma monocistronic clásica, este sistema conduce a la producción de trVLPs que pueden infectar células diana (Figura 4) 15. Sin embargo, en contraste con el sistema minigenoma clásica, VP40, GP 1,2, y VP24 se producen después de la transcripción del genoma viral en lugar de ser sobreexpresado a partir de plásmidos. Como resultado, la cinética y los niveles de expresión de estas proteínas imitan mucho más estrechamente las que se encuentran durante el ciclo de vida viral, y por consiguiente la proporción de infecciosa a trVLPs no infecciosas se aumenta cerca de 500 veces en este sistema 15. Además, el uso de este sistema fue posible pasaje continuamente trVLPs que contiene minigenoma-tetracistronic, el modelado de múltiples ciclos infecciosas. Como tal, trVLPs tetracistronic Actualmente el sistema más completo de modelos de ciclo de vida disponible para estudiar la biología del virus Ébola en condiciones BSL2. Aquí, le ofrecemos información detallada sobre el uso of este sistema, así como en los resultados esperados.
Protocol
1. Fraccionamiento de células productoras para la producción inicial de trVLPs
- Quitar Medio 80-90% de confluencia las células 293 se cultivaron en matraces de 75 cm2 en medio de Eagle alto contenido de glucosa de Dulbecco modificado (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1x penicilina / estreptomicina (DMEM10 ). Lavar las células dos veces con 10 de buffer fosfato salino ml (PBS), teniendo cuidado de no desalojar a las células, y añadir 2 ml de tripsina-EDTA a las células.
- Se incuban las células a temperatura ambiente hasta que las células muestran redondeo significativa cuando se observa bajo un microscopio (aproximadamente 30 segundos). Desalojar células por frasco de tapping, y añadir 8 ml DMEM10. Minuciosamente resuspender las células pipeteando suavemente arriba y abajo hasta que se observa una única suspensión celular cuando se observa bajo el microscopio.
- Contar las células utilizando un contador de células automatizado. Diluir las células a 2 x 10 5 células por ml en DMEM10. Pipetear 2 ml de suspensión celular por pocillo en placas de 6 pocillos (4 x 105 células por pocillo).
- Incubar las placas en un incubador de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2.
2. La transfección de células productoras para la producción inicial de trVLPs
- 24 horas después de la división de las células (véase la Figura 5 para una descripción general de la sincronización experimento), el plásmido ADN pipeta 15 (para cantidades ver Tabla 1) en unas estériles de 2 ml criovial utilizando puntas con filtro. Añadir 100 ml por pocillo de OptiMEM al ADN. Agite la mezcla brevemente y con cuidado de girar los tubos utilizando una microcentrífuga. Si varios pozos deben ser transfectadas con plásmidos idénticos, una mezcla maestra para varios pozos se puede hacer.
- Brevemente agite el vial con Tránsito LT1 antes de su uso. Añadir 7,5 l de Tránsito LT1 por pocillo con el ADN diluido. Agite suavemente la mezcla, teniendo cuidado de no recoger el líquido en la tapa de la criovial, y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente.
- Mezclar suavemente la transfeccióncomplejo pipeteando arriba y abajo. Añadir 100 l de los complejos de transfección gota a gota a cada pocillo. Roca la placa de adelante / atrás y de lado a lado para distribuir los complejos de transfección. No agite la placa ya que esto causará desigual difusión de los complejos de transfección.
- Volver a las células a la incubadora.
- Después de 24 horas, separar el sobrenadante de las células. Añadir 4 ml de DMEM con 5% de FBS, 2 mM L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (DMEM5) a las células. Este paso se puede hacer para un máximo de 3 pozos en un momento sin secado de los pozos, suponiendo que los pocillos contienen muestras idénticas (de lo contrario, debido a la naturaleza auto-amplificación de las trVLPs En este sistema, la contaminación cruzada puede ser un problema y este paso se debe hacer un pozo a la vez).
- Volver a las células a la incubadora.
3 Preparación de las células diana
- Dividir 293 células como se describe en la sección 1, la siembra de 4 x 10 5 células en 2 ml DMEM10 por pocillo de unaPlaca de 6 pocillos.
- 24 h después de la división de las células diana y 24 horas antes de la infección, las células diana transfectar como se describe en la sección 2 utilizando el ADN asciende en la Tabla 1, y 4,5 l de Tránsito LT1 por pocillo.
4. infección de células diana y la cosecha de células productoras
- La transferencia de los sobrenadantes de las células productoras de tubos de 15 ml. Retire y deseche cualquier resto de sobrenadante usando una manguera de vacío. Añadir 250 l de tampón de lisis Glo a las células.
- Sobrenadante Centrifugar durante 5 min a 800 xg y la temperatura ambiente para eliminar las muestras de los restos celulares.
- Eliminar el sobrenadante de un pocillo de las células diana. Añadir con cuidado 3 ml de sobrenadante aclarado célula productora de células por medio de la velocidad más lenta de la pipeta objetivo. Evitar pipetear directamente sobre las células con el fin de no perturbar la monocapa de células. Este paso se tiene que hacer un pozo a la vez.
- Cuando todas las muestras han sido transpreferido, volver las células diana a la incubadora para permitir la sedimentación de trVLPs y la infección de las células diana.
- Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente en el tampón de lisis Glo, resuspender las células productoras en el tampón de lisis usando una micropipeta ajustado a 150 l, y transferir la muestra en un 2 ml criovial. En este punto, lisados pueden ser congeladas a -80 ° C, o directamente valoran según se describe en la sección 6.
- 24 h después de la infección, eliminar el sobrenadante de las células diana. Añadir 4 ml DMEM5 por pocillo a las células. Este paso se puede hacer para hasta tres pozos en un momento, si los pozos contienen muestras idénticas (de lo contrario, debido a la naturaleza auto-amplificación de las trVLPs En este sistema, la contaminación cruzada puede ser un problema, y esta etapa debe ser hecho de un pozo a la vez).
5. Cosecha de células diana para una infección de ciclo único
- Si un solo ciclo de infección se debe evaluar, a las 72 horas después de la infección remove tque el sobrenadante de las células diana utilizando una manguera de vacío.
- Recoger las células en 250 l de tampón de lisis Glo como se describe en la sección 4 para obtener células productoras.
6. Cosecha de dirigirse a las células y los pases continuos de trVLPs
- Si trVLPs se deben a pases continuamente, preparar un nuevo conjunto de células diana como se describe en la sección 3 para que estén listas para la infección de 72 horas después de la infección de la primera serie de las células diana (ver Figura 5).
- Infectar el nuevo conjunto de células diana como se describe en la sección 4 (usando el primer conjunto de células diana en lugar de las células productoras).
- Repita estos pasos cada 72 horas.
7. Análisis de Periodista Actividad
- Si se congelaron los lisados celulares, descongelar a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras estén a temperatura ambiente antes de la medición.
- Descongele la cantidad requerida (40 l por muestra) de tampón de ensayo Renilla Glo (i idealmente congeladon alícuotas) a temperatura ambiente. Asegúrese de que el buffer ha alcanzado la temperatura ambiente antes de la medición.
- Añadir 1/100 º volumen de sustrato Renilla Glo para el tampón de ensayo Renilla Glo obtener reactivo Renilla Glo, y mezclar mediante agitación. Pipetear 40 l de reactivo de Renilla Glo en una placa de 96 pocillos blanco.
- Añadir 40 l de muestra al reactivo de Renilla-Glo. Espere 10 minutos, luego medir las muestras en un luminómetro usando un tiempo de integración de 1 segundo.
Representative Results
La transfección de células 293 productores con plásmidos de expresión que codifica el virus Ebola proteínas de la nucleocápside NP, VP35, VP30, y L, un minigenoma tetracistronic y los accesorios T7 polimerasa resultados en minigenoma la replicación y la transcripción y la actividad reportero que es fácilmente detectable a las 72 horas (Figura 6 ). Es importante destacar que la actividad de reportero observado (10 5.6 unidades de luminiscencia relativas (RLU)) excede a la de un control negativo en el que el plásmido de expresión que codifica L fue omitido de la transfección (10 3 RLU) por más de 2 registros. El bajo nivel de actividad observada incluso en ausencia de L es más probable debido a un promotor críptico en el plásmido minigenoma. Las células diana infectadas con trVLPs del sobrenadante de células productoras muestran en realidad poco aumento de los niveles de actividad del indicador en comparación con células productoras, y los valores alcanzan entre 10 y 10 7 6 RLU, dependiendo del pasaje. En contraste, wgallina el sobrenadante de células productoras de control L se pasaron a las células diana (que expresan todas las proteínas de la nucleocápside, incluyendo L), la actividad de reportero, no exceda del ruido de fondo del luminómetro (alrededor de 10 2 RLU).
El ensayo trVLP tetracistronic se puede utilizar para estudiar el ciclo de vida de los virus Ébola. Por ejemplo, la infección de células 293 con trVLPs es dependiente de la presencia de factores de fijación tales como Tim-1 16, que tiene que ser proporcionada en trans en estas células. En consecuencia, en un ensayo de trVLP tetracistronic se observa una caída en la actividad del indicador en las células diana de aproximadamente 100 veces en ausencia de Tim-1 (Figura 7A). El papel de las proteínas específicas (virales o celulares) en el ciclo de vida del virus también se puede evaluar utilizando la tecnología del RNAi junto con este enfoque. Como ejemplo, el ARNi mediado por la baja regulación de los resultados de L en una caída en la actividad reportera de alrededor de 100 veces, lo que refleja el papel central de L enla replicación y transcripción (Figura 7B) 7. Además, es posible manipular directamente el minigenoma para evaluar el efecto de mutaciones en el ciclo de vida del virus. A modo de ejemplo, cuando VP24-expresión del minigenoma es abolida por la introducción de 3 codones de terminación inmediatamente aguas abajo del codón de inicio, la actividad del indicador en células productoras no se cambia radicalmente; sin embargo, la actividad del indicador en las células diana se reduce en aproximadamente 20 veces después de un pasaje, y 400 veces después de dos pasajes, lo que indica un papel de VP24 en la producción de trVLPs infecciosas (Figura 7C) 15.
Figura 1. Estructura del genoma del virus de Ébola, así como minigenomas monocistronic y tetracistronic. Regiones de la proteína del virus de Ébola Codificación se muestran como rojo (NP,VP35, VP30, y L), amarillo (VP40 y VP24) o azul (GP 1,2) cajas. Regiones no codificantes (NCR) se muestran en verde, con las regiones líder y remolque indicados. El subíndice indica que se utilizó NCR viral para la unión de las regiones codificantes. La región que codifica para el reportero (rep) se muestra en color morado.
Figura 2. ensayo de minigenoma monocistrónica. Las células se transfectaron con plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside del virus de Ébola (NP, VP35, VP30, L), un minigenoma monocistronic (mg) y la polimerasa de T7. El minigenoma se transcribe inicialmente por la polimerasa de T7 (a) en un ARN minigenoma unencapsidated en la misma orientación que el genoma viral (ARNv), que luego es encapsidado por NP (b). Este encapsidated vRNA se replica a través de un ARN minigenoma complementario (cRNA) intermedio (c), y luego se transcribe en ARNm reportero (d) que se traducen en proteínas reportero (e).
Figura 3. ensayo trVLP con un minigenoma monocistronic. Células son transfectadas con plásmidos de expresión para los componentes del ensayo (minigenoma las proteínas de la nucleocápside del virus de Ebola NP, VP35, VP30, L, A minigenoma monocistronic y la polimerasa T7), así como VP40, GP 1 , 2 y VP24. Esto conduce a la formación de trVLPs que incorporan nucleocápside que contiene minigenoma-(F). Estos trVLPs puede entonces infectar las células diana (g), que se pretransfected ya sea con plásmidos de expresión para NP, VP35, VP30, y L (parte superior), lo que resulta en la replicación y la transcripción secundaria (d) que conduce a la expresión del indicador (e), o ingenua células diana (abajo), lo que resulta en la transcripción primaria del minigenomes (h), que también conduce a la expresión de reportero (e).
Figura 4. ensayo trVLP con un minigenoma tetracistronic. Las células se transfectaron con plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside del virus de Ébola (NP, VP35, VP30, L), un minigenoma tetracistronic (mg) y la polimerasa de T7. La transcripción inicial (a), la encapsidación (b), la replicación del genoma (c) y la transcripción (d), así como la traducción (e) se producen como en un ensayo de minigenoma monocistronic. Sin embargo, además de ARNm reportero, mRNAs de VP40, VP24 y 1,2 GP también se transcribe a partir del minigenoma tetracistronic, resultando en la formación de trVLPs (f). Estos trVLPs infectan células diana que han sido pretransfected con plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside NP, VP35, VP30 y L, así como el virus Ébola celularfactor de unión Tim-1, lo que resulta en la replicación del genoma y la transcripción, y la producción de trVLPs que se pueden utilizar para infectar células diana frescas.
Figura 5. Momento de un ensayo de trVLP tetracistronic para 3 pasos consecutivos. Los días de la siembra de células (s), la transfección de células (t), la infección de células (i), cambio de medio (c) y la cosecha de las células y trVLPs (h) son indicado para tres pasos consecutivos (indicado por flechas).
Figura 6. niveles típicos de la actividad del indicador observado en un ensayo trVLP tetracistronic. Un ensayo trVLP tetracistronic se realizó en 5 pasos siguiendo el protocol se describe en este manuscrito. Como control negativo el plásmido de expresión que codifica L se omitió (L) a partir de la transfección de las células productoras p0. Las células diana en pasajes P1 a P5 se transfectaron con plásmidos de expresión para todas las proteínas de la nucleocápside, incluyendo L. El ruido de fondo del luminómetro está indicado como una línea discontinua. Los medios y las desviaciones estándar de 4 repeticiones biológica de 3 experimentos independientes se muestran.
Figura 7. Evaluación del impacto de diversos factores virales y celulares en el ciclo de vida viral usando trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 como un factor de unión. Las células diana que fueron pretransfected con plásmidos de expresión que codifican para las proteínas de la nucleocápside y con o sin un plásmido que codifica para Tim-1 (descrito en 15) fueron infectadas con tettrVLPs racistronic. 72 horas después de la infección actividad de reportero en las células diana p1 se determinó. Las medias y las desviaciones estándar de 4 repeticiones biológica de 4 experimentos independientes se muestran. (B) Efecto de RNAi desmontables de L en la replicación del genoma y la transcripción. Células diana que se pretransfected con plásmidos de expresión de los componentes de la nucleocápside, Tim-1 y miRNAs dirigidos contra L (anti-L) o una proteína no relacionada (anti-GFP) (descrito en 15) se infectaron con trVLPs tetracistronic. 72 horas después de la infección actividad de reportero en las células diana p1 se determinó. Las medias y las desviaciones estándar de 5 repeticiones biológica de 2 experimentos independientes se muestran. (C) Efecto de mutaciones en el minigenoma en trVLP infectividad. Un ensayo trVLP tetracistronic se realizó utilizando un tipo salvaje minigenoma (4cis-WT) o un minigenoma en 3 codones de parada que se habían introducido inmediatamente después del codón de inicio de VP24, la supresión de la expresión of esta proteína pero introduciendo sólo cambios mínimos en el minigenoma en lo que respecta a la longitud, composición de ácido nucleico, etc estructuras secundarias actividad de reportero en p0, p1 y p2 se midió 72 horas después de la transfección / infección. Los medios y las desviaciones estándar de 3 réplicas biológicas de 3 experimentos independientes se muestran.
| Las células productoras (P0) | Las células objetivo (p1 y superiores) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1000 | 1000 | |
| p4cis-vRNA-Rluc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-TIM1 | - | 250 |
Tabla 1. asciende ADN para la transfección. La cantidad de cada plásmido requerido para la transfección de células productoras y diana se muestra en ng por pocillo de una placa de 6 pocillos. Todos los plásmidos se describen en Watt et al 15.
Discussion
El ensayo trVLP tetracistronic se describe en este manuscrito permite el modelado del ciclo de vida del virus de Ébola en varios ciclos infecciosas. Es importante destacar que los trVLPs producidos en este sistema no contienen la información genética para las proteínas de la nucleocápside NP, VP35, VP30, y L, que en conjunto conforman casi el 60% del genoma del virus del Ébola y son esenciales para la replicación viral. Más bien, estas proteínas tienen que ser proporcionados en las células diana en trans a partir de plásmidos de expresión, y cualquier infección de las células que no expresan todos los 4 de esas proteínas es abortiva. Es importante destacar que no hay pruebas de la recombinación genética para filovirus, y no hay regiones homólogas compartidas entre el minigenoma tetracistronic y los plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside. Por lo tanto, no hay ni ninguna prueba práctica ni ninguna base teórica que podría prever la posibilidad de la generación de larga duración en los genomas del virus Ebola que podrían entonces potencialmente resultar enla producción de virus de Ébola infecciosas, por lo que este sistema seguro para el uso en condiciones BSL2.
Hay dos pasos críticos en el ensayo trVLP tetracistronic que se ven influidas por las condiciones experimentales, es decir, la producción de trVLPs, y la infección de las células diana con estos trVLPs. Producción de trVLPs depende de altos niveles de replicación de minigenoma y la transcripción, que a su vez depende de una alta eficacia de transfección. La eficacia de transfección puede ser fácilmente evaluada mediante la inclusión de un control de L, en la que se intercambia el plásmido de expresión de L para un plásmido de expresión que codifican eGFP. Tasas de transfección en estas condiciones deben exceder 50% por inspección con un microscopio de fluorescencia 24 horas después de la transfección. Además, las células tienen que estar libres de micoplasma, ya que en nuestra experiencia contaminación por micoplasmas deteriora drásticamente la replicación y la transcripción minigenoma (datos no publicados). Debido a su alta transfectability 293 cells son la línea celular de elección para los ensayos trVLP; sin embargo, estas células son relativamente poco susceptible (aunque no completamente de refracción) a la infección con el virus de Ébola 16. La expresión de un factor de unión tales como Tim-1 mejora la infección de 293 células con trVLPs aproximadamente 100 veces, y es crucial para el éxito de este sistema a través de varios pasajes.
Mientras trVLPs tetracistronic no son auto-replicante por su cuenta, que son auto-replicantes en las células que expresan las proteínas de la nucleocápside. Como tal, las precauciones tienen que hacerse para evitar la contaminación cruzada entre los pocillos que contenían diferentes trVLPs (por ejemplo, con diferentes mutaciones en el minigenoma). Desde un punto de vista más técnico, debido a la gran diferencia entre las señales positivas y negativas en este ensayo (aproximadamente 4 logs), la diafonía entre las muestras cuando se mide la actividad de luciferasa puede ser un problema; sin embargo, esto puede evitarse fácilmente dejando un pocillo vacío entre cada muestra en elPlaca de 96 pocillos se utiliza para medir la actividad luciferasa.
Hay una multitud de posibles aplicaciones para trVLPs tetracistronic. Obviamente, son muy adecuadas para el estudio de la entrada de partículas filovirus, ya trVLPs infecciosas tienen la estructura de banda de rodadura típica de filovirus infecciosas 14, y contienen los mismos componentes virales como partículas filovirus. Es importante destacar, que no contienen componentes de otros virus, como es el caso cuando se utiliza pseudotyped viriones o partículas similares a virus, tales como partículas de retrovirus que llevan GP 1,2, o virus recombinantes, tales como virus de la estomatitis vesicular recombinante que expresa GP 1,2 . El requisito de factores de fijación cuando se utiliza 293 células como células diana en este sistema puede ser explotado para la detección de e investigar el papel de tales factores de fijación, mientras que las funciones de los otros factores celulares, tales como los implicados en la replicación del genoma y la transcripción, así como morfogénesis y broteding, se puede investigar mediante la tecnología RNAi. El efecto de las mutaciones en las proteínas virales en el ciclo de vida del virus también puede ser estudiada, aunque hay que tener en cuenta que mientras VP40, GP 1,2, y VP24 se expresan después de la transcripción viral, la expresión de las otras proteínas virales se logra a partir de la expresión plásmidos, de modo que los efectos debidos a la sobreexpresión de estas proteínas tienen que ser tomadas en cuenta. Además, se debe tener cuidado que las mutaciones en el minigenoma no alteran significativamente la longitud de la minigenoma, ya que la actividad del indicador se ve directamente afectado por la longitud del minigenoma 15. Por último, desde minigenomas tetracistronic son análogos del genoma viral que llevan genes virales, y se replican por el complejo de la polimerasa viral, debe también ser posible estudiar la evolución de estos genes en respuesta a las mutaciones en condiciones BSL2. Así, mientras que todavía se necesitan más estudios en esta dirección, debe ser posible, por ejemplo, para introducir subóptimamutaciones en los genes dentro de las minigenoma y luego trVLPs paso hasta mutaciones gratuitos emergen.
Una limitación del ensayo trVLP tetracistronic que tiene que ser tenido en cuenta es el hecho de que mientras que los modelos de la mayor parte del ciclo de vida del virus, la transcripción primaria en las células diana no está modelado por este sistema, ya que las células diana tienen que expresar las proteínas de la nucleocápside en trans a fin de que los trVLPs para replicar. Si la transcripción primaria tiene que ser evaluado, es posible utilizar células diana ingenuos 10; Sin embargo, en este caso no tiene lugar la replicación del genoma en las células diana, y no hay más trVLPs infecciosas se producen, de abortar la infección. Este es un problema principal que no se puede superar sin hacer que los trVLPs completamente auto-replicante, incluyendo los genes para las proteínas de la nucleocápside en el minigenoma, lo que de hecho convertirlas en virus Ébola recombinantes infecciosas. De hecho, Ebolun virus que expresan luciferasa o otros reporteros se han generado y se puede utilizar para evaluar y estudiar la replicación del genoma y la transcripción 17,18; sin embargo, su uso está restringido a laboratorios BSL4. Además, tiene que tener en cuenta que mientras VP40, GP 1,2, y VP24 se expresa a partir de un análogo del genoma viral, su posición en el minigenoma (2 ª, 3 ª y 4 ª unidad de transcripción) no es idéntico al su posición en el genoma viral (3 ª, 4 ª, 6 ª y unidad de transcripción), que podría influir en sus niveles de expresión absolutos, así como sus niveles de expresión relativa con respecto a la otra.
En general, el ensayo trVLP tetracistronic representa el sistema más completo de modelado del ciclo de vida de los virus Ébola disponibles hasta la fecha, y permite el modelado de la replicación del genoma y transcripción, la morfogénesis y la gemación de partículas, así como el apego y entratar en las células diana a través de múltiples ciclos infecciosas. Como tal, tiene un enorme potencial para su uso en la investigación de la biología de los virus Ébola en condiciones BSL2.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores están muy agradecidos a Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), que actuaba como narradora, así como Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) y Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) para su ayuda en hacer la película que acompaña a este manuscrito. Además, nos gustaría dar las gracias a Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) para la lectura crítica del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
- Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
- Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
- Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H.
- Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
- Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. Enna, S. J. , (2010).
- Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
- Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
- Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
- Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
- Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
- Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
- Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
- Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
- Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
- Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
- Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
- Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
- Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).
