Summary
Travailler avec des virus infectieux Ebola est limitée à niveau de biosécurité 4 laboratoires. Tetracistronic réplication et de transcription virus compétent comme des particules contenant minigénome-(trVLPs) représentent un système de modélisation du cycle de vie qui nous permet de modéliser en toute sécurité plusieurs cycles infectieux sous le niveau de biosécurité 2 conditions, en s'appuyant exclusivement sur Ebola composants du virus.
Abstract
Virus Ebola causent de graves fièvres hémorragiques chez les humains et les primates non humains, avec des taux de létalité plus élevé que 90%. Il n'existe aucun vaccin approuvé ou des traitements spécifiques pour la maladie causée par ces virus, et de travailler avec des virus infectieux Ebola est limitée à niveau de biosécurité 4 laboratoires, ce qui limite considérablement la recherche sur ces virus. systèmes de modélisation du cycle de vie du modèle du cycle de vie du virus sous le niveau de biosécurité 2 conditions; Cependant, jusqu'à récemment, de tels systèmes ont été limitées soit à des aspects particuliers du cycle de vie du virus, ou un seul cycle infectieux. Minigénomes Tetracistronic, qui comprennent les régions de virus Ebola non codantes, un gène rapporteur, et trois gènes du virus Ebola impliqués dans la morphogenèse, le bourgeonnement et l'entrée (VP40, GP 1,2, et VP24), peuvent être utilisés pour produire la réplication et de la transcription particules -competent pseudo-virales (trVLPs) contenant ces minigénomes. Ces trVLPs peuvent continuellement infecter les cellules exprimant le virus Ebolaprotéines responsables de la réplication du génome et la transcription, ce qui nous permet de modéliser en toute sécurité plusieurs cycles infectieux sous le niveau de biosécurité 2 conditions virus. Fait important, les composants viraux de ces systèmes sont exclusivement dérivées de virus Ebola et pas d'autres virus (comme c'est par exemple le cas dans les systèmes utilisant des virus pseudotypés), et VP40, VP24 et 1,2 GP ne sont pas surexprimé dans ce système Il est donc idéalement adapté pour l'étude de la morphogenèse, le bourgeonnement et l'entrée, bien que d'autres aspects du cycle de vie du virus telles que la réplication du génome et la transcription peuvent également être modélisés avec ce système. Par conséquent, le dosage de trVLP tetracistronic représente le système de modélisation du cycle de vie le plus complet disponible pour les virus Ebola, et dispose d'un énorme potentiel pour une utilisation dans les enquêtes sur la biologie du virus Ebola dans le futur. Ici, nous fournissons des informations détaillées sur l'utilisation de ce système, ainsi que sur les résultats attendus.
Introduction
Virus Ebola sont l'agent causal de la fièvre hémorragique sévère chez l'homme et les primates non-humains avec des taux allant jusqu'à 90% de létalité des épidémies humaines 1. Bien qu'il y ait eu des progrès significatifs au cours des dernières années dans le développement de vaccins ainsi que des traitements spécifiques (revue dans 2,3), ceux-ci ne sont pas approuvés pour la consommation humaine. Des particules de virus Ebola ont un aspect en forme de fil ayant une longueur typique d'environ 1 pm et un diamètre de 96 à 98 nm 4. Il se forme de la nucléocapside du fondamentales des particules virales et se compose de 1) la non-segmenté génome à ARN négatif de simple brin, qui code les gènes 7 de virus Ebola (Figure 1), 2) la nucléoprotéine NP, qui encapside le génome, 3 ) le complexe de polymerase virale constitué par la polymérase L et son cofacteur de VP35, et 4) l'activateur transcriptionnel VP30. En outre, il a été montré récemment que la protéine VP24 de est également associée à la nucléocapsides 4. La nucléocapside est entourée par l'espace de matrice, dans lequel la protéine VP40 de matrice, qui est responsable de la morphogenèse et le bourgeonnement de virions, est situé. Les particules virales sont ensuite enveloppés, et incorporés dans cette enveloppe est la seule protéine de surface de 1,2 GP, qui est responsable de l'attachement des virions et l'entrée.
Travailler avec des virus infectieux Ebola doit être effectué dans un laboratoire de confinement à haute sécurité sous le niveau de biosécurité (BSL) 4 conditions, ce qui limite ce travail à quelques installations dans le monde. Afin d'étudier la biologie de ces virus ou de développer de nouvelles thérapies dans des conditions BSL2, les chercheurs s'appuient soit sur la surexpression recombinante de protéines du virus Ebola, ou sur des systèmes de modélisation du cycle de vie, qui peuvent tous deux être travaillé avec l'absence de virus infectieux Ebola. L'expression recombinante de protéines du virus Ebola est soit réalisée à partir des plasmides d'expression ou des vecteurs viraux. Un cas particulier de cette stratégie est laproduction de virions ou des particules de type viral basé sur les virus autres que le virus Ebola (rétrovirus ou le plus souvent le virus de la stomatite vésiculaire), en présence de 1,2 GP exprimée par recombinaison, conduisant à la génération de particules de pseudotypés, qui peut être utilisé pour étudier l' processus d'entrée des filovirus et écran pour les inhibiteurs d'entrée 5. Alternativement, les virus recombinants (par exemple, le virus de la stomatite vésiculaire) qui codent pour le virus Ebola GP 1,2 au lieu de leur propre glycoprotéine peuvent être générés et utilisés pour étudier l'entrée du virus sous le niveau de biosécurité 2 conditions 6.
Les systèmes de modélisation du cycle de vie sont des formes de systèmes de génétique inverse comportant l'utilisation d'analogues tronqués du génome du virus Ebola (les minigénomes), qui sont initialement produites à partir d'ADNc et ensuite répliqués et transcrits par les protéines du virus Ebola fournies en trans. Le premier système de minigénome pour le virus Ebola a été développé il ya plus de 15 ans 7, Et a depuis été utilisée pour étudier la replication du génome du virus Ebola et la transcription (revue dans 8,9). Dans ce système, un minigénome monocistronique constitué par un gène rapporteur unique flanquée des régions terminales non codantes du génome du virus Ebola (appelée la tête et de queue) (Figure 1) est exprimé dans des cellules de mammifères (en général par transcription utilisant l'ARN polymerase de T7) avec les protéines virales L, VP35, VP30 et NP. Le minigénome est encapsidé par NP, et ensuite répliqué et transcrit par les autres protéines de la nucléocapside à l'aide de signaux agissant en cis localisées dans la tête et de queue, ce qui conduit à une activité de journaliste qui reflète ces deux aspects du cycle de vie du virus (figure 2).
Afin de modéliser des étapes supplémentaires du cycle de vie viral, la transcription et la réplication compétente particules de type viral (trVLP) systèmes ont été développés, qui sont fondées sur les systèmes de minigénome classiques, mais en vedette la uneexpression supplémen taires des autres protéines virales VP24, VP40 et GP 1,2 à partir de plasmides d'expression 10,11. La présence de VP40 conduit à la formation de trVLPs, 1,2 GP qui portent sur leur surface, et effectuer une nucléocapside contenant minigénome-à l'intérieur. Ces trVLPs peuvent être utilisés pour infecter des cellules cibles, qui ont été soit pretransfected avec des plasmides d'expression pour L, VP35, VP30 et NP, pour faciliter la replication et la transcription de minigénomes introduits dans les cellules cibles à l'intérieur de trVLPs 11, ou des cellules cibles naïves (c'est sans expression induite par le plasmide de protéines du virus Ebola) 10. Il en résulte une activité de rapporteur dans des cellules cibles, ce qui reflète la réplication des minigénomes dans les cellules productrices, la morphogénèse et le bourgeonnement de trVLPs, leur entrée dans les cellules cibles, et 1) dans le cas de cellules cibles pretransfected génome également la réplication et la transcription secondaire ( c'est à dire des protéines par transcription virale produced dans les cellules cibles) dans des cellules cibles, ou 2) dans le cas de cellules cibles naïves également transcription primaire (c'est à dire la transcription par les protéines virales introduites dans des cellules cibles à l'intérieur de trVLPs) (figure 3). Surtout, ces systèmes n'ont été utilisés pour modéliser un cycle infectieux unique, et de compter sur la surexpression de toutes les protéines virales, qui dans le cas de VP24 et VP40 est particulièrement problématique, car il a été démontré ces protéines d'être solides régulateurs négatifs de la réplication du génome et transcription lorsqu'elle est surexprimée à partir de plasmides 12,13. En outre, les préparations trVLP produites dans ces systèmes contiennent une forte proportion de particules non infectieuses, qui pose des problèmes pour l'analyse biochimique de trVLPs infectieuses 14.
Afin de surmonter ces problèmes, nous avons récemment développé un système de minigénome tetracistronic que, en plus d'un gène rapporteur, contient également les gènes codant pour VP40, GP 1,2 etVP24 (figure 1). Comme pour le système de minigénome monocistronique classique, ce système conduit à la production de trVLPs qui peuvent infecter des cellules cibles (figure 4) 15. Cependant, contrairement au système de minigénome classique, VP40, 1,2 GP, et VP24 sont produites après la transcription du génome viral plutôt que d'être surexprimé à partir de plasmides. Par conséquent, la cinétique et les niveaux d'expression de ces protéines imitent beaucoup plus proches de celles trouvées lors du cycle de vie viral, et par conséquent le rapport des infectieuse à trVLPs non infectieux est augmenté d'environ 500 fois dans 15 ce système. En outre, l'utilisation de ce système, il a été possible de passage en continu des trVLPs contenant de minigénome-tetracistronic, la modélisation des cycles multiples infectieuses. En tant que tel, trVLPs tetracistronic sont actuellement le système de modélisation du cycle de vie le plus complet disponible pour étudier la biologie à virus Ebola dans des conditions BSL2. Ici, nous fournissons des informations détaillées sur l'utilisation of ce système, ainsi que sur les résultats attendus.
Protocol
1 Fractionnement des cellules productrices de production initiale de trVLPs
- Retirez milieu à partir de 80-90% de confluence 293 cellules cultivées en flacons de 75 cm2 à moyen-élevé de glucose de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, et 1x stylo / angine (DMEM10 ). Laver les cellules deux fois avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), en faisant attention de ne pas déloger les cellules, et ajouter 2 ml de trypsine-EDTA pour les cellules.
- Incuber les cellules à température ambiante jusqu'à ce que les cellules montrent un arrondissement important quand on l'observe sous un microscope (environ 30 secondes). Déloger les cellules en tapant ballon, et ajouter 8 ml DMEM10. Remettre en suspension les cellules à fond par un léger pipetage de haut en bas jusqu'à une suspension cellulaire unique est observé lorsqu'on les observe au microscope.
- Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé. Diluer les cellules de 2 x 10 5 cellules par ml dans DMEM10. Introduire à la pipette 2 ml de suspension cellulaire par puits dans des plaques 6 puits (4 x 105 cellules par puits).
- Incuber les plaques dans un incubateur humidifié de culture de tissu à 37 ° C avec 5% de CO 2.
2. transfection des cellules de producteurs pour la production initiale de trVLPs
- 24 heures après le fractionnement des cellules (voir figure 5 pour un aperçu du calendrier de l'expérience), l'ADN plasmidique pipette 15 (pour des montants voir le tableau 1) dans un stérile de 2 ml cryovial l'aide des conseils filtrés. Ajouter 100 ul OptiMEM par puits à l'ADN. Vortex le mélange brièvement et doucement centrifuger les tubes à l'aide d'une micro-centrifugeuse. Si plusieurs puits doivent être transfectées avec des plasmides identiques, un mélange maître à plusieurs puits peut être faite.
- Vortex brièvement le flacon avec Transit LT1 avant utilisation. Ajouter 7,5 ul Transit LT1 par puits à l'ADN dilué. Vortex doucement le mélange en prenant soin de ne pas recueillir le liquide dans le couvercle de la cryovial, et incuber pendant 15 min à température ambiante.
- Mélanger délicatement la transfectioncomplexe par pipetage de haut en bas. Ajouter 100 ul de complexes de transfection goutte à goutte dans chaque puits. Basculez la plaque avant / arrière et de gauche à droite afin de répartir les complexes de transfection. Ne pas agiter la plaque car cela provoquerait inégale diffusion des complexes de transfection.
- Remettre les cellules dans l'incubateur.
- Après 24 heures, retirer le surnageant de cellules. Ajouter 4 ml de DMEM avec 5% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 x pen / strep (DMEM5) aux cellules. Cette étape peut être effectuée pendant un maximum de 3 puits à la fois sans séchage des puits, en supposant que les puits contiennent des échantillons identiques (sinon, en raison de la nature d'auto-amplification des trVLPs dans ce système, la contamination croisée peut devenir un problème, et Cette étape doit être effectuée une bien à la fois).
- Remettre les cellules dans l'incubateur.
3 Préparation des cellules cibles
- Divisez 293 cellules comme décrit dans la section 1, l'ensemencement 4 x 10 5 cellules dans 2 ml DMEM10 par puits d'unePlaque de 6 puits.
- 24 heures après la séparation des cellules cibles et 24 heures avant l'infection, les cellules cibles de transfection comme décrit dans la section 2 en utilisant l'ADN des montants dans le tableau 1, et 4,5 ul Transit LT1 par puits.
4. infection des cellules cibles et la récolte de cellules productrices
- Transférer les surnageants des cellules productrices de tubes de 15 ml. Retirez et jetez tout surnageant restant en utilisant un tuyau d'aspiration. Ajouter 250 ul de tampon de lyse pour les cellules Glo.
- Centrifuger le surnageant pendant 5 min à 800 x g et à température ambiante pour effacer les échantillons de débris cellulaires.
- Eliminer le surnageant d'un puits de cellules cibles. Ajouter avec précaution 3 ml de surnageant de cellules autorisé, la production de cellules cibles à l'aide de la pipette de la vitesse la plus lente. Éviter pipetage directement sur les cellules afin d'éviter de perturber la monocouche cellulaire. Cette étape doit être effectuée une à la fois et.
- Lorsque tous les échantillons ont été transpréféré, le rendement des cellules cibles de l'incubateur pour permettre la sédimentation de trVLPs et l'infection des cellules cibles.
- Après 15 min d'incubation à température ambiante dans le tampon de lyse Glo, remettre en suspension les cellules productrices dans le tampon de lyse à l'aide d'une micropipette réglée sur 150 pi, et transférer l'échantillon dans un tube cryogénique 2 ml. À ce stade, les lysats peuvent être congelés à -80 ° C, ou directement mesurées comme décrit dans la section 6.
- 24 h après l'infection, retirer le surnageant des cellules cibles. Ajouter 4 ml DMEM5 par puits pour les cellules. Cette étape peut se faire jusqu'à trois puits à la fois, si les puits contiennent des échantillons identiques (sinon, en raison de la nature de l'auto-amplification des trVLPs dans ce système, la contamination croisée peut devenir un problème, et cette étape devrait être fait un bien à un moment).
5. récolte de cellules cibles pour un cycle infection unique
- Si seulement un seul cycle infectieux doit être évalué, à 72 heures après l'infection supprimer til surnageant des cellules cibles en utilisant un tuyau d'aspiration.
- Récolter les cellules dans 250 pi de tampon de lyse Glo comme décrit dans la section 4 pour les cellules productrices.
6. récolte de cellules cibles et passages continus de trVLPs
- Si trVLPs doivent être en permanence à des passages, préparer une nouvelle série de cellules cibles, comme décrit dans l'article 3 de sorte qu'ils sont prêts pour l'infection 72 heures après l'infection de la première série de cellules cibles (voir figure 5).
- Infecter le nouvel ensemble de cellules cibles comme décrit dans la section 4 (en utilisant le premier ensemble de cellules cibles à la place des cellules productrices).
- Répétez ces étapes chaque 72 heures.
7 Analyse de Reporter activité
- Si les lysats de cellules ont été congelées, les décongeler à température ambiante. Veiller à ce que les échantillons ont atteint la température ambiante avant la mesure.
- Décongeler la quantité requise (40 ul par échantillon) de tampon d'essai de Renilla Glo (i idéalement congelésn aliquotes) à température ambiante. Assurez-vous que le tampon ait atteint la température ambiante avant la mesure.
- Ajouter 1/100 ème volume de substrat de Renilla Glo au tampon d'essai pour obtenir Renilla Glo Glo réactif Renilla, et mélanger au vortex. Introduire à la pipette 40 ul de réactif de Renilla Glo dans une plaque à 96 puits blanche.
- Ajouter 40 ul d'échantillon au réactif Renilla-Glo. Attendez 10 minutes, puis de mesurer les échantillons dans un luminomètre en utilisant un temps d'intégration de 1 sec.
Representative Results
La transfection de 293 cellules productrices avec les plasmides d'expression codant pour le virus Ebola protéines de la nucléocapside NP, VP35, VP30, et L, un minigénome tetracistronic et les résultats de la polymérase accessoire T7 dans minigénome la réplication et de la transcription et l'activité du rapporteur qui est facilement détectable à 72 h (Figure 6 ). Fait important, l'activité du rapporteur observé (10 5,6 unités relatives de luminescence (RLU)) est supérieure à celle d'un témoin négatif dans lequel le plasmide d'expression codant pour L a été omis de la transfection (10 RLU 3) de plus de 2 logs. Le faible niveau de l'activité observée même en l'absence de L est probablement dû à un promoteur cryptique dans le plasmide minigénome. Les cellules cibles infectées par le trVLPs partir du surnageant de cellules productrices présentent en fait quelque peu augmenté les niveaux de l'activité du rapporteur en comparaison à des cellules productrices, et peut atteindre des valeurs entre 10 6 et 10 7 RLU en fonction du passage. En revanche, avecorsque le surnageant de cellules productrices de contrôle -L est soumis à des passages sur des cellules cibles (exprimant toute protéine de nucléocapside, y compris L), l'activité du rapporteur ne dépasse pas le bruit du luminomètre (environ 10 2 ULR) de fond.
Le test de trVLP tetracistronic peut être utilisée pour étudier le cycle de vie des virus Ebola. Par exemple, l'infection de cellules 293 avec trVLPs est dépendante de la présence de facteurs d'attachement tels que Tim-1, 16, qui doivent être fournies en trans dans ces cellules. Par conséquent, dans un essai de trVLP tetracistronic une baisse de l'activité du rapporteur dans les cellules cibles de l'ordre de 100 fois est observée en l'absence de Tim-1 (figure 7A). Le rôle des protéines spécifiques (virales ou cellulaires) dans le cycle de vie du virus peut également être évaluée en utilisant la technologie ARNi avec cette approche. A titre d'exemple, l'ARNi médiée par la régulation de L se traduit par une baisse de l'activité de reporter d'environ 100 fois, ce qui reflète le rôle central de L dansla réplication et de la transcription (Figure 7B) 7. En outre, il est possible de manipuler directement le minigénome d'évaluer l'effet de mutations sur le cycle de vie du virus. Par exemple, quand VP24-expression de la minigénome est aboli par l'introduction de trois codons stop immédiatement en aval du codon d'initiation, l'activité du rapporteur dans les cellules de producteurs n'est pas radicalement changé; Toutefois, l'activité du rapporteur dans les cellules cibles est réduite d'environ 20 fois au bout d'un passage, et 400 fois après deux passages, ce qui indique un rôle de VP24 dans la production de trVLPs infectieux (figure 7C) 15.
Figure 1: Structure du génome du virus Ebola ainsi que minigénomes monocistroniques et tetracistronic. Régions de la protéine du virus Ebola de codage sont indiqués en rouge (NP,VP35, VP30, et L), jaune (VP40 et VP24) ou bleu (GP) 1,2 boîtes. Régions non codantes (NCR) sont indiquées en vert, avec les régions de tête et de queue indiqués. L'indice indique NCR virale qui a été utilisée pour joindre les régions codantes. La région codant pour le journaliste (rep) est représentée en violet.
Figure 2 monocistronique de dosage de minigénome. Cellules sont transfectées avec des plasmides d'expression pour les protéines de la nucléocapside du virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigénome monocistronique (mg) et de la polymerase de T7. Le minigénome est d'abord transcrit par la polymérase de T7 (a) dans un ARN minigénome unencapsidated dans la même orientation que le génome viral (ARNv), qui est ensuite encapsidé par NP (b). Cette encapsidé ARNv est répliqué par un ARN minigénome complémentaire (ARNc) intermédiaire (c), puis transcrit en ARNm rapporteurs (d) qui sont traduits en protéine rapporteur (e).
Figure 3 trVLP essai avec un minigénome monocistronique. Cellules sont transfectées avec des plasmides d'expression pour les composants de dosage de minigénome (les Ebola nucléocapside du virus de protéines NP, VP35, VP30, L, un minigénome monocistronique et la polymerase de T7) ainsi que VP40, GP 1 , 2 et VP24. Cela conduit à la formation de trVLPs qui incorporent nucléocapsides contenant minigénome-(f). Ces trVLPs peuvent ensuite infecter des cellules cibles (g), qui sont soit pretransfected avec des plasmides d'expression de NP, VP35, VP30, et L (en haut), ce qui entraîne la réplication et la transcription secondaire (d) conduisant à l'expression du rapporteur (e), ou naïf les cellules cibles (en bas), ce qui entraîne la transcription de la première minigenomes (h), ce qui conduit également à l'expression d'auteur (e).
Figure 4 trVLP essai avec un minigénome tetracistronic. Cellules sont transfectées avec des plasmides d'expression pour les protéines de la nucléocapside du virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigénome tetracistronic (mg) et de la polymerase de T7. Transcription initiale (a), l'encapsidation (b), la replication du génome (c) et de la transcription (d) ainsi que la traduction (e) se produisent comme dans un dosage de minigénome monocistronique. Cependant, en plus de l'ARNm rapporteur, les ARNm pour VP40, VP24 et 1,2 GP sont également transcrit à partir du minigénome tetracistronic, conduisant à la formation de trVLPs (f). Ces trVLPs infecter les cellules cibles qui ont été pretransfected avec des plasmides d'expression pour les protéines de la nucléocapside NP, VP35, VP30 et L, ainsi que le virus Ebola cellulairefacteur d'attachement Tim-1, ce qui entraîne la réplication du génome, et la transcription et la production de trVLPs qui peuvent être utilisés pour infecter des cellules cibles frais.
Figure 5 Délai d'un essai de trVLP tetracistronic pour 3 passages consécutifs. Les jours pour les cellules d'ensemencement (s), la transfection de cellules (T), l'infection des cellules (i), le changement moyen (c) et la récolte des cellules et trVLPs (h) sont indiqué pour trois passages consécutifs (indiqué par les flèches).
Figure 6: niveaux typiques de l'activité du rapporteur observé dans un essai de trVLP tetracistronic. Un dosage de trVLP tetracistronic a été réalisée sur cinq passages suivant la protocol décrit dans ce manuscrit. Comme contrôle négatif, le plasmide d'expression codant pour L a été omis (-L) à partir de la transfection de cellules productrices de p0. Les cellules cibles dans les passages P1 à P5 ont été transfectées avec des plasmides d'expression pour les protéines de la nucléocapside, y compris L. Le bruit de fond de la luminomètre est indiqué par une ligne en pointillés. Des moyens et les écarts types de 4 répétitions biologiques à partir de 3 expériences indépendantes sont présentés.
Figure 7 Évaluation de l'impact de divers facteurs viraux et cellulaires sur le cycle de vie viral en utilisant trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 en tant que facteur d'attachement. Cellules cibles qui ont été pretransfected avec des plasmides d'expression codant pour les protéines de la nucléocapside et avec ou sans un plasmide codant pour Tim-1 (décrit dans 15) ont été infectées avec tettrVLPs racistronic. Après l'infection l'activité du rapporteur de 72 heures dans des cellules cibles a été déterminée p1. Moyennes et écarts types de 4 répétitions biologiques à partir de 4 expériences indépendantes sont présentés. (B) Effet de l'ARNi knockdown de L sur la réplication du génome et de la transcription. Cellules cibles qui ont été pretransfected avec des plasmides d'expression pour les composants de la nucléocapside, Tim-1 et miARN dirigés contre L (anti-L) ou une protéine non apparentée (anti-GFP) (décrit dans 15) ont été infectées par trVLPs tetracistronic. Après l'infection l'activité du rapporteur de 72 heures dans des cellules cibles a été déterminée p1. Moyens et les écarts-types de 5 répétitions biologiques à partir de 2 expériences indépendantes sont présentés. (C) Effet de mutations dans le minigénome sur trVLP infectieux. Un essai de trVLP tetracistronic a été réalisée en utilisant soit un minigénome de type sauvage (4cis-WT) ou un minigénome dans dont trois codons d'arrêt ont été introduites immédiatement après le codon d'initiation de VP24, la suppression de l'expression of cette protéine mais en introduisant des changements minimes au minigénome en ce qui concerne la longueur, la composition de l'acide nucléique, des structures secondaires, etc activité de journaliste dans P0, P1 et P2 a été mesurée 72 heures après transfection / infection. Moyens et écarts-types de 3 répétitions biologiques à partir de 3 expériences indépendantes sont présentés.
| Les cellules de producteurs (p0) | Les cellules cibles (p1 et plus) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| 1000 | 1000 | |
| p4cis-ARNv Rluc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-tim1 | - | 250 |
Le tableau 1 représente l'ADN pour la transfection. La quantité requise de chaque plasmide pour la transfection des cellules cibles et la production est représentée en ng par puits d'une plaque à 6 puits. Tous les plasmides sont décrits dans 15 Watt et al.
Discussion
Le test de trVLP tetracistronic décrit dans ce manuscrit permet de modéliser le cycle de vie du virus Ebola sur plusieurs cycles infectieux. Surtout, les trVLPs produites dans ce système ne contiennent pas l'information génétique pour les protéines de la nucléocapside NP, VP35, VP30, et L, qui, ensemble, constituent près de 60% du génome du virus Ebola et qui sont essentielles à la réplication virale. Au contraire, ces protéines doivent être fournis dans les cellules cibles en trans à partir de plasmides d'expression, et une infection de cellules n'exprimant pas tous quatre de ces protéines est avortée. Surtout, il n'existe aucune preuve de recombinaison génétique pour les filovirus, et il n'y a pas de régions homologues partagées entre le minigénome tetracistronic et les plasmides d'expression pour les protéines de la nucléocapside. Par conséquent, il n'est ni pratique, ni aucune preuve de tout fondement théorique qui pourrait prévoir la possibilité de générer des virus Ebola pleine longueur génomes qui pourraient alors entraîner potentiellementla production de virus infectieux Ebola, ce qui rend ce système sûr pour une utilisation dans des conditions BSL2.
Il existe deux étapes critiques de l'essai de trVLP tetracistronic qui sont influencées par des conditions expérimentales, à savoir la production de trVLPs, et l'infection de cellules cibles avec ces trVLPs. Production de trVLPs dépend des niveaux élevés de replication et la transcription minigénome, qui à son tour dépend de l'efficacité de transfection élevée. L'efficacité de transfection peut être facilement évaluée par un contrôle dont -L, dans laquelle le plasmide d'expression L est échangé contre un plasmide d'expression codant pour eGFP. taux de transfection dans ces conditions devraient dépasser 50% par l'inspection avec un microscope à fluorescence 24 heures après transfection. En outre, les cellules doivent être exemptes de mycoplasmes, puisque dans notre contamination par des mycoplasmes expérience altère considérablement la réplication et la transcription minigénome (données non publiées). Grâce à leur haute transfectabilité 293 CElls sont la lignée cellulaire de choix pour des essais de trVLP; cependant, ces cellules sont relativement peu sensibles (quoique pas complètement de réfraction) de l'infection par le virus Ebola 16. Expression d'un facteur d'attachement tels que Tim-1 améliore l'infection de cellules 293 avec trVLPs environ 100 fois, et est crucial pour le succès de ce système sur plusieurs passages.
Alors que trVLPs tetracistronic ne sont pas auto-réplication sur leur propre, ils sont auto-réplication dans les cellules qui expriment les protéines de la nucléocapside. En tant que tel, des précautions doivent être prises pour éviter la contamination croisée entre les puits contenant différentes trVLPs (par exemple, avec différentes mutations dans le minigénome). Du point de vue technique plus, en raison de la grande différence entre les signaux positifs et négatifs dans cet essai (environ 4 log), la diaphonie entre les échantillons lors de la mesure de l'activité de luciférase peut être un problème; cependant, ceci peut être facilement évité en laissant ainsi un vide entre chaque échantillon dans l'Plaque de 96 puits utilisée pour mesurer l'activité luciférase.
Il ya une multitude d'applications possibles pour trVLPs tetracistronic. De toute évidence, ils sont bien adaptés à l'étude de l'entrée de particules de filovirus, depuis trVLPs infectieuses ont la structure typique en forme de fil de filovirus infectieuses 14, et contiennent les mêmes composants viraux que des particules de filovirus. Surtout, ils ne contiennent pas de composants d'autres virus, comme c'est le cas pour l'utilisation de virions pseudotypés ou de particules analogues à des virus, telles que des particules de type retrovirus portant GP 1,2, ou de virus recombinants, tels que le virus de la stomatite vésiculeuse recombinant exprimant GP 1,2 . L'obligation pour les facteurs de fixation lors de l'utilisation des cellules 293 en tant que cellules cibles dans ce système peut être exploité pour dépister et étudier le rôle de ces facteurs d'attachement, tandis que le rôle des autres facteurs cellulaires, tels que ceux impliqués dans la réplication du génome et de la transcription, ainsi que morphogenèse et bourgeonding, peut être étudiée en utilisant la technologie ARNi. L'effet de mutations dans les protéines virales sur le cycle de vie du virus peut également être étudié, mais il faut garder à l'esprit que, bien que VP40, GP 1,2, et VP24 sont exprimés après la transcription virale, l'expression des autres protéines virales est réalisée à partir de l'expression plasmides, de sorte que les effets dus à la surexpression de ces protéines doivent être prises en compte. En outre, il faut veiller à ce que des mutations dans le minigénome ne modifient pas de façon significative la durée de la minigénome, puisque l'activité de journaliste est directement affectée par minigénome longueur 15. Enfin, depuis minigénomes tetracistronic sont analogues du génome viral qui portent des gènes viraux, et sont reproduits par le complexe de polymerase virale, il devrait également être possible d'étudier l'évolution de ces gènes en réponse à des mutations dans des conditions de BSL2. Ainsi, alors que d'autres études sont encore nécessaires dans cette direction, il doit être possible, par exemple, à introduire sous-optimalemutations dans les gènes dans les minigénome puis trVLPs de passage jusqu'à ce que des mutations gratuits émergent.
L'une des limites du test de trVLP tetracistronic qui doit être gardé à l'esprit le fait que, s'il modèles plus du cycle de vie du virus, de la transcription primaire de cellules cibles n'est pas modélisé par ce système, puisque les cellules cibles doivent exprimer les protéines de la nucléocapside de trans pour que les trVLPs à répliquer. Si la transcription primaire doit être évalué, il est possible d'utiliser des cellules cibles naïves 10; Toutefois, dans ce cas, aucune réplication du génome a lieu dans les cellules cibles, et aucun autre trVLPs infectieuses sont produites, avorter l'infection. C'est un problème capital qui ne peut être surmontée sans rendre les trVLPs complètement auto-réplication, y compris par les gènes pour les protéines de la nucléocapside dans le minigénome, ce qui de facto les transformer en virus Ebola recombinants infectieux. En fait, Ebolun virus exprimant la luciférase ou d'autres journalistes ont été générées et peuvent être utilisés pour évaluer et étudier la réplication du génome et la transcription 17,18; cependant, leur utilisation est restreinte à des laboratoires de BSL4. En outre, il doit être gardé à l'esprit que, bien que VP40, GP 1,2, et VP24 sont exprimés à partir d'un analogue du génome viral, leur position dans la minigénome (2 ème, 3 ème et 4 ème unité de transcription) n'est pas identique à leur position dans le génome viral (3 ème, 4 ème et 6 ème unité de transcription), ce qui pourrait influencer leur taux d'expression absolu, ainsi que leurs niveaux d'expression relatifs par rapport à l'autre.
Dans l'ensemble, l'analyse de trVLP tetracistronic représente le système de modélisation du cycle de vie le plus complet pour les virus Ebola disponibles à ce jour, et permet la modélisation de la réplication du génome et la transcription, la morphogenèse des particules et en herbe, ainsi que l'attachement et enessayer dans les cellules cibles sur plusieurs cycles infectieux. En tant que tel, il a un énorme potentiel pour une utilisation dans les enquêtes sur la biologie du virus Ebola dans des conditions BSL2.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs sont très reconnaissants à Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), qui a agi en tant que narrateur, ainsi que Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) et Megan Morgan (Département de la santé, ORS, OD, NIH) pour leur aide à faire le film qui accompagne ce manuscrit. En outre, nous tenons à remercier Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) pour la lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, le NIAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 75 cm2 Cell culture flask | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | preheat to 37 °C prior to use |
| FBS | Life Technologies | 26140-079 | heat inactivate 30 min @ 56 °C |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| PBS | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O add 1 L; autoclave and store at room temperature | ||
| 6-well Plates | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 | |
| Glo lysis buffer | Promega | E2661 | |
| Renilla Glo luciferase assay system | Promega | E2720 | |
| 96-well Assay plate (white) | Costar | 3912 | |
| Modulus microplate luminometer | Turner Microsystems | 998-9300 |
References
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