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Medicine

Axotomía nervio facial en ratones: un modelo para estudiar las motoneuronas respuesta a la lesión

doi: 10.3791/52382 Published: February 23, 2015

Abstract

El objetivo de este protocolo quirúrgico es exponer el nervio facial, que inerva la musculatura facial, a su salida del foramen estilomastoideo y cortado o aplastarlo para inducir la lesión del nervio periférico. Ventajas de esta cirugía son su simplicidad, alta reproducibilidad, y la falta de efecto en las funciones vitales o la movilidad de la parálisis facial posterior, lo que resulta en un resultado quirúrgico relativamente leve en comparación con otros modelos de lesión del nervio. Una ventaja importante de utilizar un modelo de lesión del nervio craneal es que las motoneuronas residen en una población relativamente homogénea en el núcleo motor facial en la protuberancia, simplificando el estudio de los cuerpos celulares de las motoneuronas. Debido a la naturaleza simétrica de la inervación del nervio facial y la falta de diafonía entre los núcleos motores faciales, la operación se puede realizar de manera unilateral con el lado unaxotomized que sirve como un control interno emparejado. Una variedad de análisis se puede realizar después de la operación de asnoss la respuesta fisiológica, los detalles de los cuales están más allá del alcance de este artículo. Por ejemplo, la recuperación de la función muscular puede servir como un marcador de comportamiento para la reinervación, o las motoneuronas puede ser cuantificado para medir la supervivencia celular. Además, las neuronas motoras se pueden capturar con precisión utilizando microdisección por láser para el análisis molecular. Debido a que la axotomía del nervio facial es mínimamente invasiva y bien tolerada, puede ser utilizado en una amplia variedad de ratones modificados genéticamente. Además, este modelo de la cirugía puede ser utilizado para analizar la eficacia de los tratamientos de lesión del nervio periférico. Lesión del nervio facial proporciona un medio para investigar no sólo las motoneuronas, sino también las respuestas del microambiente central y periférico glial, el sistema inmunológico, y la musculatura de destino. El modelo de lesión del nervio facial es un modelo de lesión de nervio periférico ampliamente aceptado que sirve como una poderosa herramienta para el estudio de la lesión del nervio y la regeneración.

Introduction

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Existen muchos modelos de lesión del nervio periférico, pero uno que se destaca por el estudio de las motoneuronas es el modelo de axotomía del nervio facial. El nervio facial, también conocido como nervio craneal VII, se origina en la protuberancia y inerva los músculos de la expresión facial 1,2. En este protocolo quirúrgico, el nervio facial está expuesto en su salida del foramen estilomastoideo y ya sea corta o se tritura. La gravedad de la lesión del nervio puede clasificarse siguiendo las Sunderland 3 clasificaciones, que diferencia el daño basada en la integridad de los axones, endoneuro, perineuro y epineurio, que son capas de tejido conectivo que secuencialmente se envuelven alrededor de los haces de axones. En la lesión por aplastamiento (axonotmesis), los axones se cortan, pero el perineuro y epineurio se conservan. Recuperación funcional completa de aplastamiento del nervio facial se produce en alrededor de 11 días debido a que la vaina del nervio intacto sirve como un conducto en el que los axones vuelven a crecer 4,5. Porotro lado, en la lesión de corte (neurotmesis), los axones y las 3 capas de tejido conectivo se separó, y todo el nervio distal debe volver a crecer para restaurar la inervación musculatura. Reconexión quirúrgica de la epineurio se realiza a menudo en pacientes humanos con lesiones de la transección del nervio, sin embargo los resultados de la recuperación rara vez son óptimas. Se requieren más estudios para comprender por qué el nervio no puede volver a crecer a su objetivo y qué terapias se puede emplear para mejorar y acelerar el proceso de regeneración.

Hay muchas ventajas para el estudio de la lesión del nervio utilizando el modelo de axotomía del nervio facial. En primer lugar, el procedimiento axotomía del nervio facial es rápido, fácil y altamente reproducible; y la parálisis resultante de los músculos faciales no afecta a las funciones vitales y es bien tolerado por el animal. Debido a que este es un modelo de lesión del nervio craneal, el estudio de los cuerpos celulares de las neuronas motoras se simplifica porque las motoneuronas residen en una población relativamente homogénea en ªe núcleo motor facial en la protuberancia. La población se diferencia en base al patrón subnuclear dentro del núcleo motor facial, ya que hay siete subnúcleos cada uno específico para que inervan un grupo específico de músculos, por lo que las diferencias subnucleares en respuesta a axotomía puede afectar los resultados de 2,6,7.

Una ventaja importante del modelo de lesión del nervio facial es que el lado unaxotomized puede servir como un control interno emparejado porque la inervación del nervio es altamente simétrica y no hay diafonía entre los núcleos motores faciales 8. Otra ventaja de utilizar este método quirúrgico es la falta de un traumatismo directo al SNC o la interrupción de la barrera hematoencefálica 9. Las complicaciones como sangrado excesivo y la infección son raros con este procedimiento.

Una variedad de análisis se puede realizar para evaluar la respuesta fisiológica a la lesión del nervio. La recuperación del reflejo del parpadeo del ojo y la actividad de la barba se puede utilizar como un comportamientomedida de 10,11 recuperación funcional. La grabación de vídeo de la actividad vibrisas es actualmente el método más poderoso para la detección de la recuperación de la inervación del nervio facial 12,13. Después de la eutanasia, el análisis histológico del tronco cerebral se puede realizar en los cuerpos celulares de las neuronas motoras en el núcleo motor facial. El núcleo motor facial se subdivide en siete subnúcleos, cada uno específico para ciertos músculos faciales, lo que permite el examen diferencial de las respuestas a la lesión 2,6. Las motoneuronas faciales pueden ser contados para cuantificar la supervivencia celular, o inmunohistoquímica pueden utilizarse para identificar biomarcadores y poblaciones de células específicas 14. El núcleo motor facial se puede microdissected con precisión utilizando captura por láser para el análisis molecular de la respuesta celular a la lesión del nervio 15,16. Impactos de la axotomía del nervio facial pueden ser analizados en la corteza motora 17,18. Además, el nervio puede ser diseccionado para estudiar la degeneración walleriana 19 oaxón de regeneración 20, y los músculos se pueden quitar para estudiar las uniones neuromusculares 21. La axotomía del nervio facial también puede ser utilizado para estudiar las células gliales centrales y periféricos que se acompañan 22, el objetivo de la musculatura 21, y el sistema inmune respuesta 23. Aunque se ha avanzado mucho en el estudio del modelo de axotomía del nervio facial 24, se requiere un mayor estudio de la lesión del nervio periférico, porque el daño nervioso es un problema importante para los pacientes y los tratamientos actuales no producen resultados óptimos. Este modelo es una poderosa herramienta para el examen de la respuesta fisiológica a la lesión del nervio y el análisis de la efectividad de las terapias de regeneración del nervio.

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Protocol

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Todos los procedimientos ejecutados son aprobados por la Escuela de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Indiana y siguen Instituto Nacional de Salud directrices.

1. Técnica quirúrgica

  1. Mantenga una técnica aséptica durante este procedimiento mediante el uso de guantes estériles, instrumentos, y un campo quirúrgico estéril de acuerdo con las directrices del NIH 25. Esterilizar las herramientas antes de comenzar la cirugía mediante autoclave (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo para la lista completa). Utilice un esterilizador de perlas de vidrio para esterilizar las herramientas durante la operación.

2. Anestesia y Preparación

  1. Anestesiar al ratón en una caja de la anestesia con una mezcla de 0,9 L / min de oxígeno y 2,5% de isoflurano usando un sistema de vaporizador de isoflurano veterinaria. Asegúrese de que el ratón no responde a los cambios en la posición del cuerpo antes de sacarlo de la caja.
  2. Aplicar pomada oftálmica al mouLos ojos de sí para protegerlos de la desecación.
  3. Cambie el flujo de gas de la caja para el cono de la nariz. Coloque el ratón en ángulo recto en su lado izquierdo en una almohadilla de cubierta climatizada con una almohadilla quirúrgica y papel absorbente banco con su nariz y la boca en el interior del cono. Monitorear continuamente el ritmo respiratorio del ratón y la velocidad y ajustar los niveles de isoflurano según sea necesario (entre 2,5-3% isoflurano) para mantener un nivel adecuado de anestesia, y usar el pellizco reflejo dedo para confirmar la sedación total.

3. Abordaje quirúrgico

  1. Alinear y centrar el estereoscopio con el campo quirúrgico. Ajuste el cono de la nariz y la cinta hacia abajo para que se coloca a lo largo del borde del campo visual.
  2. Con el ratón acostado en su lado izquierdo, con cinta adhesiva el borde de la oreja derecha al cono de nariz, la exposición del área detrás de la oreja donde se realizará la incisión. Asegúrese de que la vena auricular posterior se desplaza horizontalmente a través de la oreja. Tenga en cuenta que la colocación correcta de tque los animales y la grabación de la oreja son cruciales para encontrar rápidamente el nervio facial.
  3. Humedezca la piel en y detrás de la oreja con etanol al 70% y afeitar el sitio quirúrgico utilizando una hoja de afeitar o bisturí. Pre-humedecer la piel hace que el afeitado más fácil en esta localización anatómica.
  4. Limpiar la piel con una solución de yodo, tales como lavado quirúrgico Betadine (7,5% de povidona-yodo), seguido por etanol al 70%. Repita esta limpieza dos veces más para desinfectar a fondo el área.
  5. Para determinar dónde hacer la incisión, traza la vena auricular posterior de la oreja caudalmente a la zona posterior a la protuberancia oído. Usando tijeras de primavera, hacer una incisión de 4 mm 2 - 3 mm posterior a la protuberancia.
  6. Diseccionar a través de la grasa subcutánea y la máscara con disección roma. Evite el corte directo con las tijeras porque los vasos sanguíneos o tejido muscular podrían dañarse fácilmente.
  7. Si se produce sangrado, aplique presión en el sitio de la cirugía con un hisopo de algodón estérildurante al menos 30 seg. Si se produce la pérdida de fluido significativa, inyectar el ratón por vía intraperitoneal con hasta 0,5 ml de solución salina al 0,9% estéril usando una aguja G 25 o 27.
  8. Utilice varios hitos clave, el nervio espinal accesorio, canal auditivo, y anterior del músculo digástrico (descrito más adelante), para localizar el nervio facial. Diseccionar alrededor de estos puntos de referencia hasta que se visualizan las ramas del nervio facial. El nervio aparecerá como una estructura de sólido blanco significativa cuando se revela y una capa de fascia se adhiere a las estructuras subyacentes.
    1. Encuentra el nervio espinal accesorio, que viaja de la porción caudal del cráneo para inervar el músculo trapecio, una vez que la grasa subcutánea y la fascia se han diseccionado. El nervio facial es profundo en el nervio espinal accesorio.
    2. Encuentra el conducto auditivo cartilaginoso que se ve de color blanco nacarado y se puede ver rostral al nervio facial.
    3. Encontrar el vientre muscular del músculo digástrico anterior que se encuentra en la parte superior de y caudal al nervio facial.
  9. Cuando se visualizan las principales ramas del nervio facial, rastrearlos dorsal para encontrar su origen en el agujero estilomastoideo. Utilizando pinzas de punta fina Dumont # 5/45 para mantener el lugar de la cirugía abierta, avanzar en las puntas de las tijeras de primavera siguientes trayectoria del nervio, a continuación, mueva las pinzas dorsal para mantener el área recién abierta avanzada.
  10. Visualice el tronco del nervio facial con el cigomático, bucal, y las ramas mandibulares marginales en este punto.
    NOTA: La rama temporal se encontrará más cerca del agujero. Las ramas del nervio mandibular marginal en sus partes superior e inferior más cerca de la mandíbula, por lo tanto aquellas ramas nerviosas no serán visibles en este nivel.
    1. Si se realiza un corte transversal del nervio, estabilizar el nervio suavemente con las pinzas de punta fina y cortar el nervio con las tijeras de primavera. Evite aplicar demasiada tracción en el nervio con las pinzas para evitar avulsing el nervio del tronco cerebral. Empujarlos tocones de distancia el uno del otro, o cortar y eliminar una porción del nervio distal para asegurar que no se produzca ninguna reconexión.
    2. Si la realización de una lesión por aplastamiento, utilice Dumont # 5/45 pinzas para comprimir el nervio durante 30 segundos usando una presión constante para cortar todos los axones, repita este flechazo en un segundo ángulo perpendicular al primer sitio de aplastamiento. Evite aplicar cantidades variables de presión durante la aglomeración 30 segundos, de lo contrario el daño será inconsistente entre los animales.

4. Cierre y Recuperación

  1. Vuelva a colocar la grasa y los músculos de las estructuras subyacentes.
  2. Aproximar los bordes de la incisión y cerrar la herida usando un clip herida 7,5 mm. Las suturas o pegamento también son aceptables para el cierre de la herida. Analgésicos posquirúrgicas se pueden proporcionar en este momento.
  3. Retire la cinta de la oreja del ratón. Apague el flujo isoflurano y permitir que el ratón para respirar oxígeno puro durante 30 segundos a 1 minuto. Place el ratón en una jaula vacía, sin ropa de cama para recuperarse de la anestesia.
  4. Cuando se recupera el ratón, examine su comportamiento en busca de signos de confirmación de la parálisis facial. Los bigotes se paralizaron y en ángulo hacia la mejilla, la nariz se produce una desviación, y el ojo no parpadeará en respuesta a un soplo de aire.
  5. Animales Casa en conjunto después de la cirugía si son de sexo femenino. Evite de ratones machos de forma conjunta, ya que son más agresivos y tienden a retirar por la fuerza clips de la herida de su cagemate, lo cual lleva a la infección. Proporcionar analgésicos posquirúrgicas en este momento, si es necesario.
  6. Monitorear los ratones una vez al día durante varios días después de la operación para asegurarse de que no hay infección u otra complicación se produce después de la operación. Retire los clips de la herida 7-10 días después de la cirugía si no han caído por su propia cuenta.
  7. Aplicar lubricante pomada ocular al ojo afectado diariamente para prevenir complicaciones de la córnea, o bien hasta que el reflejo del parpadeo del ojo es recubierta o hasta la eutanasia.

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Representative Results

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Después de que se realiza el axotomía del nervio facial, pérdida de las neuronas motoras se produce como resultado de la lesión. La supervivencia de las neuronas motoras después de la lesión depende de muchas variables, como el género, la edad del animal en el momento de la cirugía, y el punto de tiempo en el cual se realizan los recuentos de neuronas motoras, y el Moran y Graeber opinión el 24 y Jinno y Yamada opinión 22 tanto resumir los datos de supervivencia de las neuronas motoras. Por lo general, alrededor del 86% de las motoneuronas sobrevivir a los 28 días después de la axotomía 14,15,26. Cinética de la pérdida de las neuronas motoras se describen en Serpe et al. 2000. Figura 1 ilustra la variación en la supervivencia de las motoneuronas en múltiples ratones modificados genéticamente. No se observan diferencias significativas en los recuentos de neuronas motoras faciales del lado de control, lo que indica que las alteraciones genéticas no afectan recuentos basales. En comparación con la supervivencia de las neuronas motoras en ratones de tipo salvaje (84% ± 2.0; Figura 1A, D), se observa la pérdida de células significativa en un modelo de ratónde la esclerosis lateral amiotrófica (SOD1 G93A; 68% ± 1; Figura 1B, E), así como la inmunodeficientes recombinación de activación de gen-2 de ratón knockout (RAG-2 - / -; 57% ± 2.5; Figura 1C, F) 27 .

La Figura 2 muestra la técnica de microdisección de captura por láser aplicada al núcleo motor facial. Todo el núcleo motor facial puede ser capturado (Figura 2A-C), o subnúcleos puede ser recogido por separado (Figura 2D-F). Para mayor precisión, las neuronas motoras pueden ser capturados de forma individual, y el restante neuropil pueden recogerse para su análisis (Figura 2G-I). La figura 3 muestra qPCR resultados del material de ARN extraído de las muestras subnucleares comparan la ventromedial y ventrolateral subnúcleos. Los cuatro genes probados, β II tubulina, crecimiento asociado proteína-43 (Gap-43), hemopoieTic y neurológico-expresó secuencia-1 (HN1), y derivado del cerebro factor neurotrófico (BDNF) están asociados con la respuesta de la regeneración nerviosa y hay diferencias interesantes entre los dos subnúcleos y sus perfiles de expresión génica después de axotomía 16.

Figura 1
Figura 1. secciones coronales representativos núcleo motor facial teñidas con tionina y cuantificados 28 días después de la transección del nervio facial. Núcleos motores faciales se muestran a partir de (A, D) WT, (B, E) SOD1 G93A, y (C, F) RAG- 2 - / - ratones (lado de control, con el lado axotomizado). Las barras de escala = 120 micras. Esta cifra se ha modificado desde el 27. Haga clic aquí para ver una versión más grande de les figura.

Figura 2
Figura 2. microdisección láser del núcleo motor facial. (A) sección teñida-tionina de núcleo axotomized facial, (B) con microdisección por láser parcial del núcleo facial axotomized, y (C) recogida de tejido láser microdissected. Una plantilla (D) de la subnúcleos se superpone a la pantalla del ordenador para identificar el ventromedial y ventrolateral subnúcleos facial para microdisección láser (E, F). Las motoneuronas faciales fueron láser microdissected basan en su morfología con un núcleo visible y nucleolo (* indica las motoneuronas, G, H), mientras que los fragmentos del cuerpo celular FMN, indicadas por las flechas (G), se láser microdissected separado y eliminados para eliminar mRNA FMN en el neuropil sejemplos. Después se recogieron todos los fragmentos de FMN y el cuerpo celular, el tejido restante fue núcleo facial láser microdissected como la muestra neuropilo (I). Las barras de escala = 100 micras. Esta cifra se ha modificado desde el 16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Pro-regeneración y pro-supervivencia mRNA expresión en el ventromedial (VM) y ventrolateral (VL) regiones subnucleares motor faciales siguientes axotomía del nervio facial. Porcentaje promedio de expresión de ARNm ± SEM en el seccionado VM y VL subnúcleos facial en relación con el subnúcleos de control no operado (AD). El curso temporal de la expresión de ARNm incluye ninguna lesión (0), 3, 7, 14, y 28 para la DPO βII tubulina (A (B), HN1 (C), y el BDNF (D). # Representa diferencias significativas de LV en comparación con VM, en p <0,05. Esta cifra se ha modificado desde el 16.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereo microscope Leica M60
Labeling tape Fisher Scientific 15-952
Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge Fine Science Tools 15003-08 Sterilize before use
Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm Fine Science Tools 11251-35 Sterilize before use
Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm Fine Science Tools 12040-01 Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth cross action wound clip applier 5" George Tiemann & Co 160-910 Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips Fine Science Tools 12029-12 Used to remove wound clip
0.9% Sodium chloride injection, USP Hospira 0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser Fisher Scientific 19-027132
70% Ethanol
Glass bead sterilizer

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References

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Olmstead, D. N., Mesnard-Hoaglin, N. A., Batka, R. J., Haulcomb, M. M., Miller, W. M., Jones, K. J. Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury. J. Vis. Exp. (96), e52382, doi:10.3791/52382 (2015).More

Olmstead, D. N., Mesnard-Hoaglin, N. A., Batka, R. J., Haulcomb, M. M., Miller, W. M., Jones, K. J. Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury. J. Vis. Exp. (96), e52382, doi:10.3791/52382 (2015).

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