Abstract
oluşumu ve (dışında glomerüllerden) böbrek kan damarlarını geliştirme perfüzyon ölçüde understudied edilir. Damar gibi reçine atmalarını, in vivo ultrason görüntüleme ve mikro-diseksiyonu olarak perfüzyon haritalama teknikleri arasındaki yakın ilişkiyi gösteren sınırlı olan, (de novo damar oluşumu) ve vaskülogenez (büyük damarların kapalı dallanma olan) anjiyogenez yoluyla geliştikçe Embriyonun içinde bu iki süreç ve gelişmekte olan böbrek yapıları. Burada, biz böbrek perfüzyonunun ontogenezini ölçmek için fare embriyoları üzerinde utero içi kardiyak ultrason rehberliğinde FITC etiketli domates lektin mikroenjeksiyon içinde prosedürü tarif. Domates lektin (TL) hasat embriyo ve böbrekler boyunca perfüze edildi. Nefron atalarıdır, nefron yapıları, üreter epiteli ve damar: dokular dahil olmak üzere çeşitli böbrek yapılar için ortak boyandı. E13.5 büyük kalibreli damarları başlayan, ancak periferik perfüze edildigemi unperfused kalmıştır. E15.5 E17.5 ve tarafından, küçük periferik damarlar yanı sıra glomerüller perfüze hale başladı. Bu deneysel teknik, embriyonik gelişim sırasında damar kan akışının rolü üzerinde çalışılması için kritik önem taşır.
Introduction
Embriyonik gelişimi sırasında iki ayrı, ama aynı anda, vasküler işlemler gerçekleşir: anjiogenezisi, süreci bir gemi konut endotel atalarıdır 1,2 den gemilerin de novo oluşumu büyük bir önceden var olan damar, ve vaskülogenez, yetişen bu sayede. Ikinci büyük ölçüde o olmadan gerçekleşmesi düşünülmektedir ise sırasıyla, eski, kan akımı ile eş anlamlıdır.
Kan damarı oluşumu eş zamanlı, böbrek progenitör hücre sentezi, çoğalması ve farklılaşması bir döngüsel ve dinamik bir süreç embriyonik gün 9.5 (E9.5) açılmak başlar. Bu noktada üreter tomurcuğu (UB) metanefrik mezenşimi (MM) çevredeki içine dorsal işgal ve Doğum 3 kadar devam eder. Hızla metanefrik kap mezenşimi yoğuşmalı içine UB dallanma tekrarlanan böbrek fonksiyonel birimleri, nefron oluşumunu başlar. UB ve nef her yeni nesilron, eski kuşaklar daha sonra öncelikle damar-yoğun ortamlarda daha olgunlaşmasını ve farklılaşmasını geçiren iç kortikal ve medüller bölgeler, içine yerinden edilir. Dressler ve ark. 3 ile kanıtlandığı gibi, bu embriyolojik işlemi, UB ve MM, ve hücre dışı faktörler 3-6 sayısız arasında çapraz olarak, endüktif sinyal çökeltilir. İki yakın zamanda incelenen dışı gelişen pankreas içindeki faktörler ve böbrekler oksijen gerilimi ve kan akışını 7,8 bulunur. ikinci böbrek gelişimi ile ilişkili olarak aşağıda daha ayrıntılı olarak tarif edilecektir.
Kan akışı, potansiyel nefron progenitör hücre farklılaşması, hem de diğer organogenez süreçleri, embriyonik kan akımı haritalama hassas ve doğru bir yöntem oynadığı endüktif rolü ortaya koymak için de çok önemlidir.
Kan akışını ölçme alternatif yöntemler ul reçete dahiltrasound görüntüleme ve reçine 9,10 atmalarını. Sonuç, bu modlar doğal eş kan akımı arasındaki zamansal ve mekansal juxtapositions açıklayacak ve hücre farklılaşmasını kök onların kapasite eksik gösterilmiştir. Reçine kalıplar, örneğin, ancak bu tür oluşum safhasındaki zaman noktalarında olduğu gibi olgun olmayan kaplar, içinde, yetişkin doku içindeki damar desenli geçerli bir model sağlayan, kaplar büyük ölçüde az gelişmiş ve sızan bulunmaktadır. Bu nedenle, reçine, çoğu zaman gözenekli, küçük damarlarda içinde tutmak için başarısız atmalarını.
Bu belirgin engeller için, diğerleri arasında, biz ultrason rehberliğinde böbrek gelişimi bizim soruşturma içine in vivo içi kardiyak embriyonik domates lektin (TL) mikroenjeksiyon dahil etmek seçti. Bu prosedürde, biz zaman uyumlu E11.5, 13.5, E15.5 ve E17.5 zaman noktalarında fare embriyoları sol ventrikül içine TP çözeltisi 2.5 ul ile dolu bir monte mikropipet iğne kılavuz için, bir ultrason probu kullanmaktadır. E17Iğneler daha gelişmiş embriyo nüfuz için yeterince güçlü değil gibi .5 son gelişimsel yaş.
Bu mikroenjeksiyon yönteminin avantajları bol miktarda bulunmaktadır. Ultrason eşliğinde mikroenjeksiyon kesin embriyonik sol ventrikül içinde bir enjeksiyon iğnesinin konumlandırma, hayvan, kalp minimal hasar ve çevreleyen dokuların atan kalbine çözümün pasif ve kontrollü atılmasına, ve ani kalp yetmezliği kaçınma ve ölüm veriyor embriyo tam vücut perfüzyon önce. FITC-işaretli TL kullanımı ile, herhangi bir perfüze damar da endotel apikal zar boyunca işaretleyici koruyacaktır. Immunohistokimyasal ile birlikte, PECAM (CD31, Trombosit endotel hücre adezyon molekülü) ve diğer çeşitli vasküler belirteçleri kullanarak, açıkça edebiliyoruz perfüze ve un-perfüze gemilerin arasında ayrım yanı sıra çevre dokulara herhangi bir anormal boyama karakterize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tüm deneyleri onaylamıştır.
Ultrason-mikroenjeksiyon Cihazları ve Embriyolar 1. Hazırlık
- Sahne, montaj ve prob (Şekil 1) yanı sıra cerrahi aletler (Şekil 2) ayarlayın. 37 ° C'lik bir ısıtma banyosu içinde yer fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi (pH 7.4). Tabanı yoluyla bir ikinci esnek 25 G iğne takılı 1 ml şırınga kullanılarak, mineral yağ ile tamamen mikroenjeksiyon iğne doldurun.
- Dönme üzerine iğne Fix kolunu monte ve madeni yağ çözeltisi boş iğne. TL çözeltisi 2,5 ul yeniden doldurun. Hava kabarcığı enjeksiyon iğnesi içinde mevcut olduğundan emin olun. Uzakta aşamasından, duvara doğru iğne kolunu döndürün.
- Izofluran sürekli infüzyon yoluyla anestezi odasına hamile anne anestezisi. Anne bilinçsiz hale olduğunda, c konumlandırılmış burun tüp anestezi transferiburun tüp içinde burnu ile yatar pozisyonda audal aşamada yan ve yer annesi tam anestezi devletin bir devamı sağlamak için.
- 45 ° açıları, ya da elleri ve ayakları ile Bant bacaklarda dinlenmiş ve üstünlük EKG / Sıcaklık monitör sekmelerini konumlandırılmış. Hamile baraj sürekli o anestezi sağlamak için izlenmesi önemlidir yeterlidir ve gözlere uygulanan bu merhem kurutma azaltmak için.
- Yavaşça herhangi bir aşırı bir ürün ve saç kaldırmak için% 70 etanol-doymuş pamuklu sonra tekrar kuru pamuklu silin, ve, anne karnın alt genelinde epilasyon ürünü uygulayın. Kesi yerinde (Şekil 3) tüm saç kapalı karın cildi temizlemek için emin olun.
- Ince cerrahi forseps ve makas kullanılarak gebe anne üzerinde bir laparotomi gerçekleştirin. Herhangi bir büyük damarları ya da visseral organları kesme önlemek için dikkat edin. 1.5-2 cm vajina üzerinde, ilk epidermis düz kesi yapmak ve approximat için kaburga doğru kesilmiş devamely 2-3 cm. Viseral organlar ve rahim saccules iç göstermek, aynı uzunluğu boyunca, deri altı membran Açığa linea alba ("beyaz çizgi") (Şekil 3) bulmak, ve ilk kesi paralel kesilmiş.
Embriyolar 2. Ekstraksiyon
- Anne ve embriyolar manevra 6-inç pamuk uçlu aplikatör kullanın. Yavaşça kesi açılması dışında ilk embriyo işlemek için aplikatör ile cilt üzerinde (zorlamayın) itin. İlk embriyo Keseciklerin çıkarılmasından sonra, yavaşça ve yavaş yavaş yoluyla ve annenin dış üzerine uterin boynuz kalanını çekin. Bu aşamada kesikten bağırsak ya da diğer organlara çekerek kaçının.
- Embriyoların ölçmek ve yavaşça anne geri sol uterin boynuz yerleştirin. Sonra boynuz vajinadan embriyo saccule sağdaki ile başlayan ve aşağı hareket geri anne içine doğru uterin boynuz yerleştirerek başlar. (Sadece iki embriyo maruz kalması kadar Fi, bu devamGüre gösterir 4). Son olarak, bir yukarıda sütun ve paralel pozisyon embriyolar rahim dolaşımını kesmek için değil haberdar olmak, çizgi insizyon.
- Kollar ve gövde, aynı zamanda bacak ve kuyruk arasında kil blokları ve pozisyon yerleştirin. Kil yüzeyleri laparotomi insizyon ile yaklaşık seviyede olduğundan emin olun. 37 ° C PBS ile fenestre Petri kabı ıslatın.
- Sol el (embriyolar fenestrasyonu paralel) ile sağ el ve fenestre Petri kabı ile uzanan forseps kavrayın ve Petri kabı üst, fenestrasyonu aracılığıyla kapalı forseps ~ 5-cm getirmek. Tamamen fenestrasyonu örgü yırtmadan açın forseps.
- Embriyolar üzerinde ellerini Manevra ve iki embriyo saccules üzerinde görüş odaklanmak. Olmadan (ya da hafifçe) yarıktan kaydırın ve annenin karın üzerine Petri kabı set, fenestrasyonu meshing veya forseps ile saccules dokunmadan. Forseps hala uzatılmış, (her iki tarafta ve her embriyonun üssünde oturması için Şekil 5 Fenestralı örgü manipüle
- Sonraki, (Şekil 6) kısma veya embriyolar zarar vermeden, Petri kabındaki duvar içeren mavi lastik yerleştirin. Emin kil bloklar sıkıca Petri kabı, embriyo ve kauçuk içeren duvar dengeleme emin olun. Fenestralı geçmelerine sızıntıları kontrol ederken embriyolar tamamen (Şekil 6) batık kadar Son olarak, 37 ° C PBS ile Petri kabı doldurun.
3. Enjeksiyon Yöntemi
- Sonra alt enjeksiyon anne ve embriyoların aşağı Z-seviye ayar düğmesini (Şekil 1) kullanarak sahne ve prob ucu sola ve altında iğne ½ cm, enjeksiyon iğnesi döndürmek ve kol monte ve ultrason probu ile doğrudan hizaya (Şekil 7) . 45 ° uzakta prob iğne-kol (değil iğne) itin. Çanak veya ultrason probu ile iğne ucu vurmak için dikkatli olun.
- Ultrason p, geri orijinal yüksekliği enjeksiyon sahne kaldırındoğrudan embriyolar Probe üzerinde elbise biraz batık ve embriyonik doku 3-4 mm'lik içinde olmalıdır. Kullanım X & Y sahne ayar düğmeleri (Şekil 8) sistematik dayak embriyonik kalp bulmak için embriyo / anne / sahne konumunu değiştirme.
- Doğrudan ultrason ekranının Merkezi çizilmiş siyah bir merkez hedef işaretleyici (*) gözlemlemek. X & Y sahne ayar düğmeleri kullanarak sol ventrikül (tercih) veya atrium (Şekil 8) bulun ve ardından yükseltmek veya ultrason ekranında siyah merkez işaretleyici üzerinde tam enjeksiyon hedef konumlandırmak için sahneye döner düğmesini kullanarak sahne indirin.
- Ultrason ekranında kapalı, sağ embriyo hareket X sahne ayar düğmesini kullanın. ½ uzak cm ve ultrason probu 90 ° (Şekil 7), mikroenjeksiyon iğne yeniden konumlandırmak ve tekrar yerine kol.
- Mikroenjeksiyon açıkça ucu al ayar düğmeleri (Şekil 9C-G), pozisyon iğne monte kullanmamerkez işaretleyici ile igned. İğne ucu doğru düzlemde odaklı sağlamak için, ve X, Y, ve mikro-iğne Z vektörleri (Şekil 9C'de & EG düğmeleri kullanarak) enjeksiyon açısını ayarlayın. Sadece "enjeksiyon" düğmesini (Şekil 9F) kullanarak mikroenjeksiyon iğne geri çekin, dikkatli değil, diğer boyutlarını ayarlamak için.
- Yine, tam ultrason ekranında merkez işareti hedef geri prob altında sadece X ince ayar aşaması topuzu hareket embriyo kullanarak. Sol ventrikül aynı X, Y ve Z düzleminde şimdi olduğundan emin olun.
- Mikroenjeksiyon sadece "enjeksiyon" düğmesi monte ile Sonraki, yavaş yavaş mikroenjeksiyon iğne ile embriyo delinme ve yavaş yavaş sol ventrikül içine ucu getir. Kez (Şekil 2A & B) "boş" tutan ve "dolgu" dokunarak, boş uyarı bip sesleri sol ventrikül içine kadar veya TL çözümünün tam 2.5 ul enjekte edilir. Şu andaenjeksiyon kalp odasına giren TL (Şekil 10) iğne ucu kaynaklanan bir gölge gözlemlemek. Tersinde, hızlı enjeksiyon tamamlandığında mikroenjeksiyon üzerinde "enjeksiyon" düğmesi (Şekil 9F) monte dönen mikroenjeksiyon iğne geri çekin.
- Bir sonraki embriyo Devam ve Bu adımlarda sonra, kalan embriyolar için bu yordamı yineleyin ve nihayet geri baraj karın içine son embriyolar yerleştirin. Odacık kutusuna anestezi geçin ve hafifçe son enjeksiyon zamanı 15 dakika burada anneyi taşıyın.
4. Hasat Embriyolar ve Analiz
- Servikal dislokasyon yoluyla baraj Kurban. Kolayca anneden rahim boynuzları kaldırmak için laparotomi kesi genişletin. Uterus kesesi içinde embriyolar tutun. Soğutulmuş PBS embriyolar yerleştirin.
- (Eğer genotiplemede için gerekli toplamak doku) uterus kesesinin embriyolar incelemek ve tüm embriyo yerleştirmek in,% 4 paraformaldehit (PFA), gece boyunca, daha sonra içine% 30 sukroz, gece boyunca, orta kesit kriyostat dondurma. Sonra cryosection kesmek ve immünohistokimyasal analiz için slaytlar üzerine yerleştirin. İsteğe bağlı olarak, dokuların kullanımı,% 100 metanol dehidrasyon% 4 PFA içinde tespit izleyerek tüm montaj.
- Immünohistokimyasal analiz için OCT kaldırmak için PBS içine cryosections yerleştirin. Daha sonra, 30 dakika boyunca,% 10 normal eşek serumu ile bölümleri bloke eder. Daha sonra 1 ile PECAM birinci antikor ekleyin: 100 seyreltme, gece boyunca 4 ° C'de ilave edildi. Bir sonraki gün, 10 dakika her biri için PBT 3 kez slaytlar yıkama ve ikinci eşek anti-fare 594 ekleyebilir ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin.
NOT: Bu ultrason ve mikroenjeksiyon optimizasyonu ve koordinasyonu gerektiren son derece zorlu bir tekniktir. Orada bu teknikle ilgili bir çok dik bir öğrenme eğrisi ve bir uzman olmadan önce mentorluk enjeksiyonların 4-6 hafta gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vasküler oluşumu böbrek gelişmekte akışı öncesinde
(Böbrek de dahil olmak üzere), embriyonik dokunun büyük bir kısmı daha erken dönemde embriyo zaman noktalarında, yoğun damar (unperfused ve perfüze her ikisi) içerir. Gelişmekte olan böbrek içinde iyi göstergesi ve analiz kan akımı biz utero embriyonik intrakardiyak mikroenjeksiyon içinde bir yöntem kullanılmıştır. Bir laparotomi yoluyla çıkarılması ve bir tek uterus Keseciklerin maruz kaldıktan sonra E17.5 E11.5 aracılığıyla embriyonik kalp tanımlamak için yüksek çözünürlüklü ultrason kullanımı, ve, biz TL'nin 2,5 ul enjekte başardık (florosein isotiosiyanat (FITC)) ile konjüge edilmiş.
Biz sırasıyla,% 90, yaklaşık ~% 80 başarı oranı ile en büyük başarısı enjekte E13.5 E15.5 embriyonik ve zaman noktaları, bulduk. Çünkü E11.5 bir nispeten olgunlaşmamış kalp varlığı ve E17.5, yoğun kıkırdak ve kemik formasyonunun bir varlığı, uzak tiBeni puan orta embriyonik zaman noktalarında göre başarı bir ölçüde daha düşük olasılıkla, enjekte nispeten zordur. Bir sırasıyla, E11.5 E17.5 ve zaman noktalarında ile ~% 30 başarı oranlarını ~ en az% 50 bekliyoruz ve olabilir.
PECAM (CD31), evrensel bir endotel işaretleyici ile birlikte etiketleme dokusu, biz niteliksel üç gruba floresan damarları ve dokuların kategorize edebiliyoruz: perfüze damar (PECAM pozitif ve TL pozitif), unperfused damar (PECAM pozitif) ve anormal perfüze yapıları (TL pozitif). Bu özel boyama modeli bize mekansal perfüzyon ve un-perfüzyon (Şekil 11) alanları ayırt sağlar.
E11.5 olarak, perfüze kaplar aslında organ (Şekil 12B) içine nüfuz olmayan bir ağ-benzeri desen gelişen böbreğin kapsüllemek keşfettik. E13.5 tarafından, büyük damarlar daha küçük birkaç ile perfüze edildiTL (Şekil 12C) ile boyanarak aksesuar gemiler. Üreter epitel bazı bu ya zaten perfüze veya bağlı erken embriyonik damarların doğal leakiness kadar olan glomerüllerden olabilir boyunca Boyama de görülebilir. E15.5 büyük gemiler perfüze edildi tarafından, glomerulusların ancak çok sayıda da bu önemli filtreleme (Şekil 12D) oluştuğunu öne TL leke tutan gözlenebilir. Dış nefrojenik bölgenin önemli bir kısmı kan akımının yoksun olduğu görünse de aynı zamanda şu anda görünür perfüze küçük kalibreli damarlarının bir dizi etmektedir. Son olarak, ancak, E17.5 tarafından böbrek çoğunluğu, böylece çevre bölgelerde anjiyogenez yokluğunu gösteren perfüzyon ağırlıklı yoksun nefrojenik bölge, (PECAM pozitif damarlarda ancak yoğun) damar dışında perfüze edildi. Küçük kalibreli gemiler TL içerirler ve perfüze glomerulusların ortalama sayısı dramatik olarak vardırerken zaman noktalarında (Şekil 12E) göre katlanmış.
Şekil 1. Ultrason probu, cerrahi evre, mikroenjeksiyon sistemi, raylı sistem ve EKG / Sıcaklık monitör temel set up.
Şekil 2. Gerekli cerrahi ekipman, çözüm ve cihazlar. (A) Pamuk uçlu aplikatörler. (B) (Halka) forseps uzatılması. (C) Cerrahi makaslar. (D) forseps Blunt-uçlu. (E) Güzel Forseps. (F) Mikroenjeksiyon İğne (Origio, # C060609). (H) Enjeksiyon / denetleyici doldurun. (I) 'Fosfat Tamponlu Salin (PBS). (J) Madeni Yağ (Sigma Aldrich).
Şekil 3. Bir 2 cm laparotomi rahim yukarıda deri altı tabaka (karın duvarı) açığa anestezi anne yapılmaktadır. Cerrahi makas ve ince forseps kullanarak, linea alba ortaya çıkarmak ve epidermal kesim kesi paralel hale. için tıklayınız Şeklin büyük halini görmek.
Şekil 4. 1-2 E15.5 rahim saccules laparotomi kesiden ayıklanır ve maruz. bir büyük görmek için tıklayınızŞeklin sürümü.
Şekil 5. Exposed rahim saccules uzanan forseps kullanarak fenestre Petri kabındaki yarık boyunca rehberlik. Fenestre saccules dibinde kuytu koltuk kaydırılır.
Şekil 6. Uterin saccules sağında yer Mavi içeren duvar. Petri embriyolar kadar 37 ° C PBS ile dolu ve duvar içeren tamamen batık. Kil blokları kol ve gövde ve bacaklar ve kuyruk arasındaki Petri-çanak / embriyo altında güvenli yerleştirilir.
Şekil 7. Enjeksiyon sistemi positio ned ½ cm, sol ve aşağıda, ve ultrason probu 90 °.
Şekil 8. Sahne X ve Y ayar mekanizmaları.
Şekil 9. Boş / cihaz, mikroenjeksiyon sistemi, doldurun ve montaj sahne. (A) tuşuna doldurun. (B) tuşuna enjekte edilir. (C) Dairesel iğne açısı ayar düğmesi. (E) İnce X ayar düğmesi. (F) "Enjeksiyon" düğmesi. (G) Ders X ayar düğmesi. (H) Sahne yükseklik ayar düğmesini döner.
98fig10.jpg "/>
Şekil 10. E15.5 içi kardiyak TL mikroenjeksiyon. İğne ucu ultrason görüntüsü kalp odasının içinde konumlandırılmış TL çözümü iki odası içinde siyah gölge ile gösterilir. Perikard ve perikard boşluğu kolayca ayırt edilir.
Şekil 11. Perfüzyon, unperfusion ve ayırt anormal boyama arasındaki Alanları. İlk panel PECAM leke gösterir. orta panel doku aynı alan üzerinde leke TL görüntüler. Üreterik tomurcuk anormal lekeli olduğu; büyük gemiler beyaz noktalı çizgilerle kaplı. son panel birleştirme olduğunu. Beyaz oklar damar sızıntısını gösterir ve gri oklar bir geminin doğru bir geçiş perfüze olma göstermektedir. Sarı yapılar tamamen perfüze damarsal temsil eder.OAD / 52.398 / 52398fig11large.jpg "target =" _ blank "> rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 12. Embriyo ve böbrek perfüzyon ontogeny incelenmiştir. (A) Tüm E11.5 embriyo perfüze, TL tutan baş ve kuyruk bölgelerinde içinde çok periferik damarlarda ile. (B), perfüze gemi çevreleyen görüldü ama bir ağ-benzeri desen E11.5 gelişmekte böbrek dahil değil, bu noktada yaygın boyama oldukça büyük bir miktarı da vardır. (C) E13.5 böbrek majör, büyük kalibreli damarları nefrojenik bölge (beyaz noktalı çizgi) içinde devamsızlık perfüzyon ile, böbrek (beyaz ve sarı ok) boyunca perfüze edilir gösterir. (D) E15.5 böbrek küçük kalibreli boyunca perfüzyon gösterir, periferik damarlar (sarı oklar),Bazı glomerulusların (beyaz oklar), ve yine çevre böbrek şöminenin perfüzyonun bir yokluğunda. (E) E17.5 böbrek glomerüller (beyaz oklar) boyunca geniş perfüzyon ve küçük kalibreli damarları (sarı oklar) görülmektedir. nefrojenik bölge bu büyütmede böbrek geri kalanından ayırt edilemez. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroenjeksiyon anestezi ve zaman çerçevesi
Annenin anesthetization ile ilgili olarak, bu hava akımı sabit (2-3 L / dk) ve düşük PSI'de tutmak esastır. sedatif akışı / dak yaklaşık 1,75-2 L tutulmalıdır. Aynı anda, enjeksiyonlar yer aldığı zaman dilimleri yakından takip ve her çöp için kontrol edilmelidir. Her çöp için enjeksiyon prosedürü 45 dakika altında tutulmalıdır. Her embriyo gövdesi ve ilgi organı boyunca kontrollü ve değişmez perfüzyon kolaylaştırmak için bir sabit, normal kalp hızı aralığında muhafaza edilmelidir olarak bu sürenin önemi, deney için her şeyden önemlidir. Biz embriyoların arasındaki perfüzyon desen şüpheli sonuçları ve dalgalanmalara enjeksiyonları sonuçları uzatma ve başarılı enjeksiyonlar (yani, yavaş kalp hızı, kardiyak ölüm) oranları düşürdüğünü bulduk. Son olarak, çöp içinde son enjeksiyondan sonra, bu temelYaklaşık 15 dakika izin embriyolar her embriyo içinde doğru, tam perfüzyon kolaylaştırmak için hasat öncesi.
Usul tedavi ve embriyoların bakımı
Embriyoların çıkarılması sırasında, sürekli embriyo çıkarma sırasında genel sağlık ve rahim astar ve embriyoların bütünlüğüne katılarak gerçekleştirilmektedir enjeksiyonu ile başarı daha oranlarını bulduk. Uterus kesesi işlemek ve manevra (PBS ile doyurulmuş) narin pamuk uçlu aplikatör kullanarak ve saccules işlem boyunca anne ve embriyoların hayatta kalmasını sağlamak için zorunludur. İlk olarak, rahim ve plasenta fiziksel bütünlüğü düzgün korunmasını sağlamak için önemlidir. Embriyo kan akışını engelleyebilir ya da plasenta kan akışını besleyen damarların önemli kırılmalarına neden olacak şekilde saccules contorting kaçının. Bu büyük zıplama ekstre gerçekleştirilebilirBir seferde 1-2 embriyo m (ilk sayım için tüm rahim kesesi açılan sürece) ve plasentanın tabanına uzak ana kan damarlarından aplikatörler konumlandırarak.
Embriyonik Enjeksiyon Site Yer
Ultrason cihazı ile uygun konuma mikroenjeksiyon iğne Rehberlik da her enjeksiyon girişimi için önemlidir. Dikkatli dikkat merkezi işaretleyici sol ventrikül konuşlandırma ve puntalıdır verilmelidir. Bunu takiben, iğne bulunmalıdır ve aynı X ve Y planı iğne ve enjeksiyon yerinde hizalamak için de merkez marker tam ortaladı. Bu tamamlandığında, yavaş yavaş enjeksiyon yerinde yakın iğne ucu çizmek ve perikard kesesine ve kalbe aşırı stres uygulamaktan kaçının. Bu iğne, yavaş yavaş ince kağıt tabakası geçmesine izin yerine onları iğne geçişi zorlamak yapılır. Enjeksiyon sırasında, aynı zamanda l önemlidirook iğne ucu (Şekil 10) çıkan siyah gölge dışarı. Bu ventrikül doldurma TP çözeltisi göstergesidir. İğne ucu doğru pozisyonda ise, gölge sürekli görünmelidir TL aort içine atılır gibi kaybolur. Perikard boşluğu engorge görünüyorsa iğne sol ventrikül hedef kapalı ve TL çözüm kalbi çevreleyen perikard boşluğu dolduruyor ki Ancak, bu gösterge niteliğindedir. Bu kolayca embriyonun içinde hala iğne ile gerçekleşen herhangi bir hafif ayarlamaları ile, onun X ve Y düzleminde enjeksiyon iğnesi yeniden konumlandırarak düzeltilir yaygın bir hatadır. Bu aşamada embriyo iğne ayıklanması kaçının.
In vivo mikroenjeksiyon sınırlamalar Ultrason eşliğinde
Doğası gereği, ultrason mikroenjeksiyon temel teknik sınırlamalar bir dizi sahiptir. Öncelikle, mikroenjeksiyon iğne hacmikapasite fare E17.5 için enjeksiyonların yaş aralığı kısıtlar. TL çözeltisi 2.5 ul tamamen E15.5 için embriyolar kadar serpmek için çalışmalarda gösterilmiştir. Ancak, sadece bu zaman noktasında şu, kan hacmi oranı TL minuscule ve etkili bir periferik böbrek endotel zarları etiketlemek için seyreltilmiş hale gelir. Bu nedenle, kan akımının azalması resmi daha sonraki bir zaman noktası enjeksiyonu bir miktarda mevcuttur. Ayrıca, embriyo kemik ve kıkırdak oluşumu, böylece uzamış enjeksiyon süreleri ve iğne başının sık çatlaklara neden iğne ucu için doğal bir bariyer oluşturur. Bu kısıtlamalar, daha iğne gücü ve hacim kapasitesine sahip yeni bir enjeksiyon sistemi kullanılarak aşılabilir.
Alternatif embriyonik kan akımı haritalama teknikleri
Bugüne kadar, haritalama embriyonik fare kan akımının alternatif yöntemler reçine atmalarını uygulanmasını, immunhistokimya boyama ve yüksek rezolüsyonlu dahil iyon ultrason görüntüleme. (Gelişmiş görüntüleme teknikleri entegrasyonu ile) reçinesi kalıplar en bilinen bir alternatif olarak, bu aşağıda daha ayrıntılı olarak tartışılacaktır. Reçine atmalarını doğum sonrası organların içinde akışın doğru üç boyutlu temsilleri yaratılması için izin verir. Ancak, küçük bir başarı nedeniyle çözünürlükte gözenekli kan damar ve sınırlamalara görüntüleme prenatal böbrek dokusu vardı olmuştur. Buna karşılık, konjuge TL lekeleri daha yüksek bir hassasiyet derecesi ile önde gelen membran antijenleri endotel bağlanmasını sağlamak. Diğer durumlarda, reçine döküm viskozite erken yüksek büyütme araştırma sınırlama yaratarak, glomerülün damarları ve kılcal küçük yataklar akmaya keser. Alt büyütme, bu tekniğin gelişen bölgelere göre akış modelleri kurarak açıkça yaşayabilir. Tersine, TL hücresel düzeyde gelişimsel yapılara kan akımı göreceli yüksek çözünürlüklü analiz sağlar.
ent "> Gelecek uygulama ve tarifiBizim verilerimiz kan akımı ve oksijen progenitör farklılaşmasını nefron konusunda kritik faktörler olduğunu göstermektedir. Renal gelişim rollerini aydınlatmak için, gelecek araştırmalar bu fizyolojik süreci tetikleyici altta yatan anatomik mekanizmaları tasvir yanı yanı sıra bu olguyu aracılık transkripsiyonel sinyal yollarını incelemek gerekir. Fenomen ve mekanizma arasındaki köprü getirmedi Bir hipotez, düz kas hücresi ve perisit agrega gelişmekte organların kök hücre bölgelerine kan akışının geçici kesme olayını katkı rol oynamaktadır olmasıdır. Bunu test etmek için, daha fazla immunofluorescent boyama ve analiz nefrojenik bölge sınırında bu hücre tiplerinin odaklanarak yapılmalıdır. Sinyal yolları yatan gelecekteki araştırmalar açısından, biz hipoksi indüklenebilir faktörler ve rollerini incelemek istiyorumVon Hippen Lindau sinyal yolları. Bunların ikisi de büyük ölçüde, sırasıyla, (oksijenlenme en büyük ihtiyacı olan alanlarda) kök hücre (büyük ölçüde hipoksik olduğu görülmüştür) bölge ve farklılaşma alanları içinde hipoksi ve oksijenli ortamlarda muhafaza önemli endüktif rol oynayan literatürde boyunca suçlanmıştır. Ayrıca, biz böbrek damar gelişimi boyunca anjiyogenez ve vaskülojenezin işlemlerde aracılık eritropoietin (EPO) rolünü sorgulamak istiyorum. EPO, endotel farklılaşması ve bakım kritik roller oynayan bir böbrek glikoproteinidir. Kan aracılı endotel farklılaşma rolü büyük ölçüde bilinmemektedir. Son olarak, biz daha fazla bu araştırmaların geçerliliğini güçlendirmek için vazodilatasyon bileşikleri ile in vivo mikroenjeksiyon deneylerde yapmak istiyorum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DAPI | Sigma Aldrich | 022M4004V | concentration 1:5,000 |
| Pecam | BD Biosciences | 553370 | concentration 1:100 |
| FITC-Tomato Lectin | Vector Laboratories | FL-1321 | concentration 2.5 µl / embryo |
| Alexa Fluor-594 (Donkey Anti-Rat) | Jackson Immunoresearch | 712-585-150 | concentration 1:200 |
| Microinjection Needle | Origio Mid Atlantic Devices | C060609 | |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP26291 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | 03-377-20 | |
| Clay Blocks | Fisher Scientific | HR4-326 | |
| Surgical Tape | Fisher Scientific | 18-999-380 | |
| PBS | Fisher Scientific | NC9763655 | |
| Hair Removal Product | Fisher Scientific | NC0132811 | |
| Surgical Scissors | Fine Science tools | 14084-08 | |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11064-07 | |
| Surgical Marking Pen | Fine Science tools | 18000-30 | |
| Right angle forceps (for hysterectomy) | Fine Science tools | 11151-10 |
References
- Abrahamson, D. R., Robert, B., Hyink, D. P., St John, P. L., Daniel, O. P. Origins and formation of microvasculature in the developing kidney. Kidney international. Supplement. 67, S7-S11 (1998).
- Sims-Lucas, S., et al. Endothelial Progenitors Exist within the Kidney and Lung Mesenchyme. PloS one. 8 (6), e65993 (2013).
- Dressler, G. R. Advances in early kidney specification, development and patterning. Development. 136 (23), 3863-3874 (2009).
- Costantini, F. Genetic controls and cellular behaviors in branching morphogenesis of the renal collecting system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (5), 693-713 (2012).
- Costantini, F., Kopan , R. Patterning a complex organ: branching morphogenesis and nephron segmentation in kidney development. Dev Cell. 18 (5), 698-712 (2010).
- Das, A., et al. Stromal-epithelial crosstalk regulates kidney progenitor cell differentiation. Nat Cell Biol. 15 (9), 1035-1044 (2013).
- Rymer, C., et al. Renal blood flow and oxygenation drive nephron progenitor differentiation. Am J Physiol Renal Physiol. , (2014).
- Shah, S. R., et al. Embryonic mouse blood flow and oxygen correlate with early pancreatic differentiation. Developmental biology. 349 (2), 342-349 (2011).
- Andres, A. C., et al. EphB4 receptor tyrosine kinase transgenic mice develop glomerulopathies reminiscent of aglomerular vascular shunts. Mech Dev. 120 (4), 511-516 (2003).
- Wagner, R., et al. High-resolution imaging of kidney vascular corrosion casts with Nano-CT. Microsc Microanal. 17 (2), 215-219 (2011).
