Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrking av Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52412
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

Summary

Heligmosomoides polygyrus er et mus nematode med kraftige immunmodulerende evner som tett ligner de av svært utbredt menneskelig helminth infeksjon. Her beskriver vi en protokoll for langvarig opprettholdelse av H. polygyrus livssyklus.

Abstract

Heligmosomoides polygyrus (tidligere kjent som Nematospiroides dubius, og også referert til av noen som H. bakeri) er en gastrointestinal helminth som sysselsetter flere immunmodulerende mekanismer for å etablere kronisk infeksjon i mus og ligner utbredte menneskelige helminth infeksjoner. H. polygyrus har blitt studert i stor utstrekning innen helminth-avledet immunregulering og har blitt funnet å potent undertrykke eksperimentelle modeller av allergi og autoimmunitet (begge med aktiv infeksjon og isolerte utskilte produkter). Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen skisserer forvaltning av H. polygyrus livssyklus for konsistent produksjon av L3 larver, gjenvinning av voksne parasitter, og innsamling av sine excretory-sekretorisk produkter (HMS).

Introduction

Heligmosomoides polygyrus er en naturlig murine gastrointestinal helminth som er nært knyttet til svært utbredte menneskelige nematode parasitter 1. I motsetning til andre nematoder modeller som Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus gående etablerer kronisk infeksjon i mus som en direkte følge av flere kraftige immunmodulerende mekanismer benytter det til å undertrykke vertens immunrespons 2.

H. polygyrus har en direkte livssyklus: infeksiøs L3 larvene blir inntatt av feco-oral overføring (eller administreres av oral sonde i laboratoriet innstillingen), hvorpå de vandrer til subserosal lag av tolvfingertarmen og encyst før retur til tarmlumen som voksne ormer omtrent åtte dager etter første infeksjon. Parring og eggproduksjon skjer ved dag 10, og det er mulig å høste voksne ormer for kultur og innsamling av ekskretorisk-sekretoriske produkter fra day 14 og utover tre. H. polygyrus interagerer med det kommensal mikroflora, med økt Lactobacilli stede i infiserte mottakelige mus 4-6, og økte nivåer av H. polygyrus infeksjon etter eksponering av mus til Lactobacilli 6.

Aktiv infeksjon med H. polygyrus er blitt vist å beskytte mot immunpatologi i mange dyremodeller av autoimmunitet 7-10, kolitt 11,12 og allergi 13-16. Det har derfor vært stor interesse for potensialet i Excretory-Sekretoriske molekyler fra denne parasitten ("HMS") til down-modulere patologi in vivo 17,18. Faktisk er beskyttende effekt sett etter behandling av mus med HMS-produkter 19 gjennom trasé som nå blir identifisert 18,20. Her beskriver vi en protokoll for pålitelig produksjon av Heligmosomoides polygyrus og utvinning av sine utskilt produktersom kan bli ytterligere anvendt i en rekke funksjonelle biokjemiske og immunologiske undersøkelser.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer i denne protokollen er utført i samsvar med retningslinjer fastsatt av Storbritannia Home Office og University of Edinburgh Veterinary Services.

1. Infeksjon av mus via sonde

  1. Butikk Heligmosomoides polygyrus L3 larver i destillert vann i opp til seks måneder ved 4 ° C.
  2. Før bruk, vask L3 larver tre ganger i destillert vann: sentrifuger ved 300 xg i 10 min (med brems), fjerne alle men 500 mL av vann (for å unngå forstyrrende pelletert L3 larver) og resuspender pellet hver gang.
  3. For det tredje vask, tilsett vann til en eksakt volum (vanligvis 40 ml) og aspirer 20 ul med en 200 mL tips kutt for å utvide sin blenderåpning. Plassere to 20 ul prøver på overflaten av en 60 mm kulturskål og telle L3-larver (vanligvis mobile, og som best kan ses i henhold til 50X forstørrelse med et disseksjonsmikroskop). Resuspender den endelige pellet i destillert vann til en-konsentrasjonn av 2000 L3 larver per ml.
  4. For livssyklus produksjon, infisere åtte uker gamle F1 (C57BL / 6xCBA) mus med 400 H. polygyrus L3 larver i 200 mL destillert vann ved oral sondefôring (beherske mus i oppreist stilling ved nakkeskinnet og forsiktig forbi den butte gavage nål gjennom munnen og spiserøret ned i magen). Omrør grundig før hver infeksjon (larver slå seg raskt i vann) og aspireres 200 ul i en 1 ml sprøyte; bruke en dedikert gavage nål med en avrundet ende. For eksperimentell infeksjon av yngre mus (6-8 uker gamle) eller andre innavlede stammer (f.eks C57BL / 6 eller BALBc), infisere mus med 200 L3-larver.

2. Formering og vedlikehold av H. polygyrus

  1. Plasser trekull i sentrum av en stor plast badekar og la kaldt vann fra springen for å kjøre over den i minst 30 min (uvasket aktivt kull er giftig for L3 larver). Drenere vannet fra karet og kull på t plasserewo lag av absorberende papir, forlater det utsettes for romluft til det er helt tørt.
  2. Dersom eggene er nødvendig, skrape avføring først ut av tykktarmen med pinsett og sakser (om nødvendig). Hvis et stort antall L3 larver er nødvendig, å plassere mus på en wire rutenett og samle ekskrementpelletene over flere dager.
  3. Bland avføringen med granulert trekull i et forhold på minst 1: 1, for å oppnå en konsistens bare fuktig nok til å overholde filterpapir. Smøre et tynt lag på midten av noen fuktet filterpapir i en petriskål og sette dette i et fuktig boks (tilsett litt fuktig tørkepapir og en skål med vann) i mørket i 12-14 dager.
  4. Fjern L3 larver fra dag 7 og utover, og samle dem på minst to anledninger før papiret er forkastet. Larvene danner en ring rundt kanten av filterpapir; løfte filterpapiret ut av petriskålen og skyll larver som er igjen av platen (ved hjelp av en pipette, og 5 ml sterilt vann pr skål) i en 50 ml-rør.
  5. Løftav filterpapir, og høste de resterende larver igjen på platen med destillert vann i et 50 ml rør. Sentrifuger effluent-oppløsning ved 300 xg i 10 min. Vask larver tre ganger med destillert vann og deretter lagre ved 4 ° C i opp til 50 ml destillert vann inntil påkrevet.
    MERK: Larver forbli levedyktig og infeksiøs i minst 6 måneder.

3. Innsamling av Adult H. polygyrus Worms

  1. Klargjør det modifiserte Baermann Apparat i forkant som vist i figur 1.
  2. Cull mus fjorten dager etter smitte.
  3. Vask magen med 70% etanol. Skjær huden over magen og trekke tilbake for å avsløre den fremre bukvegg. Gjør midtlinjesnitt for å komme inn i bukhulen.
  4. Fjern hele tynn- og tykktarmen (duodenum fra proksimal til den distale endetarmen). Sett inn en tørr petriskål.
  5. Rett tarmen langs hele sin lengde; eksisere avføring som inneholder kolon; plassere dette inn i en egen rett for egg forberedelser senere.
  6. Eksisere de proksimale 20 cm av tynntarmen som inneholder voksne ormer -identified av forholdsvis tykk vegg i tolvfingertarmen og ofte et rødt utseende på grunn av den intra-luminale ormer. Sett inn en (100 mm diameter) petriskål med 5 ml Hanks 'Solution, varmet til 37 ° C (to eksemplarer per parabol).
  7. Åpne ormen fylte proksimale gut del på langs med saks (runde-ended saks er best for dette), og skrape ned innsiden av tarmen fôr med to glassplater til å fjerne ormer. Deretter kaste den rene tarmveggen.
  8. Tips ormer i små muslin poser, stift stengt og fest med binders rundt kanten av glasstrakt (figur 1).
  9. Fyll trakt med Hanks 'Solution og tilsett ca 4 petriskåler av ormer i traktene.
  10. Sted apparat i 37 ° C inkubator i 1-2 timer, for å forsiktig agitering halvveis gjennom løsnerusk fra tarmen forberedelse som kan okkludere musselin filter. Ta vare for å unngå søl av rusk utenfor musselin bag - dette vil føre til forurensning av den endelige HMS forberedelse. Voksne ormer burde ha sakte migrert gjennom musselin klut og bosatte seg på bunnen av glasset reagensrør. Løsne prøverør fra forbindelsesgummislange over vasken nøye (ta vare å unngå å miste ormer på dette punktet).
  11. Ved hjelp av en plast pipette, overføre ormer inn i en 50 ml tube og vask seks ganger med Hanks 'Solution (tillate ormer å bosette seg med tyngdekraften, fjerne medier med en stripette, tilsett 40 ml Hanks' Solution og gjenta fem ganger).
    MERK: orm kultur må holdes sterile fra dette punktet og fremover.
    1. Bevege seg til en laminær strømningshette og vaske ytterligere seks ganger i steril Hanks løsning supplert med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, klar for in vitro kultur.
  12. Tellevoksne ormer utvinnes ved å ta to prøver av 20 pl tatt opp med en gul spiss kutt for å utvide sin åpning; forvente ca. 50% av mengden av podet larver.

4. Sette opp kulturer for HMS: Medium Forberedelse, vaske Voksen Worms

  1. Bløt ormer fra 3,11 i ca. 10 ml RPMI supplert med 10% gentamycin i 20 minutter, slik at røret hviler i en vinkel for å sikre ormer er helt dekket.
  2. Utføre dette i en laminær hette: Vask igjen seks ganger med Hanks 'Solution (supplert med 5 U / ml penicillin og 5 mikrogram / ml streptomycin).
  3. Forberede H. polygrus media.
  4. Å opprettholde sterilitet i en laminær strømningshette, til 500 ml av RPMI 1640, tilsett 11,1 ml av 45% glukose (sluttkonsentrasjon 1,2% som RPMI1640 inneholder 0,2% glukose), 5 ml 100 x Peniclllin-Streptomycin (sluttkonsentrasjon 5 U / ml penicillin, 5 ug / ml streptomycin), 5 ml L-glutamin (2 mM sluttkonsentrasjon), og5 ml Gentamycin (sluttkonsentrasjon 1%). Ikke legg til FCS.
  5. Alikvote ormer inn ventilerte T25 kolber, ca. 1000 ormer i 15 ml H. polygyrus media per flaske, og sted oppreist i 37 ° C inkubator (5% CO 2) i 3 uker.

5. Utarbeidelse av HMS

  1. Samle HMS-holdige kultur media fra kulturer med intervaller på ikke lenger enn to ganger per uke, sette til side den første samlingen etter 24 timer med kultur (på grunn av høye nivåer av LPS forurensning og vertsproteiner - kan behandles separat eller kassert). Hold hver samling separat og tydelig merket med dato og batchnummer. Skift ut med et tilsvarende volum H. polygyrus media ved hver anledning.
  2. Sentrifuger HES-inneholdende medium ved 400 x g i 5 min. Deretter filtrere sterilisere gjennom 0,2 mikrometer lav-protein-bindende filtrene inn 50 ml rør. Oppbevares i -20 ° C fryser tydelig merket med dato for orm høsting og dato for HMS-collection.
  3. Etter 21 dager med HMS-samling fra kultur, kast ormer.
  4. Basseng 500-1000 ml HMS supernatant (vanligvis fra frossen lager, og ikke inkludert den første 24-timers samling) og konsentrerer over en 3000 MWCO filter i ultrafiltreringsenheten nitrogentrykk.
    MERK: Vær veldig forsiktig med å la filteret gå tørr.
    1. For å sette opp filter enhet, først vaske 3 kDa membran blanke siden ned i en 1 liters kanne med destillert vann for 3 x 20 min under omrøring. Monter ultrafiltreringsenheten i henhold til produsentens instruksjoner med filter membran blanke siden opp. Plass i skap ved 4 ° C og passere 50 ml destillert vann gjennom før du begynner å konsentrere sammenslåtte HMS.
    2. Legg til hvert rør av HES inn i filtreringsenhet som kreves (100-140 ml per dag), inntil volumet er konsentrert ned til 2-5 ml.
  5. For å fjerne forurensninger fra HMS-holdige kultur media, tilsett 50 ml pyrogen-free PBS til filtrering enhet og deretter konsentrere seg ned til ca 2 ml. Gjenta dette trinnet to ganger (150 ml PBS totalt). Overfør HES inn i et 15 ml rør, filtersteriliser (med et 0,2 um filter) i en laminær strømningshette og måle proteinkonsentrasjon ved hjelp av et spektrofotometer (E = 10 280) eller ved Bradford-analysen.
  6. Delmengde, etikett med batchnummer og dato, og fryse ved -80 ° C.
  7. Utfør en kromogen LAL analysen i henhold til produsentens protokoller på hvert parti av HMS før bruk. Hvis LPS nivåene er større enn 1 U LPS per 1 mikrogram protein, bør du vurdere å ikke bruke denne batch for in vivo eksperimenter eller in vitro kulturer.
  8. Behandle HMS samlet på 24-timers separat på samme måte; den vil inneholde LPS og noen vertsproteiner, og samtidig ikke egnet for funksjonelle eksperimenter, er det en nyttig kilde til individuelle molekyler som kan bli isolert ved monoklonalt antistoff-affinitets-rensing.

Representative Results

Mottakelighet for infeksjoner med H. polygyrus styres i stor grad av den genetiske bakgrunnen av musestammen (tabell 1); C57BL / 6 og CBA-mus er svært utsatt 21,22. For opprettholdelse av parasitten livssyklus har F1 hybrid mellom disse to stammene er valgt for sin evne til å motstå mye høyere snekke belastninger uten morbiditet (dreven intestinal epithelial skade) i forhold til enten foreldrestamme. Oral føring av 400 L3-larver blir anvendt for å opprettholde sin livssyklus i F1 mus (som resulterer i voksne orm byrder som er vist i figur 2), mens en dose på 200 L3-larver er vanligvis brukt for eksperimenter i homozygot innavlede stammer (for eksempel, C57BL / 6 eller BALBc). Dette kan imidlertid dosen må reduseres avhengig av miljø co-faktorer som kan avvike mellom dyre fasiliteter, for eksempel variasjoner i tarmfloraen.

Grupper av HMS har vist reproduserbar effcacy i funksjonelle analyser og i proteinsammensetningen; Dessuten, når supernatanter fra hver påfølgende uke av kulturen ble analysert, opp til totalt 4 uker ble proteinprofiler funnet å være svært lik (figur 3). Når HES-konsentrasjonen blir målt ved Bradford-analysen (se 5.5), det totale protein er vanligvis omtrent 1 mg / ml (figur 4).

En alternativ metode for å konsentrere HES er med en sentrifugal-konsentrator (f.eks Vivaspin 3-kDa cut-off-membran), hvor prøvene sentrifugeres ved opp til 4000 g i en sving-ut rotor sentrifuge, fjerning av buffersalter og lavmolekylære komponenter. Sentrifugal konsentrasjon er best egnet for små bearbeidingsmengder (1-10 ml), og er begrenset til en maksimal konsentrasjonsfaktor på omtrent 30x.

Ved innsamling av HMS, er å unngå forurensning kritisk. For å unngå forurensning med verts molekyler, forkaste vi HMS-continnelukker kultur media fra første 24 timer etter voksen orm høste fra musen tarmen. Vi også kvantifisere graden av LPS forurensning i hvert parti av HMS med en Chromogenic LAL analysen (se 5.7). 1 U av LPS tilsvarer ~ 100 pg LPS og nivåer under dette anses ubetydelig 23. I våre hender, de fleste grupper av HMS er betydelig under denne grensen, var gjennomsnittlig konsentrasjon av LPS i HMS være 0,23 U / mikrogram (figur 5). Effekten av LPS i in vivo-modeller av patologi (for eksempel undertrykkelse av astmatiske reaksjoner) krever minst 10 ng LPS 23. Derav in vivo administrering av 5 ug HES fra et parti med 100 pg LPS / ug HES vil inneholde 500 pg LPS, godt under den effektive konsentrasjon hvor LPS blir et problem.

Figur 1
Figur 1: Baermann Apparatus Baermann Apparatus oppsett for innsamling av voksen H. polygyrus (som beskrevet i punkt 2).

Figur 2
Figur 2: Gjennomsnittlig Worm Burden 14 dager etter infeksjon med 400 L3 Larver Mean orm byrder 14 dager etter smitte med 400 L3 larver. Datapunkter som vises er fra 19 separate runder med infeksjon av C57BL / 6xCBA mus. Gjennomsnitt ± SEM vist.

Figur 3
Figur 3: Protein Profiler av HMS Fra følgende uker i Kultur SDS-PAGE profilen til HMS-proteiner som samles i påfølgende uker med kultur.

Figur 4
Figur 4: Final Antall av HMS fra 500 ml ES-holdig Media Yield av HMS protein fra 11 forskjellige grupper som stammer fra ca 500 ml kultursupernatant. Gjennomsnitt ± SEM vist.

Figur 5
Figur 5: LPS Forurensning av HMS Nivåer av LPS forurensning i 41 grupper av HMS målt ved Limulus ameobocyte analysen. Median LPS konsentrasjon = 86 enheter per mg av HMS.

Figur 6
Figur 6: Animerte Skjematisk av H. polygyrus Life Cycle Oppsummering av viktige livsløpsfaser fra oral føring av L3 larver, gjennom utvinning av larver og voksne ormer til isolering av HMS.


Figur 7: Animerte Skjematisk av HMS og dets funksjoner Nøkkelimmunmodulerende effekter av løselige meklere og exosomes som finnes innen HMS.

Genotype (og bakgrunnen belastning) Primær infeksjon Fenotype Reference
Innavlede stammer
A / J, CBA, C3H Svært utsatt 22,29
C57BL / 6 og C57BL / 10 Mottakelige 22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J Intermediate 22,31
NIH, SJL, SWR Lav mottakelighet 22,32
Transgen for cytokiner eller cytokinreseptorer
IL-1β - / - Mer utsatt 33
IL-1R - / - Mindre mottakelig (a); ingen endring i følsomhet, men økte granulomer (b) (A) 33
(B) 34
IL-2Rβ Transgen (C57BL / 6) Motstandsdyktig 35
IL-4 - / - Høyere fruktbarhet 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 og BALB / c) Svært utsatt 22
IL-6 - / - (BALB / c eller C57BL / 6) Meget motstandsdyktig 37
IL-9 Transgenic(FVB) Motstandsdyktig 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Mangel Th2, redusert granulomer gormation 39,40
IL-25 - / - (BALB / c) Mer utsatt 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) Ingen endring i følsomhet 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) Høy Th1, økt mottakelighet 41,42
Transgen for T cellemarkører
CD28 - / - (BALB / c) Marginalt høyere fruktbarhet 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) Høyere fruktbarhet 44
OX40L - / - (BALB / c) Høyere fruktbarhet &# 160; 45
Transgen for medfødte immun loci
Type 1-interferon-reseptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) Høyere fruktbarhet, flere granulomer 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Mer motstandsdyktig, mer granulomer 34
C-KitW / wv (WBB6) Mer utsatt 46,47

Tabell 1: Primær infeksjoner med H. polygyrus i genetisk forskjellige og gen-målrettet musestammer.

Discussion

Livssyklusen til H. polygyrus fortsetter i en pålitelig konsekvent måte. Etter naturlig inntak eller oral føring av L3 larver på dag 0, cyster begynner å dannes under duodenal serosa etter dag 5, utvikler seg til larver moults og deretter dukker opp som voksne ormer i tarmlumen fra dag 10, kan egg sees i avføring fra dag 14 og granulomer er synlige på duodenal serosale overflate fra dag 21. Den protokoll som er beskrevet ovenfor (og sammenfattet i figur 6) gjør det mulig for high-throughput produksjon av H. polygyrus excretory-sekretorisk produkter (HMS), i tillegg til pålitelig gjenoppretting av levedyktig L3 larver for fremtidige eksperimentelle og livsløps infeksjoner.

H. polygyrus infeksjon har vist seg å være beskyttende i modeller av astma avhengig OVA eller Der p 1 (Husstøvmidd allergen) 14. Videre kan undertrykkelse av luftveisinflammasjon kan overføres med CD4 + CD25 + 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriske B-celler 24 fra ikke-sensitivisert, H. polygyrus -infected mus. I modeller av autoimmunitet, H. polygyrus-infeksjon har blitt vist å være undertrykkende i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) modell av multippel sklerose 9, og undertrykkelse kan overføres med enten CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler fra infiserte mus 24.

Heligmosomoides polygyrus ekskresjonssystemer-sekretoriske produkter (HES) modulerer vertens immunrespons og undertrykke Th2-mediert inflammasjon av en rekke mekanismer (som er skissert på figur 7), inkludert: a) Inhibering av dendrittisk celle respons på stimulering 25, b) induksjon av CD4 + foxp3 + regulatoriske T-celler 18. og c) blokkering av IL-33 produksjon 20. HMS er blitt vist å være beskyttende når det administreres ent sensibilisering eller utfordring i OVA-alun modell av astma 19 og også når det gis intranasalt med Alternaria ekstrakt allergen 20, gjennom undertrykkelse av tidlig IL-33 release. Unngåelse av LPS kontaminasjon av HMS er ofte avgjørende for å lykkes med fremtidige immunologiske eksperimenter. I protokollen skissert her, de kritiske trinnene i å oppnå dette er å sikre at rusk inneholdt innenfor musselin poser av den Baermann Apparatus ikke går inn i siste HMS-forberedelse (se 2.10) og å sette av ES løsning fra den første 24-timers kultur (se 5.1).

Over de siste årene har HMS blitt grundig karakterisert ved proteomikk nivå med over 370 forskjellige proteiner identifisert 26,27. I tillegg har ES fra det fjerde stadium larver blitt utsatt for proteomikk analyse 28. Pågående arbeid har karakterisere de store sukkerkomponenter av HES, kjent for å være sterkt immunogent 3, og utskilt mikro RNSom det er innkapslet i 50-100 nm vesikler eller exosomes (Buck et al., Innsendt for publisering). Med etableringen av reproduserbare protokoller for innsamling av ES fra denne svært immunmodulerende parasitten, og med omfattende proteomikk data som identifiserer de molekylære komponenter av HMS, scenen er nå satt for identifikasjon og terapeutisk testing av enkeltmolekyler fra H. polygyrus som kan mediere viktige effekter på vertens immunsystem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Tags

Immunologi , Helminth Life Cycle Excretory-Sekretorisk Produkter immunologi Infeksjon Mouse
Dyrking av<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; En Immunmoduler Nematode Parasite og dets utskilt produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, C. J. C., Robertson, E.,… More

Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter