Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi

doi: 10.3791/52419 Published: November 28, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Granzymes doğal katil (NK) hücreler ve sitotoksik T lenfositler (CTL), 1 salgılama lizozomlarında bulunan serin proteaz ailesidir. Beş farklı granzymes insanlarda (A, B, H, K ve M,) 'de bulunan, ve farelerde on (A - G, K, M ve N) 2,3. Granzim A ve Granzim B (GzmA, GzmB) en bol miktarda bulunan ve geniş ölçüde insan ve kemirgen ortamda araştırılmıştır.

GzmB klasik fonksiyonu hedef hücre sitosol 4 ulaşmak için Granzim izin gözenek oluşturucu protein perforin ile bağlantılı olarak yürütülen, hedef hücrelerde apoptoz endüksiyonu. GzmB sentezleme tümden sitotoksik lenfositlerinin de bulunmasına rağmen, son zamanlarda yapılan çalışmalar bazofiller 6, mast hücreleri 7, plazmasitoid dendritik hücreler 8 ve B hücreleri 9, aşağıdakileri içeren, ancak keratinositler 5 ile sınırlı değildir, başka bir GzmB ifade eden hücre tipleri, çeşitli ele edilmiştir, 10.Bu bağlamda, apoptotik olmayan GzmB fonksiyonları, enflamatuar süreçler, doku tekrar modellemesinde ve diğer bağışıklık düzenleyici özelliklerinin 11-14 katılım kadar ortaya çıkmıştır.

Daha geniş bir biyolojik rolü, daha önce şüphe daha GzmB önerilmiştir göz önüne alındığında, araştırmacılar da tespiti için güvenilir ve özel araçlar gerektirir. Avantajlı olarak ökaryotik serin proteazları 15 arasında benzersiz aspartik asit kalıntısı, bir özelliği karboksil yanı üzerinde bölmek için GzmB spesifik bir gerekliliktir. Fare, insan ve sıçan GzmB ancak fare GzmB uzun alt-tabaka özgüllüğü terminali (P1) Asp, bazı genel alt-tabakalar GzmB tarafından etkin bir şekilde klivaj edilebilir olduğu anlamına gelir, hem insan ve fare 16, bu ustaca farklıdır, yapısal olarak çok benzer Üç türlerinden, üst baş P1 daha karmaşık dizileri ile diğer alt-tabakalara ise, geniş çapta değişkendir sonuçlar verebilir. Geçmişte ve daha yeni li hem deterature, bu gerçeği dikkatle kontrol olsa, önemli karışıklık ve bazı deneysel bulguların biyolojik önemi yanlış yorumlanmasına neden oldu, kinetik çalışmalar durumu 17 düzeltmek için çalışmışlardır.

Bu yazıda, iki ticari olarak temin edilebilen alt tabakalar, yani, Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl ve N-asetil-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid kullanılarak, bu noktaları göstermek için çalışmışlardır. İki reaktifler bölünme (bir floresan serbest paranitroanilide karşı serbest sülfidril) Aşağıdaki farklı reaktif gruplar oluşturmak, ama bu proteolitik bölünme üzerinde hiçbir etkisi ne olursa olsun sahip. Açıklanan protokol, çok eski bir protokol 18 modern bir uyarlamasıdır, fakat, aynı zamanda, GzmA ve GzmH gibi diğer granzymes aktivitesini tespit etmek için bir yöntem çerçeve sağlarken araştırmacılar, uygun farklı GzmB alt tabakaları kullanır yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOT: farelerden elde edildi Dalaklar (yaş 6-10 hafta) ve tüm hayvan deneyleri Peter MacCallum Kanser Merkezi (E486) hayvan etiği kurallarına göre yapılmıştır.

Örneklerin 1. hazırlanması.

  1. Aktif fare NK hücrelerinin hazırlanması.
    1. Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak negatif seçim ile (GzmB gen boş) fareler - / - C57BL / 6 ya da B6.GrzmB dalak tek hücre süspansiyonları, birincil saf NK hücrelerini izole edin.
    2. Üreticilerin protokolünü izleyin. Kısaca, manyetik T ve B hücreleri, dendritik hücreler, granülositler, makrofajlar ve spesifik yüzey belirteçleri karşı biyotin-konjuge antikor ile kırmızı kan hücreleri gibi "NK-olmayan" hücreleri etiketlemek. "Non-NK" hücreleri tüketmek anti-Biyotin boncuklar ile manyetik ayırma kullanın.
    3. Kültür, 24 oyuklu plakalar içinde 700,000 hücre / ml IL-2 (1000 U / ml) ihtiva eden ortam içinde 5-7 gün için, NK hücreleri izole37 ° C'de   ° C.
    4. Seçenek olarak ise, kullanım 19 T-hücreleri, OT1 T hücresi reseptörü transgenik fareler 20 birincil antijen sınırlı CTL CTL salgılanan GzmB 19 aktivitesini belirlemek için aktif NK hücrelerinden karma lenfosit kültürleri 21 ya da yüzer üretilen aktif.
  2. Insan NK hücre hattı ve birinci NK hücrelerinin izolasyonu bakımı.
    1. % 10 cenin dana serumu ile takviye edilmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ortamında insan NK lösemi (YT hücre) koruyun. Seçenek olarak ise, sağlıklı bireylerden alınan periferal kanda, primer, NK hücrelerinin saflaştırılması ve daha önce tarif edildiği gibi 22, IL-2, 100 U / ml sonda yoğunluğunda içeren bir ortam içinde 2-3 gün için harekete geçirir.
  3. Hücre lizatlarının üretilmesi.
    1. PBS (pH 7.4) içinde hücreleri üç kez yıkayın, sonra Nonidet P-40 liziz tamponunda askıya (% 0.1 NP-40, 250 mM NaCI, 25 mM Hepes, 2.5 mM EDTA). İdeal olarak, 5 x 10 6, en az lize 7 T hücreleri> kadar. Proteaz inhibitörleri ekleme, birçok gibi GzmA gibi geri dönüşü olmayan bir serin proteaz inhibitörleri ve özellikle tryptases içindedir. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir ve daha sonra 10 dakika boyunca 15.000 x g'de bir mikrosantrfuj çekirdekleri pelet. Nükleer pelet atın ve yeni bir tüp süpernatant aktarın.
  4. Lisatların protein konsantrasyonu belirlenir.
    1. Örneğin Bradford veya bisinkoninik asit (BCA) olarak tercih edilen ticari olarak temin edilebilen bir protokol kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Konsantrasyonu ~ 2 mg / ml az olduğundan emin olun. Gerekene kadar -20 ° C'de saklayın lisatları (granzim aktivitesi, -20 ° C'de birkaç ay boyunca stabildir).

2. Granzim B Aktivite Deneyi

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    1. DMSO içinde substratların (Boc-AAD-S-Bzl veya Ac-IEPD-pNA) içindeki bir 10mM stok hazırlayın (~ 5 mg / ml) -20 & # 'de parçalar halinde ve mağaza176 ° C. Taze bir çalışma seyreltme hazırlayın ve Boc-AAD-S-Bzl kısmen DMSO içinde depolama hidrolize olarak, her gün sonra atın.
    2. -20 ° C'de, 250 mM DMSO içinde kolorimetrik reaktif (5,5'-ditiyo-bis (2-nitrobenzoik asit), DTNB) stok (0.09 g / ml) ve mağaza hazırlayın. Her gün taze bir çalışma seyreltme hazırlayın. Bu reaktif sadece SBzl gösterge değil, gruplar pNA alt tabakalar için gereklidir.
    3. Taze tampon (0.1 M HEPES, 0.05 M MgCl2, pH 7.3) her 2-3 hafta sonra yapılır.
  2. Oda sıcaklığına DTNB ve sentetik yüzeylerde getirin. Seyreltik alt-tabakalar (1:16, örneğin, 1.6 ml tampon içinde 100 | il) ve DTNB (1: 250, örneğin 10 2.5 mi tampon maddesi içinde ul) ve iyice karıştırın.
  3. 160 ul son hacim olması için tampon maddesi içinde her bir numunenin 100 ug protein lizat az seyreltin. Bir çok kanallı pipet kullanarak bir "'U' alt vinil 96 oyuklu plaka (~ 33.3 ug / çukur), üç kopya halinde oyuk başına 50 ul ekle.Bir "tampon sadece" kontrol dahil (ayrıca üç kopya halinde).
  4. Ac-IEPD-pNA ile çalışırken örnekleri / tampon kontrolüne seyreltilmiş DTNB 100 ul ekleyin (bu adımı atlayabilirsiniz.
    NOT: GzmB tarafından Ac-IEPD-pNA'nın yarılması doğrudan fluorojenik pNA (Şekil 4B) serbest bırakır.
  5. Sonra hızlı bir şekilde tampon herhangi bir olumsuz kontroller ile başlayan ve beklenen olumlu örnekleri ile terbiye, üçlü her set için seyreltilmiş yüzeylerde 50 ul eklemek için bir çok kanallı pipet kullanın.
  6. Plaka okuyucu plaka koyun. OD 405 nm'de bir mikro-plaka okuyucusu içinde Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA hidrolizi ile Asp-az aktivitesi ölçülür. 25 okuma, her 15 sn (yaklaşık 6 dk, toplam okuma süresi) almak, bir kinetik tahlil protokolü kullanın.
  7. Plaka okuyucu yazılım Vmax için bir değer oluşturmak değil eğer elle substrat bölünme oranını hesaplamak için her zaman noktasında oluşturulan absorbans okumaları kullanın.

Da 3. Analizta

NOT: Zamanla OD değişikliği (mOD / dk) olarak tanımlanan maksimum hız olarak sunulmaktadır üretilen veriler,.

  1. Verileri analiz etmek için, absorbans değişikliği oranı hesaplanır alt-tabaka bölünme maksimum hızını belirler. Otomatik genellikle bu seçeneği vardır plaka okuyucu yazılımı kullanarak yapın.
  2. Alternatif elle, plaka okuyucu üzerinde kinetik tahlil sırasında oluşturulan absorbans değişim, kinetik araziler görüntüledikten sonra dik düz bir çizgi verir veri noktalarını seçin. En deneyleri için maksimum hız tahlilin ilk 2 dakika içinde elde edilmektedir.
  3. Zaman aralığı bu düz çizgi ve bölünmenin en yüksek OD okuma başlangıç ​​OD okuma çıkartın. İstatistiksel analiz ve grafik ekran için Microsoft Excel / Graph pad ham veri aktarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Boc-AAD-S-Bzl, alt-tabaka GzmB için spesifiktir

serin proteaz GzmB sitotoksik lenfositleri (CTL ve NK hücreleri) önemli bir bileşeni olan ve bu tip virüs ile enfekte olmuş veya dönüştürülmüş hücreler gibi hedef hücrelerin hızlı apoptotik ölümünü teşvik etmek için ağırlıklı olarak sorumludur. Bu durum, seçilen proteinler bazı özel aspartat kalıntısı sonra yarılma için alt-tabaka tercihine büyük ölçüde, bir öznitelik de aspartat kalıntısı sonra bölmek kaydıyla proteazlar, farklı bir sınıfı, sistein proteaz ailesinin 15 vardır kaspaz paylaşılabilir. Proteolitik mekanizması bu fark, AAD-SBzl bir kaspaz ile parçalanabilen anlamına gelir. GzmB ekspresyonu bu hücreleri (Şekil 1) için hazırlanan hücre lizatlarında izlenebilir sitotoksik lenfositler ve enzimatik aktivitesinin aktivasyonu takiben indüklenir. granzim gen nakavt farelerin kullanılabilirliği bize kurmak için izin verdiSentetik peptit substratı, Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - tiyobenzil ester (S-Bzl), özellikle GzmB ile hidrolize edilir. Sentetik alt-tabakanın sağlam ayrılması B6 primer NK hücrelerinden gelen bir hücre lisatı içerisinde ölçülür, ancak B6.GrzmB de olabilir - / - NK hücreleri. N-α-CBZ-L-lisin (BLT) hidrolizi ile ölçüldüğü gibi tripsin benzeri (triptaz) alt-tabaka spesifikliğine sahiptir ve her iki lizatlarında mevcut olan bir kumanda, GzmA proteolitik aktivitesi olarak, eşdeğer -S- Bzl.

Türlere özel GzmB substrat tanıma sekansı

Fare ve insan GzmB P1 aspartatı 23 çevreleyen haritalama artıkları gibi birçok 8-10 olarak tarafından dikte biraz değişmiş substrat tanıma tercihi, sahip olduğu ortaya kadar GzmB tarafından parçalanan potansiyel hedef hücre moleküllerini açıklayan Erken çalışmalar bazı karışıklığa neden oldu. Bu pro-apoptotik BH3 sadece bölünme incelenmiştir çalışmalarda belirgindiFare GzmB göre çok daha az etkin bir insan tarafından verimli bir şekilde klivaj edilebilir, ancak molekül Teklif. Dokunulmamış hücrelerde, bu fark, doğrudan kaspaz aktivasyonu ile insan mitokondriyal yolu ile, tercihen işletme GzmB ve fare GzmB ile, farklı hücre ölümü yollarının aktivasyonu ile sonuçlanır. Tetrapeptidin dizilerin analizi, insan değil fare GzmB insan ve fare Hedefi 16 hem de tanıma dizisi eşleşen dizisi IEPD, sonra ayırabilecek ortaya koymuştur. Her iki Literatürde ve ticari ürünün tetrapeptid substratı katalog olarak Ac-IEPD-pNA GzmB aktivitesi (Tablo 1) test etmek için genel olarak kullanılmaktadır. Bu iken insan ve fare de çok benzer bir verim ile, Boc-AAD-S-Bzl yarabilir olduğu açıktır, NK hücre lizatlarında fare GzmB (Şekil 2) etkin bir şekilde hidrolize Ac-IEPD-pNA başarısız olur. Bunun aksine, 30 ug ila 10 ug insan NK YT lizat miktarının azaltılması yine resulteYeterli GzmB d Ac-IEPD-pNA alt-tabakanın (Şekil 3) hidroliz etmek.

Şekil 1,
Şekil 1:. Granül enzim aktivitesi murin NK hücrelerinde Granzim B (üst panel) ve B6 vahşi tip ve B6.GrzmB knockout farelerden de NK hücre lizatlarında granzim A (alt panel) aktivitesi Boc- hidrolizinin yüksek oranı ile belirlendi Ala-Ala-Asp-S-Bzl ve N-α-CBZ-L-S-Bzl lisin peptid alt-tabakalar. Veriler üç kopya halinde (n> 3) yapılan temsili bir deneyin tasvir etmektedir.

Şekil 2,
Şekil 2:. Ac-IEPD- pNA alt-tabaka fare ve insan GzmB türe özgül bir hidroliz eşit Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl, hidrolize ancak sadece insan GzmB Ac-IEPD-pNA hidroliz edilmektedir. insanNK hücre hattı YT ve primer, IL-2 bağımlı bir fare NK GzmB bir kaynağı olarak kullanılmıştır. Çubuk grafiği (n> 3) üç kopya halinde gerçekleştirilmiştir, temsilci bir deneyi gösterir.

Şekil 3,
Şekil 3:. GzmB aktivitesini kaldırmak değil protein konsantrasyonundaki azalma insan GzmB neden Ac-IEPD-pNA hidrolizinin oranı, YT NK hücre hattı lizatının azalan protein konsantrasyonu kullanılarak karşılaştırılmıştır. N> 3 için Deneme temsilcisi.

Şekil 4,
Şekil 4:. Deney ilkesi grafik gösterimi GzmB yaran, Boc-AAD-S-Bzl, (A) ve Ac-IEPD-pNA (B), P1 aspartat sonra, bu şekilde serbest alt-tabakalar ya da etkileşim içinde olan bir benzil merkaptan, DTNB flüorojenik 3-karboksi-4-nitrophenoxide iyon (A) oluşturur, ya da doğrudan bir kromofor kendisi (B) p-nitroanilid bırakılmasıyla. Bu iki molekülün floresan emisyon 405 nm'de tespit edilebilir.

Serin proteaz Yüzey Etkinlik
Granzim A N-α-CBZ-L-lisin (BLT) tiyobenzil ester (S-Bzl) Triptazın 22
Granzim B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. Adı geçen N-asetil-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA)
Granzim H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Kimaz 23

Tablo 1:. GzmA ve granzim aktivitesinin tespit edilmesi için uygun alt-tabakaların listesi Triptaz aktivitesi ile özel N-α-CBZ-L-lisin ve hidroliz (BLT) tiyobenzil esteri ile tespit edilebilir (S-Bzl) . GzmB spesifik olarak Boc-Ala-Ala-Asp (ABİ) hidrolizi ile değerlendirilebilir aspartat kalıntıları (Asp-az), sonra yaran -S-Bzl (tespit fare ve insan GzmB aktivite) ya da N-asetil-İle- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA) (sadece insan GzmB etkinliği algılar). GzmH bölgesinin Kimaz aktivitesi Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl bölünmesi ile değerlendirilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tarihsel olarak granzymes hedef hücreler hızlı bir apoptotik ölümünü indükleyebilen sitotoksik lenfositleri (CTL ve NK hücreleri) anahtar etkeni moleküller olarak tespit edilmiştir. Bu, aspartat (D) artıklarının hedef alt-tabaka molekülleri ayrılır ve böylece aşağı doğru hedeflerin çeşitli yanı sıra her ikisi de yaran ön-kaspaz kaspaz kaskadını aktive mümkün GzmB aksiyonu için esas oldu. Bununla birlikte, şu anda GzmB sentezleme lenfoid sitotoksik hücreler ile sınırlı değildir ve bunların fonksiyonu, hedef hücre tanıma ve hücre ölümü ötesine uzatılabilir olduğu takdir edilecektir.

Bu yazıda, basit bir kolorimetrik test kullanılarak fare ve insan CTL / NK hücreleri hem de elde edilen hücre lizatları içinde aktif GzmB saptanmasını sağlayan bir protokol açıklar. Bu protokolün uygulanması başka bir kaynaktan hücresel örneklerinde GzmB incelemek için izin bu bulgularla tespit bu testin sadelik ve özgünlüğüs. Ancak, bu hücre lizatları, en azından 2 mg / ml bir protein konsantrasyonuna sahip ve uygun bir pozitif ve negatif kontroller deney protokolüne dahil edilmesi önemlidir. aktivitesi (Şekil 1) tamamen kayıp olarak GzmB Boc-AAD-SBzl reaktif özgüllüğü, GzmB boş hayvanlardan elde edilen lizat alt tabaka bölünme etkinliğinin olmamasından anlaşılmaktadır. Ileride çalışmalarda böyle bir negatif kontrol (s. Protokol bölüm 1.1) tespit herhangi bir etkinlik GrzB için özel olduğunu doğrulamak için kullanılması tavsiye edilir. (Not: grb gibi, kaspazlar P1 konumunda aspartat kalıntılarında bölünmesi için mutlak bir özgüllüğe sahip olmasına rağmen, P4, amino asit, aynı zamanda özgüllük 24 önemli bir belirleyici olduğu, tercih edilen alt-tabakalar tetrapepetides edilmiştir.). Rekombinant malzemesi alanin mutant proteaz (aktif enzim tam olarak aynı şekilde hazırlanan inaktif proteaz) aktif sitesi serin inceleyerek Eğer ben olmalıncluded ve bu memeli olmayan hücre lizatları, maya ya da bakteri hücreleri, özellikle de tahlil durumunda özellikle önemlidir.

Memeli hücre tahlilleri için yukarıda protokol kullanılarak, GzmB aktivitesi hem de elde edilen hücrelerde, aktif sitotoksik lenfositlerinin (CL) 25 yukarı doğru düzenlenmiş büyük olabilir endojen aynı kökenli serin proteaz inhibitörleri (serpinler) varlığında, tarafından azaltılmaz Dönüştürülmüş hücreler 26 de dahil olmak üzere immün olmayan dokulardan. sitosolik serpinB9, (daha önce PG-9), insan GzmB için son derece spesifik olduğu; ancak fare, serpin B9 veya SPI 6 fare GzmB 27 için önemli bir inhibisyon aktivitesine sahip olan bir çok les yakın ama spesifik ortologlara vardır. NP-40 tampon maddesi içinde erimesi, 37 ° C'de GzmB ve serpin, kuluçkalama ile geri dönüşü olmayan bir etkileşime üretilmesi için izin verilebilir, ancak en uygun kompleks oluşumu 28 için gereklidir. Biz th kompleks oluşumunu tespit yokproteaz aktivitesinin kaybına neden olur western blot, e lizatları. Bu protokol, normal laboratuar çevre sıcaklığında gerçekleştirilir için ~ 22 ° C'ye kadar.

Bu tahliller yapmak deneyimi 20 yıldan fazla itibaren Boc-AAD-SBzl reaktifi ticari kaynağı, sürekli hassas ve güvenilir sonuçlar elde etmek için çok önemli bir husus olduğunu bulduk. Diğer ticari kaynaklar da diğer granzymes aktivitesini tespit etmek için gerekli yüzeyler için uygun olmasına rağmen biz sadece, biz başvurulan satıcı tavsiye ederim. Bu yazıda tarif edilen protokolü kolay Tablo 1 'de gösterildiği gibi olan uygun bir tanıma sekansına sahip sentetik peptit alt tabakasma hidrolizi diğer granül serin proteaz, proteaz etkinliğinin belirlenmesi için adapte edilebilir. N-α-CBZ-L-lisin-S- Bzl alt-tabaka CL farede fare ve insan CL ve teorik GzmK hem GzmA triptaz aktivitesi tespit etmek için kullanılabilir. GzmK mRNA ifadesi grip peptidler 29 yanıt olarak GzmAB gen knockout farelerde elde edilen katil hücreler RT-PCR ile gösterilmiştir, ancak, diğer fizyolojik olarak uygun içerik bu ya da herhangi bir rapor edilmiş olan GzmK proteaz aktivitesinin farkında değildir. Rekombinant insan GzmH veya NK hücrelerinden saflaştırılmış proteazın, ya da aktivitesi ile değerlendirilebilir Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl, 30, ancak özellikle bu Granzim olarak, bu alt-tabakanın hidrolizi atfetmek mümkün değildir Hücre lizatları. Lenfositlerin da kimotripsin-benzeri (kimaz) bir etkinliğe sahip olacak katepsinler, diğer endolysosomal proteazlann bir dizi içerir. Fare, GzmH gen gen (Gzms KF) içindeki (kimaz) etkinliğe sahip olduğu tahmin edilen her bir küme ile değiştirilir.

İnsan GzmB etkin şekilde Teklif BH3- sadece pro-apoptotik molekülü tutunmaya ve bulunmasına karşın doğrudan mitokondriyal meşgulÖlüm yolu 31, görünüşte çelişkili sonuçlar başlangıçta fare GzmB ile elde edilmiştir. Bu karmaşa, proteazlar 16 bulunan dizilerle olan dizi homolojisi yüksek (~% 80) rağmen, tercih edilen bir alt-tabaka tanıma sekansı, fare ve insan (ve sıçan) GzmB arasında farklılık tespit bir çok araştırmacı tarafından zarif çalışmaları ile karar verildi 17,23. İnsan GzmB için en uygun tanıma sekansı / V, E / E / Q, P / Xaa, I, (S / T) fare GzmB için ise P1 konumunda ve M / G / V, I, F / Y / Q, D 16,17. Özellikle P GzmB substrat bağlayıcı yarık tarafından ağırladı olmaz fare GzmB, dolayısıyla fare Teklif (IEPD 75) bölünme sitesi tarafından tolere edilmez gibi önemli fark, P2 konumunda idi. Bundan başka, sentetik peptid alt-tabakalar rutin GzmB için spesifik olarak tarif IEPD-pNA, ve IETD-pNA, kötü fare GzmB ile hidrolize edilir. Biz daha başkaları 23 kullanılarak yeniden yapılan bulguyu konsolide varbirleşmesini insan GzmB, ama fare NK ve CTL hidrolize IETD-pNA ve IEPD-pNA içinde mevcut GzmB değil granzymes. Kaiserman ve ark. 17 rekombinant insan yarılma aktivitesi göre ve fare GrB Ac-IETD-pNA alt-tabakalar ile, Boc-AAD-SBzl kullanılarak Pichia pastoris imal edilmektedir. Benzer şekilde, yazarlar bir etkinlikte, fare grb tarafından Ac-IETD-pNA hidroliz ile, Boc-AAD-SBzl bölünen her iki enzim iken daha az verimli 30 misli olduğunu ortaya koymuştur. P2 konumunda T ve P, (aynı zamanda G) insan GzmB tercih edilir olsa da, bu fare GzmB tolere edilmez. Aksine, açıkça daha genel Boc-AAD-SBzl bir reaktif kullanılarak, insan ve fare NK hücre lizatları hem de karşılaştırılabilir GzmB aktivite göstermiştir. Bununla birlikte, sadece insan GzmB aktivitesi IEPD-pNA maddesi ile tespit edilebilir.

Birlikte bu bulgular farklı türlerin GzmB ince özgüllük farklılıklar seçmek için nasıl büyük bir etkiye sahip olabilir gerçeğini vurgulamakin vitro analizi için uygun bir alt-tabaka. Fare, insan ve sıçan GzmB aktivite taramasının incelenmiştir Özetle, Boc-AAD-SBzl tercih substrattır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195, (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19, (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173, (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159, (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108, (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44, (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183, (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90, (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30, (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1, (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80, (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30, (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282, (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175, (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188, (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131, (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176, (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269, (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176, (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272, (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18, (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84, (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272, (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16, (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274, (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192, (10), 1403-1414 (2000).
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl hidrolizi, A Kolorimetrik Özellikle Granzim B proteolitik aktivitesini ölçer Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter