Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

Et kolorimetrisk assay, der specifikt måler Granzyme B proteolytisk aktivitet: Hydrolyse af Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

doi: 10.3791/52419 Published: November 28, 2014

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Granzymer er en familie af serinproteaser fundet i sekretoriske lysosomer af naturlige dræber (NK) celler og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) 1. Der er fem forskellige granzymer i mennesker (A, B, H, K og M), og ti mus (A - G, K, M og N) 2,3. Granzyme A og Granzyme B (GzmA, GzmB) er den mest rigelige og er blevet grundigt undersøgt i det menneskelige og gnaver indstilling.

Den klassiske funktion GzmB er induktion af apoptose i målceller udført i forbindelse med poredannende protein perforin, som tillader granzym adgang til målcellen cytosol 4. Selv GzmB ekspression utvetydigt findes i cytotoksiske lymfocytter, har nylige studier beskæftiget sig en række andre GzmB-udtrykkende celletyper, herunder, men ikke begrænset til keratinocytter 5, basofiler 6, mastceller 7, plasmacytoide dendritiske celler 8, og B-celler 9, 10.I den forbindelse blev der ikke apoptotiske GzmB funktioner afsløret lige fra deltagelse i inflammatoriske processer, vævsombygning og andre immunregulerende egenskaber 11-14.

Eftersom der er blevet foreslået en bredere biologiske rolle for GzmB end tidligere formodet, forskerne have pålidelige og konkrete værktøjer til sin opdagelse. Af fordel er GzmB specifikke krav om at spalte på carboxylsiden af asparaginsyrerester, en ejendom unik blandt eukaryote serinproteaser 15. Mus, human og rotte GzmB er strukturelt meget ens, men den udvidede substratspecificitet af muse GzmB adskiller diskret fra både human og rotte 16, hvilket betyder, at visse generiske substrater med Asp i terminalen (P1) kan spaltes effektivt af GzmB fra alle tre arter, kan mens andre substrater med mere komplicerede sekvenser opstrøms af P1 giver vidt forskellige resultater. I både fortiden og nyere literature har denne kendsgerning forårsaget betydelig forvirring og fejlfortolkning af den biologiske betydning af nogle eksperimentelle resultater, selv om nøje kontrolleret, har kinetiske undersøgelser forsøgt at rette op på situationen 17.

I dette papir har vi forsøgt at illustrere disse punkter ved hjælp af to kommercielt tilgængelige substrater, nemlig Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl og N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid. De to reagenser gøre generere forskellige reaktive grupper efter spaltning (en gratis sulphydryl versus en fluorescerende gratis paranitroanilid), men dette har ingen indvirkning på proteolytisk spaltning. Den beskrevne protokol er en moderne tilpasning af en meget gammel protokol 18, men skal hjælpe efterforskerne til at bruge de forskellige GzmB substrater passende, og giver samtidig en metodologisk ramme til påvisning af aktiviteten af andre granzymer såsom GzmA og GzmH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

BEMÆRK: Milte blev afledt fra mus (6-10 uger gamle) og alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de dyreetiske retningslinjer for Peter MacCallum Cancer Center (E486).

1. Fremstilling af prøver.

  1. Fremstilling af aktiverede muse NK-celler.
    1. Isoler primære naive NK-celler fra encellede suspensioner af milt fra C57BL / 6 eller B6.GrzmB - / - (GzmB gen null) mus ved negativ selektion ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits.
    2. Følg fabrikanternes protokol. Kort fortalt magnetisk label "non-NK" celler, såsom T- og B-celler, dendritiske celler, granulocytter, makrofager og røde blodlegemer under anvendelse af biotin-konjugeret antistoffer mod deres specifikke overflade markører. Brug magnetisk separation med anti-biotin perler at udtømme "ikke-NK" celler.
    3. Kultur isoleret NK-celler i 5-7 dage i medium indeholdende IL-2 (1.000 U / ml) ved 700.000 celler / ml i 24-brønds pladerved 37   ° C.
    4. Alternativt brug aktiverede T-celler 19, primær antigen-begrænsede CTL fra OT1 T-cellereceptor transgene mus 20, CTL genereret i blandede lymfocytkulturer 21 eller supernatanter fra aktiverede NK-celler til at bestemme aktiviteten af udskilt GzmB 19.
  2. Vedligeholdelse af human NK-cellelinje og isolering af primære NK celler.
    1. Oprethold human NK leukæmi (YT-celler) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium suppleret med 10% føtalt kalveserum. Alternativt rense primære NK-celler fra perifert blod fra raske forsøgspersoner og stimulere i 2-3 dage i medium indeholdende IL-2 ved 100 U / ml som tidligere beskrevet 22.
  3. Dannelse af cellelysater.
    1. Vask cellerne tre gange i PBS (pH 7,4), og derefter suspendere Nonidet P-40 lysisbuffer (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Ideelt set lysere mindst 5 x 10 6 7 T-celler i 100 pi buffer. Tilføj ikke proteasehæmmere, som mange er irreversible inhibitorer af serinproteaser, særlig tryptaser såsom GzmA. Inkuber på is i 20 min, og derefter pelletere kernerne i en mikrocentrifuge ved 15.000 xg i 10 min. Kassér det nukleare pellet og overføre supernatanten til et frisk rør.
  4. Bestem proteinkoncentration lysaterne.
    1. Brug en kommercielt tilgængelig protokol valg, såsom Bradford eller bicinchoninsyre (BCA) og bestemme proteinkoncentrationen. Sørg for, at koncentrationen er ~ 2 mg / ml minimum. Store lysater ved -20 ° C indtil (granzym aktivitet er stabil i flere måneder ved -20 ° C).

2. Granzyme B Activity Assay

  1. Fremstilling af reagenser
    1. Forbered en 10 mM bestand af substrater (Boc-AAD-S-Bzl eller Ac-IEPD-PNA) i DMSO (~ 5 mg / ml) og opbevares i portioner ved -20 & #176; C. Forbered en fortynding, frisk og kasseres efter hver dag, som Boc-AAD-S-Bzl delvist hydrolyserer på opbevaring i DMSO.
    2. Der fremstilles en 250 mM stamopløsning af den kolorimetriske reagens (5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoesyre), DTNB) i DMSO (0,09 g / ml) og opbevares ved -20 ° C. Forbered en frisk arbejdsdag fortynding hver dag. Dette reagens er kun nødvendig for substrater med SBzl indikator grupper, ikke pNA.
    3. Der fyldes op frisk buffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl2, pH 7,3) hver 2-3 uger.
  2. Bring DTNB og syntetiske substrater til stuetemperatur. Fortyndes substrater (1:16, fx 100 pi i 1,6 ml buffer) og DTNB (1: 250, f.eks 10 pi i 2,5 ml buffer) og blandes godt.
  3. Fortynd mindst 100 ug protein lysat af hver prøve i buffer til et endeligt volumen på 160 pi. Ved hjælp af en multikanal pipette tilsættes 50 pi per brønd i tre eksemplarer (~ 33,3 ug / brønd) i en '' U '' bottom vinyl 96-brønds plade.Omfatte en "buffer-only" kontrol (også i triplikat).
  4. Tilsæt 100 pi fortyndet DTNB til prøver / buffer-kontrol (udelad dette trin, når der arbejdes med Ac-IEPD-pNA.
    BEMÆRK: Spaltning af Ac-IEPD-pNA ved GzmB direkte frigiver fluorogen pNA (figur 4B).
  5. Brug en multikanalpipette til hurtigt at tilføje 50 pi fortyndet substrater til hvert sæt af triplikater, startende med buffer derefter eventuelle negative kontroller og efterbehandling med forventede positive prøver.
  6. Pladen anbringes i pladelæseren. Mål Asp-ase-aktivitet ved hydrolyse af Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA i en mikropladelæser ved OD 405 nm. Brug en kinetisk assay-protokol, tage 25 målinger, hver 15 sek (ca. 6 min samlede læsning tid).
  7. Brug absorbanslæsninger genereret ved hvert tidspunkt manuelt for beregningen af ​​substrat spaltning hvis pladelæser software ikke kan generere en værdi for Vmax.

3. Analyse af Data

BEMÆRK: De data, der genereres præsenteres som maksimal hastighed, der defineres som ændring i OD over tid (MOD / min).

  1. For at analysere dataene, fastlægge maksimale substratspaltning, som beregnes ud fra ændringen i absorbans. Gør dette automatisk ved hjælp af pladelæser software, som typisk har denne mulighed.
  2. Alternativt efter visning de kinetiske parceller på ændring i absorbans, der opstår i løbet af den kinetiske analyse på pladelæseren, manuelt vælge de datapunkter, der giver den stejleste lige linje. For de fleste analyser den maksimale sats nås inden for de første 2 min af analysen.
  3. Fratræk den oprindelige OD-aflæsning fra det højeste OD-aflæsning på denne lige linje og dividere med tidsintervallet. Overfør rådata til Microsoft Excel / Graph pad til statistisk analyse og grafisk display.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Boc-AAD-S-Bzl substrat er specifik for GzmB

Den serinprotease GzmB er en væsentlig bestanddel af cytotoksiske lymfocytter (CTL og NK-celler) og er hovedsageligt ansvarlig for at inducere hurtig apoptotisk død i målceller, såsom virusinficerede eller transformeret celler. Dette skyldes i høj grad dets substrat præference for spaltning efter bestemte aspartatrester i udvalgte proteiner, en egenskab deles med caspaserne, som også spalter efter aspartatrester men er fra en anden klasse af proteaser, cystein protease familien 15. Denne forskel i den proteolytiske mekanisme betyder, at AAD-SBzl ikke kan spaltes af en caspase. GzmB ekspression induceres efter aktivering af cytotoksiske lymfocytter og enzymatisk aktivitet kan overvåges i cellelysater fremstillet ud fra disse celler (figur 1). Tilgængeligheden af ​​granzym gen knockout-mus har tilladt os at fastslå, atdet syntetiske peptidsubstrat Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) - thiobenzyl ester (S-Bzl) er specifikt hydrolyseret af GzmB. Kan måles Robust spaltning af det syntetiske substrat i et cellelysat fra B6 primære NK-celler, men ikke i B6.GrzmB - / - NK-celler. Som en kontrol, den proteolytiske aktivitet af GzmA, som har trypsinlignende (tryptase) substratspecificitet og er til stede i begge lysater var ækvivalent, målt ved hydrolyse af N-α-CBZ-L-lysin (BLT) -S- Bzl.

Arter-specifikke GzmB substratgenkendelse sekvens

Tidlige studier, der beskriver potentielle mål celle molekyler spaltes af GzmB forårsagede nogen forvirring, indtil det viste sig, at mus og human GzmB har en lidt ændret præference substrat anerkendelse, som er dikteret af så mange som 8-10 rester kortlægning omkring P1 aspartat 23. Dette var særlig tydeligt i forsøg som undersøgte spaltning af kun BH3 den pro-apoptotiskemolekyle bud, der kan spaltes effektivt af mennesker, men langt mindre effektivt af mus GzmB. I intakte celler, resulterer denne forskel i aktivering af forskellige celledødsveje, med human GzmB opererer fortrinsvis gennem mitokondrie pathway og mus GzmB via caspaseaktivering direkte. Analyse af tetrapeptid sekvenser afslørede, at humane, men ikke muse GzmB kunne spalte efter sekvensen IEPD, som matcher genkendelsessekvensen i både human og muse Bid 16. I både litteraturen og i kommercielt produkt kataloger tetrapeptidet substrat, har Ac-IEPD-pNA været anvendt generisk til at teste for GzmB aktivitet (tabel 1). Det er nu klart, at mens både mennesker og mus kan spalte Boc-AAD-S-Bzl, med meget lignende effektivitet, mus GzmB i NK cellelysater ikke effektivt hydrolyse Ac-IEPD-pNA (figur 2). I modsætning hertil stadig reducere mængden af ​​human NK YT lysatet fra 30 ug til 10 ug resulted tilstrækkelig GzmB at hydrolysere Ac-IEPD-pNA substrat (figur 3).

Figur 1
Figur 1:. Granule enzymaktivitet i murine NK-celler Granzyme B (øverste panel) og granzym A (nederste del) aktivitet i NK cellelysater fra B6 vildtype og B6.GrzmB knockout-mus blev bestemt ved den maksimale hydrolyse af Boc- Ala-Ala Asp-S-Bzl og N-α-CBZ-L-lysin-S-Bzl peptidsubstrater. Dataene skildre en repræsentativt eksperiment udført tre gange (n> 3).

Figur 2
Figur 2:. Artsspecifikt hydrolyse af Ac-IEPD- pNA substrat Mouse og menneskelig GzmB hydrolyseret Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl lige, men kun menneskelig GzmB hydrolyseret Ac-IEPD-pNA. Den humaneNK-cellelinjen YT og primær IL-2 aktiverede muse NK blev anvendt som en kilde til GzmB. Søjlediagram viser et repræsentativt eksperiment udført tre gange (n> 3).

Figur 3
Figur 3:. Reduktion i proteinkoncentration ikke ophæver GzmB aktivitet Satsen for hydrolyse af Ac-IEPD-pNA fremkaldt af menneskelig GzmB blev sammenlignet ved anvendelse af faldende protein koncentration af YT NK cellelinje lysat. Eksperiment repræsentant for n> 3.

Figur 4
Figur 4:. Grafisk afbildning af assayprincip GzmB spalter substraterne Boc-AAD-S-Bzl (A) og Ac-IEPD-pNA (B) efter P1 aspartat, for derved at frigive enten en benzylmercaptan, som igen interagerer med DTNB at danne et fluorogent 3-carboxy-4-nitrophenoxid ion (A), eller ved direkte at frigive p-nitroanilid, som er en kromofor selv (B). Fluorescens emissionen af ​​begge disse molekyler kan detekteres ved 405 nm.

Serinprotease Substrat Aktivitet
Granzyme A N-α-CBZ-L-lysin (BLT) thiobenzyl ester (S-Bzl) Tryptase 22
Granzyme B 1. Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl ASPase 14
2. N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA)
Granzyme H Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl Chymase 23

Tabel 1:. Liste over tilgængelige substrater til påvisning af granzym aktivitet Tryptase aktivitet GzmA kan detekteres ved hydrolyse af den specifikke N-α-CBZ-L-lysin (BLT) thiobenzyl ester (S-Bzl) . GzmB specifikt spalter efter aspartatrester (Asp-ASE), som kan vurderes ved hydrolyse af enten Boc-Ala-Ala-Asp (AAD) -S-Bzl (detekterer muse og human GzmB aktivitet) eller N-acetyl-Ile- Glu-Pro-Asp (IEPD) -p-nitroanilid (pNA) (kun detekterer human GzmB aktivitet). Chymase aktivitet GzmH vurderes ved spaltning af Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Historisk set granzymer blev identificeret som vigtige effektor molekyler af cytotoksiske lymfocytter (CTL og NK-celler) der er i stand til at inducere en hurtig apoptotisk død i målceller. Det var hovedsageligt på grund af virkningen af ​​GzmB, som spaltede målsubstratet molekyler på aspartat (D) restprodukter og dermed var i stand til at aktivere caspasekaskaden af ​​begge spalter pro-caspaser, samt flere af deres downstream mål. Imidlertid er det nu klart, at GzmB ekspression ikke er begrænset til lymfoide cytotoksiske celler og dens funktion kan forlænges langt ud målcelle anerkendelse og celledød.

I dette papir beskrives en protokol, der muliggør påvisning af aktiv GzmB i cellelysater afledt fra både murine og humane CTL / NK-celler ved hjælp af en simpel kolorimetrisk assay. Enkelheden og særlige ved dette assay som konstateres ved disse resultater muliggør anvendelsen af ​​denne protokol til at undersøge GzmB i celleprøver fra andre kilders. Det er imidlertid vigtigt, at de cellulære lysater har en proteinkoncentration på mindst 2 mg / ml, og passende positive og negative kontroller inkluderet i forsøgsprotokollen. Specificiteten af Boc-AAD-SBzl reagens til GzmB fremgår af manglen på substrat-spaltning aktivitet i lysatet afledt fra GzmB null dyr, da aktiviteten fuldstændig tabt (figur 1). I eventuelle fremtidige undersøgelser anbefales det, at en sådan negativ kontrol (s. Protokol afsnit 1.1) bruges til at kontrollere, at enhver aktivitet, der registreres, er specifik for GrzB. (Bemærk: Selvom ligesom GrB, caspaser har en absolut specificitet for spaltning ved aspartatrester i P1 position, foretrukne substrater er tetrapepetides hvor P4 aminosyre er også en kritisk faktor for specificitet. 24). Hvis behandlingen rekombinant materiale det aktive site serin til alanin mutant protease (inaktiv protease fremstillet på nøjagtig samme måde som den aktive enzym) bør være included, og dette er især vigtigt, hvis analyse ikke-mammale cellelysater, især dem fra gær eller bakterieceller.

Ved hjælp af ovennævnte protokol til assays af pattedyrceller, er GzmB aktivitet ikke formindskes ved tilstedeværelsen af endogene sammenhørende serinproteaseinhibitorer (Serpins), som kan være meget opreguleret i aktiverede cytotoksiske lymfocytter (CL) 25, såvel som i celler afledt fra ikke-immune væv, herunder transformerede celler 26. Den cytosoliske serpinB9 (tidligere PI-9) er meget specifikt for humant GzmB; men i mus, der er flere nære men les specifikke orthologer som serpin B9 eller SPI-6 har signifikant inhibitorisk aktivitet for muse GzmB 27. Selv lysis i NP-40-puffer kan være eftergivende til at generere en irreversibel vekselvirkning mellem GzmB og serpin, inkubation ved 37 ° C er påkrævet for optimal kompleksdannelse 28. Vi har ikke afsløre kompleksdannelse i the lysater ved Western blot, hvilket ville resultere i tab af protease aktivitet. Denne protokol udføres ved typisk omgivelsestemperatur laboratorium temperatur op til ~ 22 ° C.

Fra mere end 20 års erfaring at udføre disse analyser, vi har fundet, at den kommercielle kilde til Boc-AAD-SBzl reagenset af indretningsdesign betydning for at opnå konsistente, følsomme og pålidelige resultater. Vi ville kun anbefale leverandør vi har refereres, selvom andre kommercielle kilder er også egnede til de substrater, der kræves til at detektere aktiviteten af ​​andre granzymer. Beskrevet i dette dokument protokol kan let tilpasses til bestemmelse af proteaseaktivitet af andre granula serinproteaser ved hydrolyse af syntetiske peptidsubstrater med en passende genkendelsessekvens som anført i tabel 1. The N-α-CBZ-L-lysin-S- Bzl substrat kan anvendes til påvisning af tryptase aktivitet både GzmA i muse og human CL og teoretisk GzmK i muse CL. Selvom GzmK mRNA-ekspression er blevet påvist ved RT-PCR i dræberceller genereret fra GzmAB gen knockout-mus som reaktion på influenza-peptider 29, vi ikke er opmærksomme på GzmK proteaseaktivitet er blevet rapporteret i dette eller andre fysiologisk relevant kontekst. Aktiviteten af enten rekombinant human GzmH eller proteasen oprenset fra NK-celler, kan vurderes med Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl 30, men det er ikke muligt at tilskrive hydrolyse af dette substrat specifikt til denne granzym i cellelysater. Lymfocytter indeholder en række andre endolysosomal proteaser såsom cathepsiner, der også vil have chymotrypsin-lignende (chymase) aktivitet. Hos mus er GzmH genet erstattet af en klynge af gener (Gzms CF) alle forventes at have lignende (chymase) aktivitet.

Selvom human GzmB blev fundet effektivt spalte BH3 kun pro-apoptotisk molekyle Bid og dermed indgreb direkte mitokondriedød pathway 31, tilsyneladende modstridende resultater blev oprindeligt opnået med mus GzmB. Denne forvirring blev løst ved elegante undersøgelser af en række forskere, der bestemmes, at den foretrukne sekvens substrat anerkendelse afveg mellem muse og human (og rotte) GzmB, trods den høje grad (~ 80%) af den samlede sekvenshomologi af proteaser 16, 17,23. Den optimale sekvens for human GzmB anerkendelse I / V, E / M / Q, P / Xaa (S / T) og D i P1 position mens den for mus GzmB er L / I / V, E, F / J / Q, D 16,17. Den største forskel var på P2 position, som P især ikke tolereres af mus GzmB, dermed musen Byd (IEPD 75) spaltningsstedet ville ikke imødekommes af GzmB substratbindende kløft. Desuden de syntetiske peptidsubstrater IEPD-PNA rutinemæssigt beskrevet som specifikke for GzmB, og IETD-PNA dårligt hydrolyseres af mus GzmB. Vi har yderligere konsolideret konstatering af andre 23 Brug recombinant granzymer at menneskelig GzmB, men ikke GzmB stede i muse NK og CTL hydrolyserer IETD-pNA og IEPD-pNA. Kaiserman et al. 17 sammenlignet spaltningen aktivitet af rekombinant human og mus GrB fremstillet i Pichia pastoris ved anvendelse af Boc-AAD-SBzl med Ac-IETD-pNA substrater. Ligeledes fandt forfatterne, at mens begge enzymer spaltes Boc-AAD-SBzl med sammenlignelig effektivitet, hydrolyse af Ac-IETD-pNA ved mouse GrB var 30 gange mindre effektiv. Mens T og P (samt S) i P2 position er foretrukket af menneskelig GzmB, er de ikke tolereres mus GzmB. Derimod vi tydeligt demonstreret sammenlignelige GzmB aktivitet i både mennesker og mus NK cellelysater ved hjælp af mere generisk Boc-AAD-SBzl reagens. Imidlertid kunne kun menneskelig GzmB aktivitet påvises med IEPD-pNA reagens.

Disse resultater viser sammen, at forskelle i den fine specificitet GzmB af forskellige arter kan have stor indflydelse på, hvordan du vælgeret passende substrat til in vitro-analyse. I oversigt, hvis detektering af mus, menneske eller rotte GzmB aktivitet undersøges, Boc-AAD-SBzl er substratet valg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SMSB05 Granzyme B substrate (mouse and human)
Ac-IEPD-pNA  SM Biochemicals LLC, CA SMPNA009 Granzyme B substrate (only human)
N-α-CBZ-L-lysine-S-Bzl Sigma-Aldrich C3647 Granzyme A substrate
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl SM Biochemicals LLC, CA SB025 Granzyme H substrate
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid)  Sigma-Aldrich D8130 DTNB, Ellman’s Reagent
NK cell isolation kit II mouse Miltenyi Biotec GmbH 130-096-892 negative selection kit
NK cell isolation kit human Miltenyi Biotec GmbH 130-092-657 negative selection kit
Plate reader Biorad iMark Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate Corning, MA, USA 2797

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapani, J. A., Browne, K. A., Dawson, M., Smyth, M. J. Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody). Biochem Biophys Res Commun. 195, (2), 910-920 (1993).
  2. Ewen, C. L., Kane, K. P., Bleackley, R. C. A quarter century of granzymes. Cell Death Differ. 19, (1), 28-35 (2012).
  3. Hoves, S., Trapani, J. A., Voskoboinik, I. The battlefield of perforin/granzyme cell death pathways. J Leukoc Biol. (2009).
  4. Peters, P. J., et al. Cytotoxic T lymphocyte granules are secretory lysosomes, containing both perforin and granzymes. J Exp Med. 173, (5), 1099-1109 (1991).
  5. Berthou, C., et al. Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense. J Immunol. 159, (11), 5293-5300 (1997).
  6. Tschopp, C. M., et al. Granzyme B, a novel mediator of allergic inflammation: its induction and release in blood basophils and human asthma. Blood. 108, (7), 2290-2299 (2006).
  7. Strik, M. C., et al. Human mast cells produce and release the cytotoxic lymphocyte associated protease granzyme B upon activation. Mol Immunol. 44, (14), 3462-3472 (2007).
  8. Jahrsdorfer, B., et al. Granzyme B produced by human plasmacytoid dendritic cells suppresses T cell expansion. Blood. (2009).
  9. Hagn, M., et al. Human B cells secrete granzyme B when recognizing viral antigens in the context of the acute phase cytokine IL-21. J Immunol. 183, (3), 1838-1845 (2009).
  10. Hagn, M., et al. Human B cells differentiate into granzyme B-secreting cytotoxic B lymphocytes upon incomplete T-cell help. Immunol Cell Biol. 90, (4), 457-467 (2012).
  11. Froelich, C. J., Pardo, J., Simon, M. M. Granule-associated serine proteases: granzymes might not just be killer proteases. Trends Immunol. 30, (3), 117-123 (2009).
  12. Hagn, M., Jahrsdorfer, B. Why do human B cells secrete granzyme B? Insights into a novel B-cell differentiation pathway. Oncoimmunology. 1, (8), 1368-1375 (2012).
  13. Susanto, O., Trapani, J. A., Brasacchio, D. Controversies in granzyme biology. Tissue Antigens. 80, (6), 477-487 (2012).
  14. Walch, M., et al. Cytotoxic cells kill intracellular bacteria through granulysin-mediated delivery of granzymes. Cell. 157, (6), 1309-1323 (2014).
  15. Odake, S., et al. Human and murine cytotoxic T lymphocyte serine proteases: subsite mapping with peptide thioester substrates and inhibition of enzyme activity and cytolysis by isocoumarins. Biochemistry. 30, (8), 2217-2227 (1991).
  16. Casciola-Rosen, L., et al. Mouse and human granzyme B have distinct tetrapeptide specificities and abilities to recruit the bid pathway. J Biol Chem. 282, (7), 4545-4552 (2007).
  17. Kaiserman, D., et al. The major human and mouse granzymes are structurally and functionally divergent. J Cell Biol. 175, (4), 619-630 (2006).
  18. Powers, J. C., Kam, C. M. Peptide thioester substrates for serine peptidases and metalloendopeptidases. Methods Enzymol. 248, 3-18 (1995).
  19. Hagn, M., et al. Activated mouse B cells lack expression of granzyme. B. J Immunol. 188, (2), 3886-3892 (2012).
  20. Konjar, S., et al. Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L. Immunology. 131, (2), 257-267 (2010).
  21. Sutton, V. R., et al. Residual active granzyme B in cathepsin C-null lymphocytes is sufficient for perforin-dependent target cell apoptosis. J Cell Biol. 176, (4), 425-433 (2007).
  22. Trapani, J. A., Smyth, M. J., Apostolidis, V. A., Dawson, M., Browne, K. A. Granule serine proteases are normal nuclear constituents of natural killer cells. J Biol Chem. 269, (28), 18359-18365 (1994).
  23. Cullen, S. P., Adrain, C., Luthi, A. U., Duriez, P. J., Martin, S. J. Human and murine granzyme B exhibit divergent substrate preferences. J Cell Biol. 176, (4), 435-444 (2007).
  24. Thornberry, N. A., et al. A combinatorial approach defines specificities of members of the caspase family and granzyme B. Functional relationships established for key mediators of apoptosis. J Biol Chem. 272, (29), 17907-17911 (1997).
  25. Bird, C. H., et al. Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway. Mol Cell Biol. 18, (11), 6387-6398 (1998).
  26. Bots, M., Medema, J. P. Serpins in T cell immunity. J Leukoc Biol. 84, (5), 1238-1247 (2008).
  27. Sun, J., et al. A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9). J Biol Chem. 272, (24), 15434-15441 (1997).
  28. Bird, C. H., Hitchen, C., Prescott, M., Harper, I., Bird, P. I. Immunodetection of granzyme B tissue distribution and cellular localisation. Methods Mol Biol. 844, 237-250 (2012).
  29. Jenkins, M. R., et al. Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing. Cell Death Differ. 16, (4), 537-542 (2009).
  30. Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes. J Biol Chem. 274, (43), 30468-30473 (1999).
  31. Sutton, V. R., et al. Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation. J Exp Med. 192, (10), 1403-1414 (2000).
Et kolorimetrisk assay, der specifikt måler Granzyme B proteolytisk aktivitet: Hydrolyse af Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).More

Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. J. Vis. Exp. (93), e52419, doi:10.3791/52419 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter