We describe a simple, quantitative colorimetric assay that specifically measures the proteolytic activity of human, mouse or rat Granzyme B (GzmB). This protocol can be easily adapted for determining protease activity of other granule serine proteases by the hydrolysis of other synthetic peptide substrates with an appropriate recognition sequence.
The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is the most studied granzyme in humans and mice and therefore, researchers need specific and reliable tools to study its function and role in pathophysiology. This especially necessitates assays that do not recognize proteases such as caspases or other granzymes that are structurally or functionally related. Here, we apply GzmB’s preference for cleavage after aspartic acid residues in a colorimetric assay using the peptide thioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl. GzmB is the only mammalian serine protease capable of cleaving this substrate. The substrate is cleaved with similar efficiency by human, mouse and rat GzmB, a property not shared by other commercially available peptide substrates, even some that are advertised as being suitable for this purpose. This protocol is demonstrated using unfractionated lysates from activated NK cells or CTL and is also suitable for recombinant proteases generated in a variety of prokaryotic and eukaryotic systems, provided the correct controls are used. This assay is a highly specific method to ascertain the potential pro-apoptotic activity of cytotoxic molecules in mammalian lymphocytes, and of their recombinant counterparts expressed by a variety of methodologies.
Granzymer er en familie af serinproteaser fundet i sekretoriske lysosomer af naturlige dræber (NK) celler og cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) 1. Der er fem forskellige granzymer i mennesker (A, B, H, K og M), og ti mus (A – G, K, M og N) 2,3. Granzyme A og Granzyme B (GzmA, GzmB) er den mest rigelige og er blevet grundigt undersøgt i det menneskelige og gnaver indstilling.
Den klassiske funktion GzmB er induktion af apoptose i målceller udført i forbindelse med poredannende protein perforin, som tillader granzym adgang til målcellen cytosol 4. Selv GzmB ekspression utvetydigt findes i cytotoksiske lymfocytter, har nylige studier beskæftiget sig en række andre GzmB-udtrykkende celletyper, herunder, men ikke begrænset til keratinocytter 5, basofiler 6, mastceller 7, plasmacytoide dendritiske celler 8, og B-celler 9, 10.I den forbindelse blev der ikke apoptotiske GzmB funktioner afsløret lige fra deltagelse i inflammatoriske processer, vævsombygning og andre immunregulerende egenskaber 11-14.
Eftersom der er blevet foreslået en bredere biologiske rolle for GzmB end tidligere formodet, forskerne have pålidelige og konkrete værktøjer til sin opdagelse. Af fordel er GzmB specifikke krav om at spalte på carboxylsiden af asparaginsyrerester, en ejendom unik blandt eukaryote serinproteaser 15. Mus, human og rotte GzmB er strukturelt meget ens, men den udvidede substratspecificitet af muse GzmB adskiller diskret fra både human og rotte 16, hvilket betyder, at visse generiske substrater med Asp i terminalen (P1) kan spaltes effektivt af GzmB fra alle tre arter, kan mens andre substrater med mere komplicerede sekvenser opstrøms af P1 giver vidt forskellige resultater. I både fortiden og nyere literature har denne kendsgerning forårsaget betydelig forvirring og fejlfortolkning af den biologiske betydning af nogle eksperimentelle resultater, selv om nøje kontrolleret, har kinetiske undersøgelser forsøgt at rette op på situationen 17.
I dette papir har vi forsøgt at illustrere disse punkter ved hjælp af to kommercielt tilgængelige substrater, nemlig Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl og N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-nitroanilid. De to reagenser gøre generere forskellige reaktive grupper efter spaltning (en gratis sulphydryl versus en fluorescerende gratis paranitroanilid), men dette har ingen indvirkning på proteolytisk spaltning. Den beskrevne protokol er en moderne tilpasning af en meget gammel protokol 18, men skal hjælpe efterforskerne til at bruge de forskellige GzmB substrater passende, og giver samtidig en metodologisk ramme til påvisning af aktiviteten af andre granzymer såsom GzmA og GzmH.
Historisk set granzymer blev identificeret som vigtige effektor molekyler af cytotoksiske lymfocytter (CTL og NK-celler) der er i stand til at inducere en hurtig apoptotisk død i målceller. Det var hovedsageligt på grund af virkningen af GzmB, som spaltede målsubstratet molekyler på aspartat (D) restprodukter og dermed var i stand til at aktivere caspasekaskaden af begge spalter pro-caspaser, samt flere af deres downstream mål. Imidlertid er det nu klart, at GzmB ekspression ikke er begrænset til lymf…
The authors have nothing to disclose.
This work received support through grant HA 6136/1-1 from the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) to MH. JAT is supported by Program and Project Grants from the National Health and Medical Research Council of Australia.
Product | Company | Catalogue number | Comment/description |
Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SMSB05 | Granzyme B substrate (mouse and human) |
Ac-IEPD-pNA | SM Biochemicals LLC, CA | SMPNA009 | Granzyme B substrate (only human) |
N-a-CBZ-L-lysine-S-Bzl | Sigma-Aldrich | C3647 | Granzyme A substrate |
Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl | SM Biochemicals LLC, CA | SB025 | Granzyme H substrate |
5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoic acid) | Sigma-Aldrich | D8130 | DTNB, Ellman’s Reagent |
NK cell isolation kit II mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-096-892 | negative selection kit |
NK cell isolation kit human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-657 | negative selection kit |
Plate reader | Biorad iMark | Biorad Microplate Manager Software Version MPM6.3 | |
Serocluster U-bottom vinyl 96-well plate | Corning, MA, USA | 2797 |