Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

Michael Tu; Fang Wei; Jieping Yang; David Wong

doi:10.3791/52439

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Article de méthode

Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

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DOI :

10.3791/52439

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23 janvier 2015

Michael Tu¹ , Fang Wei¹ , Jieping Yang² , David Wong¹

¹School of Dentistry, University of California, Los Angeles, ²School of Medicine, Clinical Nutrition, University of California, Los Angeles

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Résumé

Les exosomes sont des structures microvésiculaires présentes dans les biofluides qui peuvent porter d’importants biomarqueurs discriminants de maladies. Ici, une nouvelle méthode est utilisée pour extraire spécifiquement les exosomes et tester rapidement la cargaison exosomale pour les cibles ARN/protéines après la perturbation des exosomes à l’aide d’ondes carrées cycliques électriques non uniformes.

Résumé

Les exosomes sont des structures microvésiculaire qui jouent un rôle de médiateur dans la communication intercellulaire. Il est intéressant d'étudier la cargaison interne des exosomes pour déterminer si elles sont porteuses de maladies biomarqueurs discriminatoires. Pour effectuer une analyse de exosomal, il est nécessaire de mettre au point un procédé d'extraction et d'analyse des exosomes à partir de fluides biologiques cibles sans endommager le contenu interne.

Libération induite de champ électrique et de mesure (EFIRM) est une méthode pour extraire spécifiquement exosomes de biofluides, le déchargement de leur cargaison, et de tester leur contenu ARN / protéines interne. Utilisation d'un anticorps CD63 spécifique microparticule magnétique anti-humain, les exosomes sont tout d'abord précipités à partir de fluides biologiques. Après extraction, basse tension électriques des ondes carrées cycliques (CCF) sont appliqués à rompre la membrane vésiculaire et provoquer déchargement de marchandises. Le contenu de la exosomes est hybridée à des amorces d'ADN ou des anticorps immobilisés sur une surface d'électrode pour quantification du contenu moléculaire.

Procédé de EFIRM est avantageux pour l'extraction des exosomes et déchargement des marchandises pour l'analyse sans tampon de lyse. Ce procédé est capable de réaliser une détection spécifique de deux cibles d'ARN et de protéines biomarqueurs dans le exosomes. EFIRM extrait exosomes spécifiquement en fonction de leurs marqueurs de surface par opposition à des techniques basées sur la taille.

Microscopie électronique en transmission (TEM) et le dosage montrent la fonctionnalité du procédé de capture et d'analyse des exosomes. Procédé de EFIRM a été appliqué à exosomales analyse de 9 souris injectées avec des cellules H640 de cancer du poumon humain (une lignée cellulaire transfectée pour exprimer le marqueur d'exosomes CD63-GFP humain) afin de tester leur profil d'exosomes contre 11 souris recevant témoins de sérum physiologique. Des niveaux élevés de biomarqueurs exosomales (GAPDH du gène de référence et de la protéine de surface marqueurs humaine CD63-GFP) ont été trouvé pour le H640 souris injectées dans les deux échantillons de sérum et de salive. En outre, saliVA et des échantillons de sérum ont été démontré que la linéarité (R = 0,79). Ces résultats suggèrent pour la viabilité des biomarqueurs salivaires exosomes pour la détection de maladies distales.

Introduction

recherche Exosome est un domaine émergent de l'enquête qui examine microvésicules lipidiques qui portent ^une ARN, l'ADN ^{2, 3} et en protéines cargaison. Enquêtes précédentes de la biologie exosomes ont conduit à l'identification des exosomes dans biofluides tels que le sang ^{4, 5} urine, le lait maternel ^{6, 7} et la salive. Des études ont démontré que les exosomes jouent un rôle dans différentes voies cellulaires, méditant à distance communication entre les différents systèmes du corps ^8. En raison du rôle exosomes jouent dans la communication intercellulaire, on suppose qu'elles peuvent conditionner ....