Utvikling av hemmere av Protein-protein interaksjoner gjennom ERSTATTE: Søknad til Design og utvikling Non-ATP Competitive CDK-hemmere

Summary

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Abstract

BYTT er en unik strategi utviklet for å mer effektivt målrette protein-protein interaksjoner (PPI). Formålet er å utvide tilgjengelige medikamentmål plass ved å tilveiebringe forbedret metode for identifisering av inhibitorer for slike bindingsseter, og som utgjør hoveddelen av potensielle drug targets. Hovedmålet med denne artikkelen er å gi en metodisk oversikt over bruken og anvendelsen av BYTT strategi som innebærer beregningsorientert og syntetisk kjemi tilnærminger. BYTT er eksemplifisert ved dens anvendelse i utvikling av ikke-ATP konkurrerende cyklinavhengige kinaser (CDK) inhibitorer som anti-tumor terapeutiske midler. CDK er ofte deregulert i kreft og dermed anses som viktige mål for legemiddelutvikling. Hemning av CDK2 / cyklin A i S-fasen har blitt rapportert å fremme selektiv apoptose av kreftceller i en p53 uavhengig måte gjennom E2F1 pathway. Målretting protein-protein interaksjon på cyklin binding groove (CBG) er en tilnærming som vil tillate spesifikk hemming av cellesyklusen løpet transkripsjons CDK. Den CBG er anerkjent av en konsensus sekvens avledet fra CDK underlag og tumorsupressorproteinene proteiner kalt cyclin bindende motiv (CBM). CBM har tidligere blitt optimalisert til et oktapeptid fra p21Waf (HAKRRIF) og deretter ytterligere avkortet til en pentapeptid beholder tilstrekkelig aktivitet (RRLIF). Peptider generelt er ikke celle gjennomtrengelig, er metabolsk ustabil og derfor erstatte (erstatning med delvis Ligand Alternatives gjennom Computational Enrichment) strategi til grunn for å generere flere narkotika-lignende hemmere. Strategien begynner med utformingen av Fragment ligatisert hemmende peptider (knipser) som selektivt hemmer cellesyklus CDK / cyklin komplekser. Flips ble generert av iterativt erstatte rester av HAKRRLIF / RRLIF med fragment som små molekyler (capping grupper), med start fra N-terminalen (Ncaps), etterfulgt av erstatning påC-terminalen. Disse forbindelsene er utgangspunkt for generering av ikke-ATP konkurrerende CDK-hemmere som anti-tumor terapi.

Introduction

I denne artikkelen, er en casestudie av bruk av BYTT (Replacement med delvis ligandgrupper alternativer som bruker beregnings berikelse) strategi for å konvertere peptidiske hemmere av protein-protein interaksjoner i flere farmasøytisk relevante molekyler beskrevet ^1-3. Mens PPIs representerer en rik, men underutnyttet kilde til potensielle narkotika mål, eksisterende metoder er i stor grad utilstrekkelig til å gjøre disse allment tilgjengelig. Gjeldende strategier, inkludert fragment basert design ^4, high-throughput screening ⁵ og stiftede peptider ⁶ har gitt fremskritt, men disse er i mange tilfeller ineffektiv. Som et resultat, er mer fremdrift og mer effektive metoder påkrevd. BYTT har vært fullt validert i utviklingen av kinaseinhibitorer som har forbedret narkotika-lignende egenskaper og har potensial for videre utvikling som anti-tumor terapi. Denne strategien er eksemplifisert i utvikling av ikke-ATP inhibitorer av cellesykkel CDK og innebærer som følger: 1) innhente 3D strukturell informasjon om interaksjoner av HAKRRLIF / RRLIF med cyclin bindende sporet; 2) bestemme viktige bindings determinants for peptid samhandling; 3) avkutting av peptidet N-terminalen inneholder en eller flere bindings determinanter; 4) beregnings identifisering av mulige små molekyl alternativer (delvis ligandgrupper alternativer, Plas) for den avkortede delen av peptidet og hvilke beholde nøkkel interaksjoner i morselskapet peptid; 5) syntese eller kommersiell sourcing av plas spådd å binde ivrig med sub området tidligere okkupert av slettet peptidrest (s); 6) syntese av knipser gjennom ligering av de beste Plas til den avkortede peptid ved hjelp av fastfasesyntese; 7) testing av knipser i en in vitro-bindings eller funksjonelt assay (fluorescens polarisering i CDK / cyclin sammenheng), etterfulgt av ytterligere karakterisering i en celle-levedyktighet assay. En skjematisk fremstilling av BYTT strategy er vist i figur 1. I denne artikkelen er gjentakelser av REPLACE strategi diskutert og søknaden til CDK2 / cyklin A beskrevet i detalj. CDK antas å være direkte eller indirekte deregulert i de fleste svulster og er derfor anses hensiktsmessig kreft narkotika mål ^7. CDK krever tilknytning til cykliner for full aktivering og deretter fosforylere viktige proteiner involvert i cellesyklusregulering ^8. De to store grupper av CDK er isotyper som styrer cellesyklus sjekkpunkter [G1 / S (CDK4 / Cyclin D, CDK6 / cyklin D og CDK4 / cyclin E), S-fasen (CDK2 / cyklin A) og G2 / M (CDK1 / cyclin B)] og regulatorer av RNA polymerase gjennom fosforylering (CDK7 / cyclin H, CDK8 / cyklin C, CDK9 / cyclin T). Et viktig skritt i S-fasen progresjon oppstår når E2F1 transkripsjonsfaktor danner et kompleks med DP-proteinet, som deretter bindes til DNA og initierer gentranskripsjon. CDK2 / cyklin A er nødvendig for å nøytralisere E2F1 transkripsjonenaktivitet gjennom fosforylering og dermed fører til frigjøring av den E2F1-DP-komplekset og påfølgende nedbrytning. Hemning av CDK2 / cyklin A antas å opprettholde E2F1 i sin DNA bundet tilstand som fører til vedvarende aktivering. Den resulterende nivået av E2F-en aktivitet vil overgå terskelen nødvendig for å indusere p53 uavhengig apoptose derfor foreslå en terapeutisk strategi. På grunn av deregulert p53 og pRb trasé, høye nivåer av E2F-1 hyppig forekommer i kreftceller og inhibisjon av CDK2 / cyklin A bør føre til selektiv apoptose i tumorer og kan betraktes som en validert mål kreft ^7.

Klinisk undersøkt CDK hemmere målrette svært konservert ATP-bindingssetet fører til krysse reaktivitet blant mer enn 500 proteinkinaser i menneske kinome og potensielt gi opphav til bivirkninger og toksisitet ^9. En alternativ tilnærming er ikke-ATP kompetitiv hemming ved å målrette underlaget rekruttering gjennom CBGtilstede på cyklin positive regulatoriske subenhet og som derfor tydelig og fjernt fra ATP-bindingssetet ^10,11. Den CBG er først og fremst en hydrofob spor til stede i cyklin A, cyklin D og cyclin E, og har vist seg å gjenkjenne en konsensussekvens som finnes i substrater og tumor-suppressorer. Som et isolert peptid, cyklin bindingsmotiv (CBM) binder til CBG, og har blitt vist å inhibere kinase aktivitet av cellesyklus CDK'er. CBM er optimalisert til en oktapeptid (HAKRRLIF, CDK2 / cyklin A IC ₅₀ 0,07 ± 0,02 mikrometer, CDK4 / cyklin D, IC ₅₀ 0,88 ± 0,34 mm) og dessuten avkortet til en pentapeptide representerer et godt kompromiss mellom molekylvekt for narkotika likhet og potens (RRLIF, CDK2 / cyklin A IC ₅₀ 1,01 ± 0,17 mikrometer, CDK4 / cyclin D, IC ₅₀ 25,12 ± 2,97 mm) ^12,13. De CBGs består av en stor primær og mindre sekundær hydrofob lomme som er bygget bro ved en acidic regionen (inkluderer Glu220, Glu224 og Asp283). Nøkkel bindende faktorer som bestemmer HAKRRLIF inkluderer samspillet av Ala2 med sekundær hydrofob lomme, ion sammenkobling og hydrogenbindinger av Lys3, Arg 4 og Arg5 med den sure regionen og en høy grad av komplementaritet av Leu6 og Phe8 med primær lipofile nettstedet. I tillegg er mange hydrogenbindinger bidratt fra peptidryggraden mens Ile7 virker som en avstandsholder rest som tillater optimal kontakt med den primære lommen. Bindingen modus og interaksjoner av HAKRRLIF med CBG er vist i figur 2.

Målretting CBM / CBG protein-protein interaksjon vil hemme kinase aktiviteten CDK2 / cyklin A, CDK2 / cyclin E & CDK4 / cyclin D og dette bør utløse E2F1 mediert apoptose av kreftceller, mens ikke påvirker normale celler ^7. Selv CBM avledede peptider er effektive inhibitorer av cellesyklus CDK, er det lite sannsynlig at de vil være nyttige som legemidler på grunn av deres metabolskeustabilitet og generell mangel på celle permeabilitet. For å oppnå dette, har vi søkt BYTT strategi for å konvertere disse potente peptidinhibitorer inn flere narkotika-lignende forbindelser for videre utvikling av anti-tumor terapi utnytter deregulert E2F1 gjennom CDK2 / cyklin En hemming. Følgende protokoll oppsummerer arbeidet som er gjennomført i anvendelsen av BYTT til cyclin groove. I første omgang ble narkotikalignende capping gruppe erstatninger for den N-terminale tetrapeptid av HAKRRLIF identifisert. Videre forbedringer i disse gruppene ble undersøkt i en ekstra valideringsstudie for BYTT. Representative resultatene fra disse studiene er også presentert.

Protocol

1. Computational Identifisering av Potential lite molekyl capping Grupper Merk: I prinsippet kan en rekke tilkoblings eller pharmacophore søkemetoder brukes til å forutsi potensielle capping grupper. Hovedformålet med beregningsstudier i BYTT er å identifisere små molekyler som beholder funksjonene og interaksjoner av aminosyrer som er erstattet. Validering av LigandFit docking protokoll 14 Merk: I tidligere studier, forankringsme…

Representative Results

Interaksjoner av HAKRRLIF med cyclin sporet er vist i figur 2. Peptid-rester som representerer de viktigste determinantene bindings omfatter Ala2, Arg4-, Leu6 og Phe8 med andre rester som gir mindre bidrag 12,13,18. I dette tilfellet studien BYTT strategien har blitt brukt for å finne fragment alternativer for rester i N-terminal tetrapeptid av HAKRRLIF, primært ligne interaksjoner av Ala2 og Arg4-. Et bibliotek av potensielle NCAP fragmenter (tabell 1) ble…

Discussion

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts¹⁹. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI’s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability²⁰. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and…

Materials

Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, ,  Micro pipets,	Grenier Bio-one	110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)	BPS Bio Sciences	40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),
25 nM HEPES	CALBIOCHEM	375368
NaCl	Fisher	127838
Nonidet P-40	US Biological	N3500
DTT	Aldrich
-70c freezer	Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector  fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein	Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates,	Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines	ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,  MTT reagent,	Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer	VWR
-70c freezer	Revco (Ultima II)
Incubator	Thermo electron corporation
Centrifuge	Eppendorf	5804 R
Refrigerator 4-8C	Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.	Beckman Coulter, Brea, CA