Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي

Published: October 26, 2015 doi: 10.3791/52441
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, University of South Carolina

Abstract

استبدال هو استراتيجية فريدة من نوعها وضعت لاستهداف أكثر فعالية البروتين البروتين التفاعلات (مثبطات مضخة البروتون). انها تهدف الى توسيع المساحة المتوفرة على الهدف المخدرات من خلال توفير منهجية محسنة لتحديد مثبطات لمثل هذه المواقع الملزمة والتي تمثل غالبية الأهداف المحتملة المخدرات. والهدف الرئيسي من هذه الورقة هو تقديم لمحة المنهجية لاستخدام وتطبيق استراتيجية استبدال الذي ينطوي على النهج الكيمياء الحسابية والاصطناعية. استبدل يتجلى من خلال تطبيقها لتطوير تحركات غير ATP السيكلين تنافسية تعتمد (للمعلمين) مثبطات كما العلاجات المضادة للورم. وكثيرا ما حررت CDKs في السرطان، وبالتالي تعتبر أهدافا هامة للتنمية المخدرات. تم الإبلاغ عن تثبيط CDK2 / السيكلين A في المرحلة S لتعزيز موت الخلايا المبرمج انتقائية من الخلايا السرطانية بطريقة مستقلة البروتين p53 من خلال مسار E2F1. استهداف تفاعل البروتين البروتين في المربوطة السيكلينز الأخدود (CBG) هو النهج الذي سيسمح للتثبيط محددة من دورة الخلية على CDKs النسخي. يتم التعرف على CBG عن طريق سلسلة إجماع المستمدة من ركائز معلمين وورم البروتينات الكابتة يسمى السيكلين عزر (CBM) ملزمة. وقد سبق الأمثل CBM إلى ثماني الببتيد من p21Waf (HAKRRIF) ثم اقتطاع المزيد لخماسي الببتيد الاحتفاظ النشاط الكافي (RRLIF). الببتيدات بصفة عامة ليست قابلة للاختراق الخلية، غير مستقرة عملية الأيض وبالتالي تم تطبيق استبدال (مع استبدال الجزئي يجند البدائل من خلال الحاسوبية التخصيب) استراتيجية من أجل توليد المزيد من مثبطات مثل المخدرات. تبدأ استراتيجية مع تصميم جزء ligated الببتيد المثبطة (تقلب) التي تحول دون انتقائية دورة الخلية مجمعات معلمين / السيكلين. تم إنشاء تقلب عن طريق استبدال تكرارا مخلفات HAKRRLIF / RRLIF مع شظية مثل الجزيئات الصغيرة (متوجا مجموعات)، بدءا من N-محطة (Ncaps)، تليها بديل عنمحطة سي. هذه المركبات هي نقطة الانطلاق لتوليد مثبطات معلمين تنافسية غير ATP كما العلاجات المضادة للورم.

Introduction

في هذه المقالة، وصفت دراسة حالة لتطبيق استبدال (استبدال ببدائل يجند جزئية باستخدام الحسابية التخصيب) استراتيجية لتحويل مثبطات ببتيدية من تفاعلات البروتين البروتين إلى مزيد من صيدليا الجزيئات ذات الصلة 1-3. بينما تمثل مثبطات مضخة البروتون مصدرا غنيا لكن مستغلة من الأهداف المحتملة المخدرات والمنهجيات الحالية غير كافية إلى حد كبير لجعل هذه يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. الاستراتيجيات الحالية بما في ذلك جزء يستند تصميم 4، الإنتاجية العالية فحص 5 والببتيدات تدبيس وفرت 6 التقدم، ولكن هذه هي في كثير من الحالات غير فعالة. ونتيجة لذلك، يطلب المزيد من التقدم ونهج أكثر كفاءة. استبدال تم التحقق من صحة تماما في تطوير مثبطات كيناز التي أدت إلى تحسين الخصائص مثل المخدرات ولها إمكانات لمزيد من التطوير كما العلاجات المضادة للورم. ويتمثل هذه الاستراتيجية في تطوير مثبطات غير ATP من الخلاياCDKs دورة وينطوي على النحو التالي: 1) الحصول على المعلومات الهيكلية 3D على تفاعلات HAKRRLIF / RRLIF مع السيكلين الأخدود ملزمة. 2) تحديد محددات ملزمة هامة للتفاعل الببتيد. 3) الاقتطاع من الببتيد N-محطة تحتوي على واحد أو أكثر من محددات ملزمة؛ 4) تحديد الحسابية بدائل جزيء صغير المحتملة (بدائل يجند جزئية، بلاس) للجزء المقتطعة من الببتيد والتي تحتفظ التفاعلات الرئيسية للالببتيد الأم. 5) توقع توليف أو مصادر تجارية البلاس لربط بشوق مع موقع فرعي المحتلة من قبل بقايا الببتيد حذف (ق)؛ 6) توليف تقلب من خلال ربط من أفضل بلاس لالببتيد اقتطاع باستخدام تركيب الحالة الصلبة. 7) اختبار تقلب في في المختبر ملزمة أو فحص وظيفي (الاستقطاب مضان في سياق / السيكلين معلمين) تليها مزيد من التوصيف في مقايسة بقاء الخلية. تمثيل تخطيطي لاستبدال الاستراتيجيههو مبين في الشكل 1 ذ. في هذه المقالة، وتناقش تكرار لاستراتيجية استبدال وتطبيق لCDK2 / السيكلين A وصف بالتفصيل. ويعتقد CDKs أن حررت مباشرة أو غير مباشرة في معظم الأورام وبالتالي تعتبر أهدافا المخدرات سرطان المناسب 7. CDKs تتطلب بالتعاون مع الحلقيات لتفعيل كامل وبعد ذلك الفوسفات البروتينات الرئيسية المشاركة في تنظيم دورة الخلية 8. الفئات الرئيسية اثنين من CDKs هي isotypes التي تتحكم في نقاط التفتيش دورة الخلية [G1 / S (CDK4 / السيكلين D، CDK6 / السيكلين D وCDK4 / السيكلين E)، مرحلة S (CDK2 / السيكلين A) وG2 / M (CDK1 / السيكلين B)] والمنظمين من RNA البلمرة من خلال الفسفرة (CDK7 / السيكلين H، CDK8 / السيكلين C، CDK9 / السيكلين T). خطوة رئيسية في S مرحلة تطور يحدث عندما يشكل عامل E2F1 النسخ مجمع مع البروتين الذي يربط موانئ دبي ثم إلى DNA ويبدأ النسخ الجيني. مطلوب CDK2 / السيكلين A لتحييد E2F1 النسخيالنشاط خلال الفسفرة مما يؤدي إلى الإفراج عن مجمع E2F1-DP وتدهور لاحقا. ويعتقد تثبيط CDK2 / السيكلين A للحفاظ على E2F1 في DNA حالته ملزمة مما يؤدي إلى تنشيط دائم. فإن مستوى الناتجة من E2F-1 النشاط تتجاوز الحد الأدنى المطلوب للحث على البروتين p53 الخلايا المستقلة بالتالي يشير إلى استراتيجية علاجية. بسبب البروتين p53 حررت ومسارات PRB، ومستويات عالية من E2F-1 تحدث بشكل متكرر في الخلايا السرطانية وتثبيط CDK2 / السيكلين A ينبغي أن يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج انتقائية في الأورام ويمكن اعتباره هدفا سرطان صادق 7.

سريريا مثبطات معلمين التحقيق تستهدف موقع ATP الحفظ جدا ملزمة مما يؤدي إلى عبور التفاعل بين تحركات البروتينات أكبر من 500 في kinome الإنسان ويحتمل أن تكون مما أدى إلى آثار جانبية وسمية 9. نهج بديل غير قابلة للATP تثبيط المنافسة من خلال استهداف توظيف الركيزة خلال CBGموجودة على السيكلين فرعية التنظيمية الإيجابية والتي هي بالتالي متميزة وبعيدة عن موقع ATP 10،11 ملزمة. وCBG هو في المقام الأول الأخدود مسعور الحالي في السيكلين A، D السيكلين والسيكلين E ولقد ثبت للتعرف على تسلسل إجماع وجدت في ركائز والمكثفات الورم. كما الببتيد معزولة، والسيكلين ملزمة عزر (CBM) بربط CBG ولقد ثبت لكبح النشاط كيناز من CDKs دورة الخلية. وقد تم تحسين CBM إلى ثماني الببتيد (HAKRRLIF، CDK2 / السيكلين A IC 50 0.07 ± 0.02 ميكرومتر، CDK4 / السيكلين D، IC 50 0.88 ± 0.34 ميكرومتر) واقتطاع علاوة على ذلك لخماسي الببتيد تمثل حلا وسطا جيدا بين الوزن الجزيئي للبالمخدرات الشبه ورجولية (RRLIF، CDK2 / السيكلين A IC 50 1.01 ± 0.17 ميكرومتر، CDK4 / السيكلين D، IC 50 25.12 ± 2.97 ميكرومتر) 12،13. تتألف CBGs من الانتخابات التمهيدية كبير وجيب مسعور الثانوي أصغر التي يتم سدها من قبل الحمضةج المنطقة (تشمل Glu220، Glu224 وAsp283). وتشمل محددات ملزمة الرئيسية HAKRRLIF تفاعل Ala2 مع السندات جيب مسعور الثانوي، الاقتران أيون الهيدروجين وللLys3، الارجنتين 4 و Arg5 مع المنطقة الحمضية وعلى درجة عالية من التكامل بين Leu6 وPhe8 مع موقع دهون الأساسي. بالإضافة إلى ذلك، ساهم السندات الهيدروجين العديد من العمود الفقري الببتيد في حين يعمل Ile7 كبقايا هل يسمح اتصال الأمثل مع جيب الأساسي. يظهر وضع ملزمة وتفاعلات HAKRRLIF مع CBG في الشكل 2.

سوف تستهدف CBM / CBG تفاعل البروتين البروتين تمنع النشاط كيناز من CDK2 / السيكلين A، CDK2 / السيكلين E & CDK4 / السيكلين D وهذا ينبغي أن يؤدي E2F1 الخلايا بوساطة الخلايا السرطانية في حين لا تؤثر الخلايا الطبيعية 7. على الرغم من أن CBM المستمدة الببتيدات هي مثبطات فعالة من CDKs دورة الخلية، فمن غير المحتمل أن يكون مفيدا كدواء بسبب الايضعدم الاستقرار ونقص عام في نفاذية الخلية. تحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطبيق استراتيجية استبدالها من أجل تحويل هذه المثبطات ببتيدية واسعا إلى مزيد من مركبات شبيهة المخدرات للحصول على مزيد من العلاجات المضادة للورم استغلال E2F1 حررت خلال CDK2 / السيكلين A تثبيط التنمية. بروتوكول التالية يلخص العمل الذي تم الانتهاء منه في تطبيق استبدال لالأخدود السيكلين. في المقام الأول، تم تحديد بدائل فريق السد مثل المخدرات للرباعي البيبتيد N-محطة من HAKRRLIF. وعلاوة على ذلك تم التحقيق التحسينات في هذه المجموعات في دراسة التحقق من صحة إضافية لاستبدال. وتعرض أيضا ممثل النتائج من هذه الدراسات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحاسوبية تحديد جزيء المجموعات السد المحتملة الصغيرة

ملاحظة: من حيث المبدأ، ومجموعة متنوعة من الالتحام أو حامل الخاصة الدوائية طرق البحث يمكن استخدامها للتنبؤ المجموعات السد المحتملة. والغرض الرئيسي من الدراسات الحسابية في استبدال هو تحديد الجزيئات الصغيرة التي تحتفظ الميزات وتفاعلات الأحماض الأمينية التي يتم استبداله.

  1. المصادقة على بروتوكول LigandFit لرسو السفن 14

ملاحظة: في دراسات سابقة، وطريقة لرسو السفن (LigandFit 15، وحدة نمطية في جناح برنامج النمذجة الجزيئية، ستوديو ديسكفري 3.0) تم التحقق للتأكد من أن هذه الخوارزمية هي كافية لإنتاج وسائط ملزمة من المعروف Ncaps وتبين أن النتائج التي تم الحصول عليها ل مركبات غير معروفة هي التنبؤية 14.

  1. باستخدام الخطوات التالية (1،2-1،5)، وتحديد المعايير المثلى للLigandFit على النحو التالي: PLP1 ENشبكة ergy لتوليد تشكل، التقليل من يطرح ولدت وظيفة التهديف PLP1 لتحليل يطرح.
  2. من أجل الحد من التشكل التي تم الحصول عليها ووضع بروابط ملائمة لتشكيل الرابطة التساهمية في الببتيد توج، تعيين النيتروجين والنيتروجين أميد ذرات الإندول من Trp217 وGln254 على التوالي كمرشحات التفاعل عن الرابطة الهيدروجينية.
  3. تصميم وإرساء مكتبة بدائل شظية في CDK2 / السيكلين A مستقبلات (2UUE). أولويات الجماعات السد المحتملة لتخليق ومصادر التجاري على أساس PLP1 التهديف، التفاعل مع مرشحات التفاعل والتكامل مع CBG. الخطوات المختلفة اللازمة لLigandFit لرسو السفن هي على النحو التالي.
  1. إعداد مستقبلات موقع ملزم 14
    1. استيراد CDK2 / السيكلين هيكل الكريستال (معرف PDB: 2UUE) في إطار التصور في البرنامج. ويتضمن هذا الهيكل FLIP التي سبق تحديدها 5-ميثيل-1-فينيل-1H-1، 2،4-التريازول-3-carboxamido (3،5 DCPT) RLIF بد أن الأخدود السيكلين (الشكل 3).
    2. حذف أو الاحتفاظ بها في مكان بقايا RLIF (C-المحطة). عندما يتم الاحتفاظ تسلسل الببتيد، استخدم مجموعة أمينية-N محطة من الببتيد باعتباره مرشح التفاعل ليجند. من "التفاعلات مستقبلات يجند" أدوات، إنشاء المجال في جميع أنحاء N-سقف 3،5 DCPT من إظهار / إخفاء موقع المجال. يتم إنشاء المجال لتحديد المنطقة النشطة في الموقع ملزم حيث يسمح للتفاعلات يجند مستقبلات تحدث أثناء ملزمة.
    3. تحديد موقع ملزم أبعد عن "العثور على الموقع وحجم يجند المحدد" وحذف يجند 3،5 DCPT من البروتين. تنفيذ هذه الخطوة لتحديد حجم ملزمة داخل المجال بإنشائه.
    4. تعيين النيتروجين والنيتروجين أميد ذرات الإندول من مخلفات Trp217 وGln254 كمرشحات التفاعل عن الرابطة الهيدروجينية. تعيين المرشحات التفاعل بحيث لا يشكل هؤلاء أن الأسواق العالمية ضغطهاسيتم تصفيتها ract مع ذرات من مجموعة المخلفات أثناء عملية الالتحام بالتالي الحفاظ على التفاعلات الهامة في أوضاع رست.
  2. إعداد بروابط 14
    1. تصميم المكتبة من 100 مجموعة السد المحتملة على أساس المعايير بما في ذلك الوزن الجزيئي أقل من 500، ووجود مجموعة الكربوكسيل للربط مع الببتيد اقتطاع وإدماج الفئات مسعور المناسبة (استبدال مجموعة فينيل) لفان دير فال التفاعل في الجيب الثانوي هو مبين في الجدول 1.
    2. حدد حلقات غير متجانسة لمحاكاة الببتيد الهيدروجين الرابطة التفاعل مع Trp217 وبدائل وشملت لاستبدال التفاعلات أيون الاقتران من السلاسل الجانبية الأساسية للHAKRRLIF. إرساء بروابط كما الجزيئات ألدهيد منها بحيث الأكسجين الكربونيل يمكن أن تتفاعل مع ذرة النيتروجين أميد من Gln254 مماثلة لالببتيد العمود الفقري في الببتيد الأم (الجدول 1).
    3. قبل ثيقةالملك تقليل بروابط تهدف إلى التشكل الطاقة المنخفض وإعداد في حالة التأين المناسبة باستخدام بروتوكول "إعداد بروابط". رسم وتصدير هذه القبعات N المحتملة في تنسيق ملف .sdf في ChemDraw للجدول قبل أن يتم استيرادها إلى البرنامج.
      ملاحظة: إعداد بروتوكول بروابط يستخدم للحد من كل بروابط أن رست على دولهم أدنى الطاقة وطبقت هذه الاتهامات التأين لذرات المعمول بها. يتم استخدام المعلمات الافتراضية لهذه الخطوة.
  3. التحام بروابط في السيكلين أخدود 14
    1. تحديد روتين LigandFit من مستقبلات يجند مجموعة بروتوكول تفاعلات البرنامج. استخدام مستقبلات وبروابط مستعدة كمدخل لهذا البروتوكول.
    2. لهذه أشواط حدد PLP1 كما شبكة الطاقة، تحديد أن يطرح تكون الطاقة الحد الأدنى، وأن عدد من يطرح ولدت كما 10. اترك كل العوامل الأخرى في القيم الافتراضية.
      ملاحظة: LigandFit هوطريقة لرسو السفن التي يمكن تحديد وتوليد يطرح التكامل عالية وتقارب محتمل مع موقع نشط من البروتين باستخدام شكل أساس مرشح المقارنة التي هي مجتمعة مع خوارزمية بحث بتكوين مونتي كارلو. شبكة الطاقة المستخدمة من قبل برنامج لرسو السفن هي القوة الميدانية لتوليد تفاعلات يجند مستقبلات ويطرح المحتملة. PLP1 هو piecewise إمكانية الخطية التي تعطي الأولوية على وجه التحديد الهيدروجين الترابط التفاعلات وحيث تم تعيين نوع ذرة حزب العمال التقدمي لكل غير الهيدروجين يجند ذرة أو غير الهيدروجين مستقبلات ذرة.
  4. تحليل النتائج
    1. في المقام الأول، وعرض يطرح في البرنامج متخيل ثم الترتيب حسب تنازلي قيم النتيجة PLP1. استخدام وظائف يحرز مثل PLP1 لتقدير تقارب ملزمة ليجند رست على أساس يجند المرشح تشكل الهندسة والتفاعل غير التساهمية مع بنية مستقبلات الهدف.
      ملاحظة: وهنا، تم العثور على وظيفة PLP1 هدفا لزتعطي أفضل النتائج كما يتضمن تقدير الرابطة الهيدروجينية.
    2. تحليل بصريا أعلى 25٪ من يطرح سجل ل1) superimposability مع مجموعة السد المعروف (وجود النسبي يعني الانحراف مربع (RMSD) قيمة أقل من 2 Å)، 2) الوفاء مرشحات التفاعل و3) التكامل البصري مع الأخدود السيكلين . ومن المتفق عليه في أن رست بشكل صحيح تشكل (مقارنة مع بنية التجريبي) له قيمة RMSD من <2 Å.
    3. دراسة أوضاع تحقيق التكامل البصري، الذي يعرف بأنه وجود ملء الفعال للجيب ملزم على نحو يتسق مع العلاقات هيكل النشاط المعروفة. يتم تعيين المرشحات التفاعل لتشمل القيود الذرة التي تتطلب اتصالات بين الجزيئات المعروفة لتكون حاسمة للربط و / أو مطلوبة لوضع مجموعة السد المحتملة في الهندسة الصحيحة لتشكيل السندات أميد. ثلاثة أمثلة من يطرح رست في مجموعات متوجا N المحتملة مما يجعل السندات الهيدروجين مع interactioوتظهر ن المرشحات في الشكل (4).

2. تحضير وتوصيف المحتملة N -capping المجموعات

  1. توليف مجموعات متوجا N.
  2. لتخليق، استخدم كل التجارية ابتداء من المواد والمذيبات والمواد الكيميائية كما تم الحصول عليها. توليف مجموعات متوجا N المحتملة الكيمياء العضوية الاصطناعية التقليدية (الشكل 5 12،13 للحصول على مثال).
  3. أداء رقيقة اللوني طبقة (TLC) على هلام السيليكا لرصد ردود الفعل.
    1. حل بدءا المادية وخليط التفاعل (1 ملغ) في الطور المتحرك واكتشافها على لوحة TLC باستخدام الأنابيب الشعرية.
    2. وضع لوحة TLC في لغرفة تحتوي على الطور المتحرك (خلات الإيثيل والهكسان في نسبة 35:65). مرة واحدة في المرحلة المتنقلة تصل إلى 90٪ من لوحة TLC، وإزالة والهواء الجاف لوحة.
    3. استخدام الأشعة فوق البنفسجية للكشف عن البدء المواد والخلطات رد فعل على شكل بقع واضحة. كالculate وو R من جميع المواقع (نسبة المسافة التي يقطعها الفور والطور المتحرك).
      ملاحظة: إن رد الفعل اكتمال عندما لا يكون هناك بقعة ينظر في و R من المواد الاساسية.
  4. بعد الانتهاء من رد الفعل العمل لمدة تصل خليط التفاعل عن طريق وضع في قمع فصل وغسل حمض مائي أو حل قاعدة حسب الاقتضاء. جمع المذيبات العضوية، تتبخر في المبخر الدوار وتجفيف المنتجات الخام التي تم الحصول عليها في ظل فراغ.
  5. حل 500 ملغ من الناتج الخام في 3-5 مل من مذيب مناسب وإضافة إلى 1 غرام من السيليكا أو RP18 samplet والجافة تحت الهواء. وضع samplet تحتوي على الناتج الخام في السيليكا / RP SNAP خراطيش فلاش وتنقية المواد الخام باستخدام الآلي عالية الأداء اللوني فلاش (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة) توظيف ز العمود SNAP 100 مع تشغيل متدرجة بدءا من 6٪ خلات الإيثيل: 94 hexanes٪ إلى 50٪ خلات الإيثيل و 50٪ على hexanes15 مجلدا العمود.
  6. تجفيف المنتجات النقية التي تم جمعها في المذيبات من فلاش اللوني باستخدام المبخر الدوار عن طريق تبخير كل مذيب للجفاف وزيادة تجفيف المنتجات تحت فراغ لإزالة كافة المذيبات المتبقية. أداء توصيف المنتج تنقيته بواسطة NMR، MS وHPLC التحليلية.
    1. ل1 H NMR و 13 C NMR، تزن حوالي 10 ملغ من عينة النقاء، حله في مذيب بالديوتيريوم المناسب، ونقل المحتويات إلى أنبوب NMR الجاف لتسجيل الأطياف NMR 2،14.
    2. تسجيل 1 H NMR و 13 C NMR الأطياف مع حقل عالية NMR مطياف (الحد الأدنى 300 ميغاهيرتز). الحصول على أطياف الشامل باستخدام QTOF (جنبا إلى جنب أربعة أضعاف-1 وقت مطياف الكتلة الطيران)، Electrospray التأين (ESI) أو VG 70S 2،14 (مطياف الكتلة القطاع المغناطيسي، EI التركيز نقرا مزدوجا).
    3. تحليل نقاء المنتجات من قبل HPLC مع كاشف الصمام الثنائي مصفوفة ومجهزةوC18 (2) 100 A، 250 X 4.6 مم، 5 ميكرون العمود للتحليل. استخدام المدى التدرج بدءا من المياه 100٪ (حمض trifluoroacetic 0.1٪) إلى 60٪ الأسيتونتريل (حمض trifluoroacetic 0.1٪) على مدى 30 دقيقة، وعقد التدرج لمدة 4 دقائق. استخراج الاستشرابية في 226 و 254 نانومتر 2،14.
      ملاحظة: كانت درجات نقاء تحليلية لتقييم المركبات> 95٪.

3. الصلبة التجميعي المرحلة لتوليد تقلب 2

  1. توليف تقلب المغطاة N
    1. تجميع N توج المركبات ببتيدية من خلال طرق تركيب الحالة الصلبة القياسية باستخدام الخطوات التالية.
      1. تنشيط 5 المعادل للC محطة الأحماض الأمينية (Fmoc-الفنيل ألانين) في 4.4 في حكمه من O -Benzotriazole- N، N، N '، N' -tetramethyl-uronium-hexafluoro فوسفات (HBTU، 221.93 ملغ) في 2 مل من DMF لمدة 5 دقائق. تحميل الخليط HBTU Fmoc-الفنيل ألانين على الراتنج تزلج باستخدام 6 يعادله من diisopropylethyl أمين (DIPEA، 103.13ملغ) لمدة 1 ساعة على RT.
      2. إزالة مجموعة حماية Fmoc من بقايا-C المحطة باستخدام 20٪ تأكسد في 3 مل من DMF لمدة 10 دقيقة. زوجين الأحماض الأمينية لاحقة (على سبيل المثال، Fmoc-إيل، Fmoc-لوي، Fmoc-الارجنتين-PMC) خطوة بخطوة. في كل خطوة، زوجين 5 EQUIV من الأحماض الأمينية التالي باستخدام 6 يعادله من DIPEA (103.13 ملغ) و 4.4 في حكمه من HBTU (221.93 ملغ) في 2 مل من DMF لمدة 1 ساعة على RT.
      3. تطبيق دورات الغسيل (5 × 10 مل من DMF + 5 × 10 مل من DCM) بعد اقتران الأحماض الأمينية وFmoc deprotection الخطوات المذكورة أعلاه. بعد تجميع الببتيد، زوجين جماعات تستخدم 6 يعادله من DIPEA (103.13 ملغ) و 4.4 في حكمه من HBTU (221.93 ملغ) N-متوجا في 2 مل من DMF لمدة 1 ساعة على RT.
      4. عند الانتهاء من تجميع الببتيد، علاج خليط التفاعل مع 2 مل من الخليط انشقاق (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N لإزالة سلسلة جانب حماية الفئات، ويلتصق تقلب من الراتنج. يسحن المنتج الناتج مع ايثر البارد لترسيب وأناالتركيز ضروري و في المبخر الدوار.
  2. توليف تقلب N-توج-C توج
    1. تزن وحل الارجنتين-لوي الببتيد N-عضال توج والمحمية (16.1 ملغ، 0.02 ملمول) في ثنائي كلورو ميثان، وإضافة [4- (3-chlorophenoxy) pyridin-2-يل] methanamine (C-كاب) جنبا إلى جنب مع O - benzotriazole- N، N، N '، N' hexafluorophosphate -tetramethyluronium (HBTU؛ 16.7 ملغ، 0.02 ملمول) وN، N -diisopropylethylamine (DIPEA؛ 6.5 ملغ، 0،02 مليمول).
    2. إثارة ومراقبة رد الفعل في RT حتى يشير TLC / HPLC استهلاك كامل من بدء المادية. بعد الانتهاء من رد الفعل، والتركيز خليط التفاعل الخام باستخدام المبخر الدوار ثم التقسيم بين خلات الإيثيل والماء.
    3. فصل مائي وطبقة العضوية. غسل طبقة العضوية مع 1 N هيدروكسيد الصوديوم، 1 N حمض الهيدروكلوريك، والماء المالح. تجفيف الطبقة العضوية مع حوالي 1 غرام من كبريتات الصوديوم والتركيز المنتج في المبخر الدوار. الاتحاد الدولي للسباحةLLY علاج المنتج O / N مع خليط انشقاق (95: 2،5: 2،5 حمض trifluoroacetic / H 2 O / TIPS) لdeprotection.
    4. يسحن المنتج الناتج مع ايثر البارد وإذا التركيز الضروري في المبخر الدوار لاستكمال جفاف من أجل إزالة كافة المذيبات. وعلاوة على ذلك تجفيف المنتجات تحت فراغ لإزالة كافة المذيبات المتبقية.
  3. تنقية وتوصيف تقلب
    1. تنقية تقلب الخام باستخدام أساليب شبه HPLC عكس المرحلة التحضيرية. يجفد وتقلب تنقيته وتميز كتلتها الجزيئية باستخدام مطياف الكتلة 2،14.
    2. تحديد نقاء التحليلي للتقلب من قبل HPLC مع كاشف الصمام الثنائي مصفوفة ومجهزة C18 (2) 100 A، 250 X 4.6 مم، 5 ميكرون العمود. استخدام أسلوب التدرج بدءا من 95٪ H 2 O (0.1٪ حمض trifluoroacetic) / 5٪ الأسيتونتريل (0.1٪ حمض trifluoroacetic) إلى 35٪ H 2 O (0.1٪ حمض trifluoroacetic) / 65٪ الأسيتونتريل (0.1٪ trifluoroaceحمض تيك) على مدى 30 دقيقة، وعقد التدرج لمدة 4 دقائق. الاستشرابية استخراج في 226 و 254 نانومتر.

4. مضان الاستقطاب ملزم الفحص لتحديد تنافسية ملزم 2،14

  1. إجراء الفحص في أسود 384 بئر (138 ميكرولتر) لوحات باستخدام الإجراء التالي.
  2. تمييع العينات، الببتيدات التتبع (4 نانومتر)، والمجمعات كيناز (CDK2 / السيكلين A - 18 ميكروغرام / مل، CDK4 / السيكلين D - 37 ميكروغرام / مل) إلى التركيزات المطلوبة في المخزن فحص (25 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7، 10 ملم كلوريد الصوديوم، 0.01٪ Nonidet P-40، 1 ملي dithiothreitol (DTT).
  3. إلى كل بئر من لوحة 384 جيدا، إضافة: 5 ميكرولتر من CDK4D1 أو CDK2CA (0.3 ميكروغرام / المنقى جيدا المؤتلف مجمع البشري كيناز)، محلول مركب 5 ميكرولتر، 5 ميكرولتر من 30 نانومتر التتبع الببتيد (fluoresceinyl-Ahx برو-فال -Lys-الارجنتين-الارجنتين-Leu- (3ClPhe) -Gly أو fluoresceinyl-Ahx برو-فال-ليز-الارجنتين-الارجنتين-لوي-الفنيل ألانين-الغليسين التتبع الببتيد). استخدام 5 ميكرولتر من كل DMSO (6٪)، العازلهص، التتبع وDMSO 5 ميكرولتر (6٪)، مجمع كيناز، التتبع كما آبار المراقبة
  4. بعد إضافة جميع المكونات، وأجهزة الطرد المركزي لوحة في 500 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة (41.16 x ج) في RT ثم احتضان لوحة مع الانفعالات لمدة 45 دقيقة في RT. باستخدام قارئ لوحة المتعدد وكشف مزودة 485 نانومتر / 535 نانومتر الإثارة / مرشحات الانبعاثات ومرآة مزدوج اللون قراءة كثافة فلوريسئين من كل بئر في لوحة.
  5. حساب الاستقطاب يعني النسبي (البرلمان) لجميع عينات الاختبار باستخدام معادلة تظهر أدناه. تحديد IC 50 القيم عن طريق الانحدار اللوغاريتمي عن طريق الربط بين النواب النسبية واختبار تركيزات.

المعادلة 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وتظهر تفاعلات HAKRRLIF مع الأخدود السيكلين في الشكل 2، وبقايا الببتيد التي تمثل محددات ملزمة رئيسية تشمل Ala2، Arg4، Leu6 وPhe8 مع المخلفات الأخرى التي تقدم مساهمات أصغر 12،13،18. في دراسة الحالة هذه قد استخدمت استراتيجية استبدالها من أجل إيجاد بدائل شظية من بقايا في رباعي البيبتيد N-محطة من HAKRRLIF، ومحاكاة في المقام الأول على تفاعلات Ala2 وArg4. وقد تم إنشاء مكتبة شظايا NCAP المحتملة (الجدول 1) استنادا إلى المعايير. وقد رست كل جزيء في موقع ملزم إخلاؤها إنشاؤها من قبل اقتطاع مجموعة N-متوجا من التركيب البلوري مع السيكلين A (PDB ID: 2UUE). وقد تم اختيار البدائل يجند المحتملة بناء على تحليل تشكل وPLP1 التهديف كما تنبأ من تقارب (تظهر أمثلة من يطرح رست في الشكل 4). توليف من NCAP وأكد (1- (3-كلوروفينيل) -5-ميثيل-1يظهر H-1،2،4-التريازول-3-متيل حامض) في الشكل رقم 5 حيث تم إنشاء هذا الجزيء في ثلاث خطوات وتنقيته بواسطة الآلي اللوني فلاش (الشكل التكميلي 1). وتظهر HNMR 1، 13 CNMR، MS وHPLC بيانات توصيف مركب تمثيلي 1- (3-كلوروفينيل) حمض -5-ميثيل-1H-1،2،4-التريازول-3-متيل في التكميلية أرقام 1-5 على التوالي. توليف تقلب N توج وتقلب N-توج-C توج ممثلة في أرقام 7 و 8 و يتم عرض بيانات التوصيف في الجدول 2. وتقارب ملزمة لكلا CDK2 / السيكلين ألف وتم تحديد CDK4 / السيكلين D باستخدام وأظهر فحص FP وصف والنتائج في الجدول 3. من مركبات اخضعت للاختبار، وتقلب تحتوي على التريازول تم تحديدها استنادا N-قبعات أن يكون لها أكبر تقارب لCDK2 / السيكلين ألف وCDK4 / السيكلين D ومركب تمثيليتم اختبار الصورة في المقايسات خلية مقرها. ككل، تم العثور على جزيئات FLIP التي تم تحديدها لتكون أكثر المخدرات مثل، والإبقاء على معظم التفاعلات بين ثماني الببتيد HAKRRLIF. تمتلك tetrapeptides توج أقل فاعلية مقارنة HAKRRLIF لكن كان من النشاط مماثلة لخماسي الببتيد RRLIF (الجداول 3 و 4). وتشير هذه النتائج إلى أن المركبات التي تم الحصول عليها قد تحسنت الشبه مكافحة المخدرات ولكن تم الحصول على هذه بتكلفة تقارب ملزم للخطر إلى حد ما.

النشاط المناهض للالتكاثري تم تقييم هذه بروابط CGI وشوهدت الخلوية IC 50 الصورة أقل من 30 ميكرومتر في خطوط الخلايا السرطانية U2OS وDU145.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على استراتيجية استبدال. الرجاء CL إك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تجليد وتفاعلات HAKRRLIF في CBG اللوحة اليمنى: هيكل غرار من HAKRRLIF منضمة إلى CBG. يتكون الأخدود السيكلين اثنين من جيوب مسعور - جيب الأساسي أكبر (يمين، التي تحتلها Leu6 وPhe8) وجيب أصغر الثانوي (يسار، التي تحتلها Ala2) والتي يتم سدها من قبل بقايا الحمضية يصور باللون الأحمر. اللوحة اليمنى: وتشمل التفاعلات الهامة الأخرى الاتصالات الرابطة الهيدروجينية من العمود الفقري الببتيد (مع Trp217، Gln254، Ile281)، والتفاعلات أيون الاقتران من مخلفات الأساسية الثلاثة للالببتيد (مع Glu220، Glu224، Asp283). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

441 / 52441fig3.jpg "/>
ويظهر الشكل 3. وضع ملزم من 3،5 DCPTRLIF في CBG. تجليد 3،5 DCPT-RLIF مع التفاعلات الرابطة الهيدروجينية (يصور الخطوط المنقطة الخضراء) مع ذرات sidechain من Trp217 وGln254. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
ويبين الشكل 4. النتائج لرسو السفن المحددة. رست يطرح من 3 ممثل مجموعة N-السد. كل من هذه المركبات جعل H-السندات مع ذرات مرشح تفاعل Trp217 وGln254 وكما هو مبين من الخطوط المنقطة الخضراء. المستبدلة فينيل يجعل التفاعلات فان دير فال مع جيب مسعور الثانوي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5
الرقم 5. توليف 1- (3-كلوروفينيل) حمض -5-ميثيل-1H-1،2،4-التريازول-3-متيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الرقم 6. تجميع تقلب N توج عن طريق التخليق المرحلة الصلبة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7
الرقم 7. توليف N-CAتقلب pped-C توج. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1

الجدول 1

الجدول 1. مكتبة جزيئات صغيرة رست والتوقعات الناتجة من الطاقة ملزم باستخدام وظيفة PLP1 التهديف.

الببتيد نقاء العمود الأبعاد طريقة معدل التدفق HPLC الاحتفاظ الوقت MW النظري الملاحظ MW
5843 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 23.9 732 732.6
5773 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 22.4 801.77 800.55
5774 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 24.2 767.33 766.5
5762 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة تسعة 731.91 731.65
5763 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 11.2 800.8 799.5
5764 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 10.1 766.34 765.55
5771 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 9.4 749.9 749.6
5765 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 10.1 766.35 755.65
5766 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 9.4 761.9 761.55
5767 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 20.4 761.9 761.55
5776 > 75٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 23.3 785.7 784.55
5775 > 90٪ 4.6 × 250 مم 5-65٪ الأسيتونتريل / المياه / 0.1٪ TFA 1 مل / دقيقة 9.9 751.34 750.45

الجدول 2. تحليلية لبيانات CGI الببتيدات وتجليد وتقلب.

الجدول 3
الجدول 3. في المختبر ملزمة المحدد تقلب N توج لCDK2CA وCDK4CD.

الجدول 4
توج الجدول 4. في المختبر ملزمة من N & C اختيار تقلب لCDK2CA وCDK4CD.

التكميلية الشكل 1-5. تنقية وتوصيف 1- (3-كلوروفينيل) حمض -5-ميثيل-1H-1،2،4-التريازول-3-متيل.

سوب الشكل 1
الشكل التكميلي 1. فلاش اللوني من الناتج الحصول عليها من الخطوة 1. هناك أربعة قمم يبلغ حجمه، والارتفاع الحاد يبلغ حجمه 55٪ خلات الإيثيل / تم العثور على 45٪ hexanes أن يكون المنتج المطلوب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

سوب الشكل 2
الشكل التكميلي 2. 1 HNMR من 1- (3-كلوروفينيل) -5-ميثيل-1H-1،2،4-الترايازول-3 سيارات حمض boxylic. ويظهر الطيف NMR 3 البروتونات الميثيل الأليفاتية والعطرية 3 البروتونات. يظهر التكامل لجميع القمم الثلاث أدناه الطيف NMR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سوب الشكل (3)
الشكل التكميلي 3. 13 CNMR 1- (3-كلوروفينيل) حمض -5-ميثيل-1H-1،2،4-التريازول-3-متيل. هناك عشرة ذرات الكربون في هيكل، 13 CNMR مع 10 إشارات لكل الكربون الذرة. يظهر التكامل لكل الذروة أدناه الطيف NMR. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ig4.jpg "/>
الشكل التكميلي هو مبين 4. MS من 1- (3-كلوروفينيل) حمض -5-ميثيل-1H-1،2،4-التريازول-3-متيل. الوزن الجزيئي للمركب كما ذروة الأم في 237. والجزيئي الفعلية وزن المركب 237.64. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

سوب الشكل 5
يتم تحديد الشكل التكميلي 5. HPLC من 1- (3-كلوروفينيل) حمض -5-ميثيل-1H-1،2،4-التريازول-3-متيل. ونقاء المنتج الى 100٪ كما هو موضح في اللوني HPLC. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Computational Chemistry
Accelyrs Discovery studio 3.0
Dell Optiplex Workstations
Synthetic Organic Chemistry
Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).
Flourescence Polarization Assay
384 micro well plates, Micro pipets Grenier Bio-one 110256602
CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) BPS Bio Sciences 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)
assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT))
25 nM HEPES CALBIOCHEM 375368
NaCl Fisher 127838
Nonidet P-40 US Biological N3500
DTT Aldrich
-70 °C freezer Revco (Ultima II)
DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein Beckman Coulter, Brea, CA
Cell Culture
96 well plates Fisher
Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines ATCC
NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent Fisher, Life technology, Alfa Aesar
Heamocytometer VWR
-70 °C freezer Revco (Ultima II)
Incubator Thermo electron corporation
Centrifuge Eppendorf 5804 R
Refrigerator 4-8 °C Isotemp Fisher
DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter Beckman Coulter, Brea, CA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Andrews, M. J., et al. REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors. Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).
  2. Liu, S., et al. Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly. J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).
  3. McInnes, C. Chapter 29. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Bernstein, M., Desai, P. 47, Elsevier. 459-474 (2012).
  4. Bower, J. F., Pannifer, A. Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions. Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).
  5. Makley, L. N., Gestwicki, J. E. Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions. Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).
  6. Walensky, L. D., Bird, G. H. Hydrocarbon-Stapled Peptides: Principles, Practice, and Progress. J Med Chem. , (2014).
  7. Shapiro, G. I. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment. J Clin Oncol. 24, 1770-1783 (2006).
  8. Thais, M., Sielecki, J. F. B., Enfield, P. A., Trainor, G. l Cyclin dependant kinase inhibitors: Useful targets in cell cycle regulation. Journal of medicinal chemistry. 43, 1-18 (2000).
  9. Morphy, R. Selectively nonselective kinase inhibition: striking the right balance. J Med Chem. 53, 1413-1437 (2010).
  10. Chen, Y. N., et al. Selective killing of transformed cells by cyclin/cyclin-dependent kinase 2 antagonists. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4325-4329 (1999).
  11. Orzaez, M., Gortat, A., Mondragon, L., Bachs, O., Perez-Paya, E. ATP-noncompetitive inhibitors of CDK-cyclin complexes. ChemMedChem. 4, 19-24 (2009).
  12. Kontopidis, G., et al. Insights into cyclin groove recognition: complex crystal structures and inhibitor design through ligand exchange. Structure. 11, 1537-1546 (2003).
  13. McInnes, C., Andrews, M. J., Zheleva, D. I., Lane, D. P., Fischer, P. M. Peptidomimetic design of CDK inhibitors targeting the recruitment site of the cyclin subunit. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. 3, 57-69 (2003).
  14. Premnath, P. N., et al. Fragment based discovery of arginine isosteres through REPLACE: towards non-ATP competitive CDK inhibitors. Bioorganic, and medicinal. 22, 616-622 (2014).
  15. Venkatachalam, C. M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites. J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).
  16. Mendoza, N., et al. Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth. Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).
  17. Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).
  18. Zheleva, D. I., et al. Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A. The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).
  19. Ivanov, A. A., Khuri, K. F. R., Fu, H. Targeting protein-protein interactions as an anticancer strategy. Trends in Pharmacological Sciences. 34, (2013).
  20. Thayer, A. M. Improving peptides. Chemical and Engineering News. 89, 13-20 (2011).
  21. Yin, H., Hamilton, A. D. Strategies for targeting protein-protein interactions with synthetic agents. Angew Chem Int Ed Engl. 44, 4130-4163 (2005).
  22. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions. Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).
  23. Cannon, J. B. Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy. J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 104، واكتشاف المخدرات، السيكلين كيناز تعتمد المانع، السيكلين الأخدود ملزمة، تفاعلات البروتين البروتين، شبه المخدرات، ومكافحة السرطان
تطوير مثبطات البروتين البروتين التفاعلات استبدال من خلال: تطبيق لتصميم وتطوير غير ATP مثبطات معلمين تنافسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nandha Premnath, P., Craig, S.,… More

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors. J. Vis. Exp. (104), e52441, doi:10.3791/52441 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter