Abstract
SUBSTITUIR é uma estratégia única desenvolvidos para atingir mais eficazmente interacções proteína-proteína (IBP). Ele tem como objetivo ampliar o espaço disponível alvo da droga, proporcionando uma melhor metodologia para a identificação de inibidores de tais sítios de ligação e que representam a maioria dos alvos potenciais da droga. O principal objetivo deste artigo é fornecer uma visão metodológica do uso e aplicação da estratégia REPLACE que envolve abordagens de química computacional e sintéticas. Substituição é exemplificado através da sua aplicação para o desenvolvimento de quinases dependentes de ciclina competitivo não-ATP (CDK) inibidores como agentes terapêuticos anti-tumorais. CDKs são frequentemente desregulado no câncer e, portanto, são considerados como alvos importantes para o desenvolvimento de drogas. A inibição de CDK2 / ciclina A em fase S foi reportado para promover a apoptose selectiva de células cancerosas de uma maneira independente de p53 por meio da via E2F1. A segmentação da interacção proteína-proteína no bindin ciclinag ranhura (CBG) é uma abordagem que permita que a inibição específica do ciclo celular CDK através de transcrição. O CBG é reconhecido por uma sequência de consenso derivada a partir de substratos de CDK e proteínas supressoras de tumor denominado o motivo de ligação (CBM) ciclina. O CBM foi previamente optimizado para um octapéptido de p21WAF (HAKRRIF) e, em seguida, ainda mais truncada para um pentapéptido reter actividade suficiente (RRLIF). Peptídeos em geral não são célula permeável, são metabolicamente instável e, portanto, o REPLACE (substituição parcial com Ligand Alternativas através Computacional Enriquecimento) estratégia tem sido aplicada de forma a gerar mais inibidores de drogas-like. A estratégia começa com o desenho do fragmento ligado péptidos inibitórios (vira) que inibem selectivamente a ciclo celular complexos de CDK / ciclina. Inverte foram gerados por substituição de resíduos de iterativamente HAKRRLIF / RRLIF com fragmento como moléculas pequenas (capping), grupos a partir da extremidade N-terminal (Ncaps), seguido por substituição como C-terminal. Estes compostos são pontos de partida para a geração de inibidores de CDK não-competitivos do ATP como agentes terapêuticos anti-tumorais.
Introduction
Neste artigo, um estudo de caso de aplicação do REPLACE (substituição por alternativas ligando parciais utilizando computacional enriquecimento) estratégia para converter inibidores peptídicos de interações proteína-proteína em mais moléculas farmacologicamente relevantes é descrito 1-3. Enquanto IBP representam uma fonte rica, mas ainda não devidamente explorado de alvos potenciais da droga, metodologias existentes são largamente insuficientes para fazer estes amplamente acessível. As estratégias atuais, incluindo fragmento baseado projeto 4, de alto throughput screening 5 e 6 peptídeos grampeados ter fornecido avanços, porém estes são, em muitos casos ineficaz. Como resultado, mais progresso e abordagens mais eficazes são necessárias. SUBSTITUIR foi completamente validado no desenvolvimento de inibidores de cinase que têm propriedades semelhantes a fármacos melhoradas e têm potencial para o desenvolvimento como agentes terapêuticos anti-tumorais. Esta estratégia é exemplificada para o desenvolvimento de inibidores não-ATP das célulasCDKs ciclo e envolve os seguintes: 1) a obtenção de informações estruturais 3D sobre as interações de HAKRRLIF / RRLIF com sulco de ligação da ciclina; 2) determinar os determinantes de ligação importantes para a interacção péptido; 3) truncamento do péptido N-terminal contendo um ou mais determinantes de ligação; 4) identificação computacional de alternativas potenciais de pequenas moléculas (ligandos alternativas parciais, Plas) para a parte truncada do péptido e que retêm as interacções chave do peptideo de origem; 5) síntese ou de fonte comercial de Plas previsto para se ligar avidamente com o sub local previamente ocupado pelo resíduo (s) péptido suprimido; 6) síntese de lança através de ligadura dos melhores PLAs ao péptido truncado utilizando síntese de fase sólida; 7) Os testes de flips em uma ligação in vitro ou ensaios funcionais (polarização de fluorescência no contexto / ciclina CDK) seguido por posterior caracterização de um ensaio de viabilidade celular. Uma representação esquemática de REPLACE strategY é mostrado na Figura 1. Neste artigo, iterações da estratégia de substituição são discutidos e a aplicação de CDK2 / ciclina A descrito em detalhe. CDKs são acreditados para ser directa ou indirectamente desreguladas na maioria dos tumores e, portanto, são consideradas alvos de drogas cancerosas apropriado 7. CDKs requerem associação com cyclins para ativação completa e posteriormente fosforilam proteínas-chave envolvidas na regulação do ciclo celular 8. Os dois grandes grupos de CDKs são os isotipos que controlam os pontos de verificação do ciclo celular [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e os reguladores de RNA polimerase através de fosforilação (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Um passo fundamental na progressão da fase S ocorre quando o factor de transcrição E2F1 forma um complexo com a proteína DP, que, em seguida, liga-se ao ADN e inicia a transcrição do gene. CDK2 / ciclina A é necessária para neutralizar E2F1 transcricionalactividade através da fosforilação conduzindo assim à libertação do complexo de E2F1-DP e sua subsequente degradação. A inibição de CDK2 / ciclina A é acreditado para manter E2F1 no seu estado ligado ADN conduzindo à activação persistente. O nível resultante de E2F-1 atividade irá superar o limiar necessário para induzir a apoptose independente de p53, portanto, sugerindo uma estratégia terapêutica. Devido à p53 desregulado e vias pRb, níveis elevados de E2F-1 que ocorrem frequentemente em células de cancro e inibição de CDK2 / ciclina A deve conduzir à apoptose selectiva em tumores e pode ser considerada como um alvo cancro validado 7.
Clinicamente inibidores de CDK investigados alvo o sítio de ligação ATP altamente conservada levando a atravessar reatividade entre os mais de 500 proteínas cinases na kinome humano e potencialmente dar origem a efeitos colaterais e toxicidade 9. Uma abordagem alternativa é-ATP não inibição competitiva, visando o recrutamento de substrato através da CBGpresente na subunidade reguladora positiva ciclina e que é, portanto, distinta e distante da ATP site de 10,11 vinculativo. O CBG é principalmente uma ranhura hidrófobo presente na ciclina A, ciclina D e ciclina E e foi mostrado para reconhecer uma sequência de consenso encontradas em substratos e supressores tumorais. Como um péptido isolado, a ligação da ciclina motivo (CBM) se liga ao CBG e tem sido demonstrado que inibem a actividade da cinase das CDKs do ciclo celular. O CBM foi optimizado para um octapéptido (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 de 0,07 ± 0,02 ^ M, CDK4 / ciclina D, IC50 0,88 ± 0,34 uM) e, além disso, truncada para um pentapéptido que representa um bom compromisso entre o peso molecular para a droga semelhança e a potência (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 1,01 ± 0,17 ^ M, CDK4 / ciclina D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Os CBGS consistem em um grande primária e secundária bolsa hidrofóbica menores que são colmatadas por um ACIDIc região (inclui Glu220, Glu224 e Asp283). Os principais determinantes de ligação de HAKRRLIF incluem a interacção de Ala2 com bolsa hidrofóbica secundário, de emparelhamento de iões de hidrogénio e ligações de Lys3, Arg Arg5 4 e com a região acídica e um elevado grau de complementaridade das Leu6 e Phe8 com o local primário lipofílico. Além disso, numerosas ligações de hidrogénio são contribuídos a partir do esqueleto do péptido enquanto Ile7 actua como um resíduo espaçador que permite um contacto óptimo com o bolso primário. O modo de ligação e interacções de HAKRRLIF com CBG é mostrado na Figura 2.
A segmentação da interacção proteína-proteína CBM / CBG irá inibir a actividade da quinase de CDK2 / ciclina A, a CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e esta deve desencadear apoptose mediada E2F1 de células cancerosas enquanto as células normais que não afectam 7. Embora CBM péptidos derivados são inibidores eficazes de CDKs do ciclo celular, é improvável que sejam úteis como fármacos, devido à sua metabólicainstabilidade e falta geral de permeabilidade celular. Para este fim, temos aplicado a estratégia REPLACE, a fim de converter esses inibidores peptídicos potentes em mais compostos droga-como para a prossecução do desenvolvimento de terapias anti-tumorais que exploram E2F1 desregulamentado por meio de CDK2 / ciclina A inibição. O protocolo a seguir resume o trabalho que foi concluído na aplicação do REPLACE para a ranhura de ciclina. No primeiro exemplo, foram identificados grupo terminal substituições semelhantes a fármacos para o tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF. Além disso melhorias nestes grupos foram investigados em um estudo de validação adicional para REPLACE. Também são apresentados os resultados obtidos nestes estudos representativos.
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Protocol
1. Identificação Computacional de Moléculas Pequenas Potencial Capping Grupos
Nota: Em princípio, uma variedade de acoplamento ou farmacofóricos métodos de pesquisa podem ser utilizados para prever potenciais grupos de protecção. O principal objectivo dos estudos de substituição é computacionais para identificar pequenas moléculas que retêm as características e as interacções dos aminoácidos que são substituídos.
- Validação do protocolo LigandFit encaixe 14
Nota: Em estudos anteriores, o método de acoplamento (LigandFit 15, um módulo do pacote de programas de modelagem molecular, descoberta Estúdio 3.0) foi validado para garantir que este algoritmo é suficiente para reproduzir modos de ligação de conhecida Ncaps e para demonstrar que os resultados obtidos para compostos desconhecidos são preditivos 14.
- Utilizando os seguintes passos (1,2 - 1,5), identificar os parâmetros óptimos para LigandFit como se segue: PLP1 PTgrade ergy para a geração de pose, minimização de poses gerados ea função de pontuação PLP1 para a análise das poses.
- A fim de limitar as conformações obtidas e para posicionar de forma adequada ligandos para a formação da ligação covalente no péptido tampado, definir as azoto e átomos de azoto amida indole de Trp217 e Gln254, respectivamente, como filtros para interacção de ligação de hidrogénio.
- Concepção e encaixar uma biblioteca de fragmentos de alternativas para a CDK2 / ciclina A receptor (2UUE). Priorizar grupos capeadores potenciais para a síntese e de abastecimento comercial baseado em PLP1 de pontuação, as interações com filtros de interação e complementaridade com a CBG. As várias etapas necessárias para LigandFit de ancoragem são as seguintes.
- Preparação de receptor de local de ligação 14
- Importar a CDK2 / ciclina A estrutura cristalina (PDB ID: 2UUE) para uma janela de visualização no software. Esta estrutura contém o FLIP previamente identificada 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) RLIF ligado ao sulco de ciclina (Figura 3).
- Excluir ou manter no lugar os resíduos RLIF (C-terminal). Quando a sequência do péptido é retido, utilizar o grupo amino N-terminal do péptido, tal como um filtro de interacção para o ligando. Dos "as interacções receptor-ligando" ferramentas, criar uma esfera em torno do N-cap 3,5-DCPT de Show esfera / Hide site. A esfera é criado para definir a região activa no local de ligação, onde as interacções ligando-receptor são permitidos para ocorrer durante a ligação.
- Definir o local de ligação mais longe da "local encontrar o volume de ligando seleccionado" e excluir o ligante 3,5-DCPT da proteína. Realizar esta etapa para definir o volume de ligação dentro da esfera criado.
- Defina as de nitrogênio e nitrogênio amida átomos de indole dos resíduos Trp217 e Gln254 como filtros de interacção para ligações de hidrogênio. Defina os filtros de interação para que apenas os poses que inteRact com os átomos de resíduos jogo será filtrado durante o processo de ancoragem, portanto, preservar as interações importantes nas poses que atracam.
- Preparação de ligandos 14
- Design uma biblioteca de 100 grupos de protecção potenciais com base em critérios incluindo o peso molecular inferior a 500, a presença de um grupo carboxilato para ligação com o péptido truncado e a inclusão de grupos hidrofóbicos adequados (grupo fenilo substituído) para a interacção de van der Waals no bolso secundário como mostrado na Tabela 1.
- Selecione anéis heterocíclicos para imitando interações de ligação de hidrogênio com peptídeo Trp217 e substituintes incluído para substituir interações de emparelhamento de iões de cadeias laterais básicas do HAKRRLIF. Encaixe os ligandos como as respectivas moléculas de aldeído, de modo que o oxigénio do carbonilo pode interagir com o átomo de azoto da amida de Gln254 semelhante a espinha dorsal do péptido progenitor péptido (Tabela 1).
- Antes de docrei, minimizar ligantes destinados a um baixo conformação de energia e se preparar em um estado de ionização adequado por meio do "Prepare ligantes" protocolo. Desenhar e exportar estes tampões potenciais N no formato de arquivo .sdf em ChemDraw para uma folha de cálculo antes de serem importados para o software.
Nota: Preparar protocolo ligandos é usado para minimizar a todos os ligandos para ser acoplado aos seus estados de energia mais baixos e as taxas de ionização foram aplicados aos átomos aplicáveis. Os parâmetros padrão são usados para esta etapa.
- Ancoragem dos ligandos para a Ciclina A Ranhura 14
- Selecione a rotina de LigandFit conjunto protocolo interacções ligando-receptor do software. Use o receptor e os ligantes preparados como entrada para este protocolo.
- Para estas corridas selecione PLP1 como rede de energia, especificar que posa ser minimizado de energia e que o número de poses gerados como 10. Deixe todos os outros parâmetros nos valores padrão.
Nota: é LigandFitum método de acoplamento que pode identificar e gerar posturas de alta afinidade e potencial complementaridade com o local activo de uma proteína usando um filtro de comparação forma base que é combinado com um algoritmo de busca conformacional de Monte Carlo. A rede de energia utilizada pelo programa de acoplamento é o campo de força para a geração de interacções ligando-receptor e coloca potenciais. PLP1 é potencial linear por partes que prioriza especificamente interações de ligação de hidrogênio e onde o tipo de átomo PLP é atribuído para cada átomo ligando não átomo de hidrogénio ou receptor não-hidrogénio.
- Análise dos resultados
- Em primeira instância, a exposição apresenta no programa visualizador e, em seguida, classificar por descendente valores da pontuação PLP1. Utilizar as funções de pontuação, tais como PLP1 para estimar a afinidade de ligação de um ligando acoplado com base em um ligando candidato representar geometria e interacção não covalente com a estrutura de receptor alvo.
Nota: Aqui, a função PLP1 pontuação foi encontrado para give os melhores resultados, uma vez que inclui uma estimativa da ligação de hidrogénio. - Analisar visualmente o top 25% das poses marcou para 1) superimposability com o grupo de tampar conhecido (com um (RMSD relativa desvio quadrado médio) valor inferior a 2 a), 2) cumpriu filtros de interação e 3) a complementaridade visual com o sulco ciclina . Aceita-se que uma corretamente encaixado representar (em comparação com uma estrutura experimental) tem um valor de RMSD <2 Å.
- Examinar posturas de complementaridade visual, que é definido como tendo enchimento eficiente da bolsa de ligação de uma maneira que seja consistente com relações estrutura-actividade conhecidas. Filtros de interacção são definidas para incluir restrições átomo que requerem contactos intermoleculares conhecidas como sendo críticos para a ligação e / ou são necessários para colocar o grupo de capeamento potencial na geometria correcta para a formação da ligação amida. Três exemplos de poses que atracam dos grupos de nivelamento N potenciais que fazem ligações de hidrogênio com interaction filtros são mostradas na Figura 4.
- Em primeira instância, a exposição apresenta no programa visualizador e, em seguida, classificar por descendente valores da pontuação PLP1. Utilizar as funções de pontuação, tais como PLP1 para estimar a afinidade de ligação de um ligando acoplado com base em um ligando candidato representar geometria e interacção não covalente com a estrutura de receptor alvo.
2. Síntese e Caracterização de Grupos N -capping Potenciais
- Síntese de grupos N-capsulação.
- Para a síntese, todos os comerciais usar materiais de partida, solventes e reagentes, como obtido. Sintetizar potenciais grupos N-capsulação por química orgânica sintética convencional (Figura 5 12,13 para um exemplo).
- Realizar a cromatografia em camada fina (TLC) sobre gel de sílica para monitorizar reacções.
- Dissolve-se o material de partida e a mistura de reacção (1 mg) na fase móvel e identificá-los na placa de TLC utilizando tubos capilares.
- Colocar a placa de TLC em que a câmara que contém a fase móvel (acetato de etilo e hexano numa razão de 35:65). Uma vez que a fase móvel atinge 90% da placa de TLC, remover e secar a placa.
- Use luz UV para detectar as misturas de reacção e o material de partida como manchas visíveis. Calcular a R f de todos os pontos (relação entre distância percorrida pelo local e a fase móvel).
Nota: A reacção está completa quando não há mancha visto no Rf do material de partida.
- Após a conclusão da reacção trabalhar-se a mistura de reacção por colocação em um funil de separação e lavagem com ácido aquoso ou solução de base, conforme apropriado. Recolhe-se o solvente orgânico, evapora-se que em evaporador rotativo e seca-se o produto bruto obtido sob vácuo.
- Dissolve-se 500 mg de produto em bruto em 3-5 ml de solvente adequado e adicionar a um 1 g de sílica ou RP18 para amostras e seco ao ar. Colocar a t para amostras contendo o produto em bruto em cartuchos Flash / RP SNAP sílica e purifica-se o material bruto utilizando cromatografia automatizado flash de alto desempenho (de acordo com o protocolo do fabricante) empregando um g coluna SNAP 100 com um funcionamento de gradiente a partir de 6% de acetato de etilo: 94 % de hexanos a 50% de acetato de etilo e hexano a 50% sobre15 volumes de coluna.
- Seca-se o produto purificado recolhido em solvente de cromatografia flash utilizando um evaporador rotativo por evaporação de todo o solvente até à secura e secar ainda mais o produto sob vácuo para remover todos os solventes residuais. Realizar uma caracterização do produto purificado por RMN, MS e HPLC analítica.
- Por 1 H RMN e 13 C RMN, pesa cerca de 10 mg da amostra purificada, dissolvê-lo num solvente deuterado adequado, e transferir o conteúdo para um tubo de RMN seco para gravar os espectros de RMN 2,14.
- Grave o 1 H NMR e espectros de 13 C NMR de alto campo com um espectrómetro de RMN (300 MHz mínimo). Adquirir espectros de massa usando um QTOF (Tandem quadruple-1 hora do espectrômetro de massa de voo), ionização electrospray (ESI) ou um VG 70S (duas vezes focando espectrômetro de massa de sector magnético, EI) 2,14.
- Analisar a pureza dos produtos por HPLC com um detector de foto-díodos e equipado comA C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5? m para análise. Utilize uma corrida gradiente a partir de 100% de água (0,1% ácido trif luoroacético) a 60% de acetonitrilo (0,1% ácido trifluoroacético) durante 30 minutos e mantenha o gradiente durante 4 min. Extraia os cromatogramas em 226 e 254 nm 2,14.
Nota: purezas analíticos dos compostos avaliados foram> 95%.
3. síntese em fase sólida para a Geração de flips 2
- Síntese de flips cobertas de N
- Montar compostos peptídicos N-tampado por meio de métodos de síntese de fase sólida padrão utilizando os seguintes passos.
- Activar a 5 equivalentes do ácido aminado C-terminal de (Fmoc-Phe) em 4,4 equivalentes de O -Benzotriazole- N, N, N ', N' -tetrametil-urónio-hexafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) em 2 ml de DMF durante 5 min. Carregar a mistura de HBTU Fmoc-Phe na resina Rink utilizando 6 equivalentes de diisopropiletilamina (DIPEA, 103.13mg) durante 1 h à TA.
- Remover o grupo protector Fmoc a partir do resíduo do terminal C utilizando 20% de piperidina em 3 ml de DMF durante 10 min. Pares aminoácidos subsequentes (por exemplo, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC) passo a passo. Em cada passo, 5 equiv par do aminoácido seguinte utilizando 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) e 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) em 2 ml de DMF durante 1 h à TA.
- Aplicar ciclos de lavagem (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 mL de DCM), após os passos de acoplamento de aminoácidos e de desprotecção de Fmoc descritos acima. Depois da montagem de péptidos, utilizando grupos de 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) e 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) par de N-capsulação em 2 ml de DMF durante 1 h à TA.
- Após a conclusão da montagem péptido, tratar a mistura reaccional com 2 ml da mistura de clivagem (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N para remover grupos protectores da cadeia lateral, e vira clivam a partir da resina. Tritura-se o produto resultante com éter dietílico frio para precipitar e iconcentrado de f necessário em um evaporador rotativo.
- Montar compostos peptídicos N-tampado por meio de métodos de síntese de fase sólida padrão utilizando os seguintes passos.
- Síntese de flips N-tampado-C-tampado
- Pesar e dissolve-se o péptido Leu-Arg no terminal-N protegido e tampado (16,1 mg, 0,02 mmol) em diclorometano, e adicionar [4- (3-clorofenoxi) piridin-2-il] metanamina (C-tampão) juntamente com S - benzotriazole- N, N, N ', N' tetrametilurónio (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) e N, N-di-isopropiletilamina (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Agita-se e controlar a reacção à temperatura ambiente até que a TLC / HPLC indica o consumo completo do material de partida. Após a conclusão da reacção, concentra-se a mistura de reacção em bruto utilizando um evaporador rotativo e, em seguida, distribui-se entre acetato de etilo e água.
- Separa-se a camada orgânica e aquosa; lava-se a camada orgânica com NaOH 1 N, HCl 1 N, e salmoura. Seca-se a camada orgânica com cerca de 1 g de sulfato de sódio e concentra-se o produto no evaporador rotativo. Finally tratar o produto S / N com a mistura de clivagem (95: 2,5: 2,5 de ácido trif luoroacético / H 2 O / TIPS) para desprotecção.
- Tritura-se o produto resultante com éter dietílico frio e, se necessário, concentrado em evaporador rotativo até à secura completa, a fim de remover todo o solvente. Além disso secar o produto sob vácuo para remover todos os solventes residuais.
- Purificação e caracterização de flips
- Purificar vira bruto usando métodos preparativos semi HPLC de fase inversa. Liofilizar os flips purificadas e caracterizar a sua massa molecular utilizando espectrometria de massa 2,14.
- Determinar a pureza analítica dos flips-se por HPLC com um detector de foto-díodos e está equipado com um (2) C18 100 A, 250 x 4,6 mm, 5? M. Usar um método de gradiente a partir de 95% de H 2 O (0,1% de ácido trifluoroacético) / 5% de acetonitrilo (0,1% de ácido trif luoroacético) e 35% H 2 O (0,1% de ido trifluoroacico) / acetonitrilo a 65% (0,1% trifluoroaceácido tic) ao longo de 30 min e segure o gradiente de 4 min. Extrato cromatogramas em 226 e 254 nm.
4. Polarização de Fluorescência Encadernação ensaio para a determinação do competidor Encadernação 2,14
- Realizar o ensaio em placas utilizando o seguinte procedimento de negro de 384 poços (138 ul).
- Diluir as amostras, péptidos marcador (4 nM), e os complexos de cinase (CDK2 / ciclina A - 18 ug / ml, CDK4 / ciclina D - 37 ug / ml) para se necessárias concentrações em tampão de ensaio (HEPES 25 mM, pH 7, 10 mM de NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, 1 mM de ditiotreitol (DTT).
- Para cada uma das cavidades da placa de 384 poços, adicionar: 5 ul de CDK4D1 ou CDK2CA (0,3 ug / poço purificada complexo recombinante humano da quinase), solução de composto de 5 ul, 5 ul de 30 nM de péptido marcador (fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val -Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly ou fluoresceinyl-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly péptido marcador). Use 5 ul de cada DMSO (6%), da-manhãR, traçador e 5 ul de DMSO (6%), complexo de quinase, como poços de controlo traçador
- Após a adição de todos os componentes, centrifugar a placa a 500 rpm durante 1 minuto (41,16 x g) à TA e depois incubar a placa com agitação durante 45 min à TA. Utilizando um leitor de placa multimodo e equipado com detector de 485 nm / 535 nm de excitação / emissão e uma filtros espelho dicróico leitura da intensidade de fluoresceina de cada poço na placa.
- Calcula-se a polarização média relativa (MP) para todas as amostras de ensaio, utilizando a equação que mostra abaixo. Determine os valores de IC50 por regressão logarítmica, correlacionando mps relativos e testando concentrações.
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Representative Results
As interacções de HAKRRLIF com a ranhura de ciclina são mostrados na Figura 2. Os resíduos peptídicos, que representam os principais determinantes de ligação incluem Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 com outros resíduos proporcionando menores contribuições 12,13,18. Neste caso, o estudo SUBSTITUIR estratégia tem sido utilizado a fim de encontrar alternativas de fragmentos para os resíduos do tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF, mimetizando principalmente as interacções de Ala2 e Arg4. Uma biblioteca de fragmentos NCAP potenciais (Tabela 1) foi construído com base nos critérios. Cada molécula foi ancorado no local de ligação desocupada criado por truncamento do grupo de N-capsulação da sua estrutura de cristal com ciclina A (PDB ID: 2UUE). Alternativas de ligandos potenciais foram seleccionados com base na análise pose e PLP1 de pontuação como uma previsão da afinidade (exemplos de posturas entrados são mostrados na Figura 4). A síntese de um NCAP confirmada (1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-ácido carboxílico) é mostrado na Figura 5, onde esta molécula foi gerado em três etapas e purificado por cromatografia flash automatizada (Figura Suplementar 1). A 1 H? NMR, 13C NMR, MS e HPLC dados de caracterização de um composto representativo 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico são mostrados nas Figuras 1-5 Suplementar respectivamente. A síntese de flips N-tapados e vira N-tampado-C-capped estão representados nas Figuras 7 e 8 e os dados de caracterização estão indicados no Quadro 2. A afinidade de ligação tanto para CDK2 / ciclina A e CDK4 / ciclina D foi determinada usando o ensaio de FP descritos e os resultados estão apresentados na Tabela 3. Dos compostos testados, flips contendo triazole N-caps base foram determinados a ter maior afinidade para CDK2 / ciclina A e CDK4 / ciclina D e composto representativos foram testados em ensaios de base celular. Como um todo, as moléculas identificadas FLIP foram consideradas como mais droga, e para reter a maior parte das interacções do octapéptido HAKRRLIF. Tetrapéptidos tapados possuía menor potência comparada com HAKRRLIF no entanto eram de actividade comparável ao pentapéptido RRLIF (Tabelas 3 e 4). Estes resultados mostram que os compostos obtidos tinham melhorado semelhança droga, mas esta foi obtida à custa da afinidade de ligação um pouco comprometida.
A actividade anti-proliferativa estes ligandos CGI foi avaliada e celular valores de IC50 inferiores a 30 uM foram observados em U2OS DU145 e linhas celulares de cancro.
Figura 1. Visão geral da estratégia de REPLACE. Por favor, cl ick aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Encadernação e interações de HAKRRLIF em CBG Painel esquerdo:. Estrutura modelada de HAKRRLIF ligado ao CBG. A ranhura de ciclina é constituído por duas bolsas hidrofóbicas - um bolso maior primária (direita, ocupados por Leu6 e Phe8) e um bolso menor secundário (esquerda, ocupada por Ala2) e que estão ligados em ponte por resíduos ácidos descritos no vermelho. Painel direito: Outras interações importantes incluem contatos de ligação de hidrogénio do esqueleto peptídico (com Trp217, Gln254, Ile281), e as interações de emparelhamento de iões dos três resíduos básicos do peptídeo (com Glu220, Glu224, Asp283). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. modo de ligação de 3,5-DCPTRLIF em CBG. A ligação do 3,5-DCPT-RLIF é mostrado com interações de ligação de hidrogênio (representado por linhas tracejadas verdes) com átomos das cadeias laterais de Trp217 e Gln254. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. resultados de ancoragem selecionados. Entrado poses de 3 representativos grupos N-tampando são mostrados. Cada um destes compostos fazer ligações de H com os átomos de filtro interação de Trp217 e Gln254 e como representado por linhas tracejadas verdes. O substituinte fenil faz interações de van der Waals com a bolsa hidrofóbica secundário. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 5. Síntese de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Síntese de flips N-tampado por síntese em fase sólida. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. Síntese de N-bisInverte PPED-C-tampadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Biblioteca de pequenas moléculas ancoradas e as previsões resultantes de energia de ligação utilizando a função PLP1 pontuação.
| Peptide | Pureza | Coluna Dimensões | Método | Quociente de vazão | HPLC tempo de retenção | MW teórica | Observado MW |
| 5843 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 23,9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 22,4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 24,2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 9 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 11.2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 9.4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 9.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 20,4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 23,3 | 785.7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4,6 × 250 mm | 5-65% de acetonitrilo / água / TFA a 0,1% | 1 mL / min | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Tabela 2. Dados Analíticos para CGI péptidos de ligação e flips.
Tabela 3. A ligação in vitro de selecionados flips N-tampado para CDK2CA e CDK4CD.
Tabela 4. Em ligação do selecionado N & C vitro tampado vira para CDK2CA e CDK4CD.
Suplementar Figura 1-5. Purificação e caracterização de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico.
Figura Suplementar 1. cromatograma flash de produto obtido a partir do passo 1. Há quatro picos de eluição, o pico principal que elui a 55% acetato de etilo / 45% hexano foi encontrado para ser o produto desejado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Suplementar 1 HRMN de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-car ácido boxylic. O espectro de RMN mostra 3 protões metílicos alifáticos e 3 protões aromáticos. A integração de todos os três picos é mostrado abaixo do espectro de RMN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. RMN de 13C suplementar 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. Há dez átomos de carbono na estrutura, RMN de 13C com 10 sinais de carbono para cada átomo. A integração para cada pico é mostrado abaixo do espectro de RMN. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 4. MS suplementar de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. O peso molecular do composto é mostrado como pico progenitor a 237. O molecular real peso do composto é 237,64. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. HPLC suplementar de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. A pureza do produto é determinada como 100% como mostrado no cromatograma de HPLC. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
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