Abstract
REPLACE est une stratégie unique développé pour cibler plus efficacement les interactions protéine-protéine (IPP). Il vise à élargir l'espace disponible de médicament cible en fournissant une meilleure méthodologie pour l'identification d'inhibiteurs de ces sites de liaison et qui représentent la majorité des cibles potentielles de médicaments. L'objectif principal de ce document est de fournir un aperçu de la méthodologie de l'utilisation et l'application de la stratégie REMPLACER qui implique des approches de calculs de chimie et synthétiques. REPLACE est illustré par son application au développement de kinases cycline non-ATP concurrentiel dépendantes (CDK) inhibiteurs comme agents thérapeutiques anti-tumorales. CDK sont souvent déréglementés dans le cancer et sont donc considérés comme des cibles importantes pour le développement de médicaments. L'inhibition de la CDK2 / cycline A dans la phase S a été rapporté à favoriser l'apoptose sélective des cellules cancéreuses de manière indépendante de p53 par la voie de E2F1. Le ciblage interaction protéine-protéine à la cycline binding rainure (GBC) est une approche qui permettra à l'inhibition spécifique du cycle cellulaire sur CDK transcription. La CBG est reconnu par une séquence consensus dérivée à partir de substrats de CDK et des protéines suppresseurs de tumeur appelé le motif de liaison (CBM) cycline. Le CBM a déjà été optimisé pour un octapeptide de p21Waf (HAKRRIF), puis encore tronqué à un pentapeptide conservant une activité suffisante (RRLIF). Peptides en général ne sont pas cellule perméable, sont métaboliquement instable et donc la REPLACE (remplacement partiel avec Ligand Alternatives travers Computational enrichissement) stratégie a été appliquée afin de générer plusieurs inhibiteurs de drug-like. La stratégie commence avec la conception du fragment ligaturé peptides inhibiteurs (de flips) qui inhibent sélectivement cycle cellulaire des complexes CDK / cycline. FLIP ont été générés par le remplacement itérative résidus de HAKRRLIF / RRLIF avec le fragment comme de petites molécules (groupes de recouvrement), à partir de l'extrémité N-terminale (Ncaps), suivis par le remplacement surl'extrémité C-terminale. Ces composés sont des points de départ pour la production d'inhibiteurs de CDK non compétitifs de l'ATP comme agents thérapeutiques anti-tumorales.
Introduction
Dans cet article, une étude de l'application de la REPLACE (remplacement par des alternatives ligand partielle à l'aide de calcul enrichissement) stratégie visant à convertir des inhibiteurs peptidiques de interactions protéine-protéine en plus de molécules pharmaceutiquement pertinents cas est décrit 1-3. Bien que les IPP représentent une source de cibles potentielles de médicaments, mais sous-exploité riche, méthodologies existantes sont largement insuffisants pour faire de ces largement accessible. Les stratégies actuelles, y compris fragment conception basée sur 4, criblage à haut débit 5 et 6 peptides agrafées ont apporté des progrès, mais ceux-ci sont dans de nombreux cas inefficaces. En conséquence, davantage de progrès et des approches plus efficaces sont nécessaires. REPLACE a été entièrement validée dans le développement d'inhibiteurs de kinases qui ont des propriétés améliorées de drug-like et qui ont un potentiel de développement en tant qu'agents thérapeutiques anti-tumorales. Cette stratégie est illustrée dans le développement d'inhibiteurs non-ATP de cellulesCDK de cycle et implique comme suit: 1) l'obtention d'informations structurelles 3D sur les interactions de HAKRRLIF / RRLIF sillon de liaison avec la cycline; 2) déterminer les déterminants de liaison importants pour l'interaction peptidique; 3) la troncature du peptide N-terminale contenant un ou plusieurs déterminants de liaison; 4) l'identification de calcul de potentiels de petites molécules variantes alternatives (ligands partiels, PLA) pour la partie tronquée du peptide et qui conservent les interactions clés du peptide parent; 5) la synthèse ou l'approvisionnement commercial de PLA prédits se lier avidement avec le sous-site précédemment occupée par le résidu (s) peptidique est supprimé; 6) synthèse de feuillette ligature des meilleurs PLA au peptide tronqué en utilisant une synthèse en phase solide; 7) Les essais de culbutes dans un liant in vitro ou un dosage fonctionnel (polarisation de fluorescence dans le contexte / cycline CDK), suivie d'une caractérisation plus poussée dans un essai de viabilité des cellules. Une représentation schématique de REMPLACER stratégy est montré dans la figure 1. Dans cet article, itérations de la stratégie REPLACE sont discutés et l'application de CDK2 / cycline A décrit en détail. CDK sont soupçonnés d'être directement ou indirectement déréglementé dans la majorité des tumeurs et sont donc considérés cancer appropriée cibles médicamenteuses 7. CDK nécessite association avec cyclines pour l'activation complète et phosphorylent ensuite protéines clés impliquées dans la régulation du cycle cellulaire 8. Les deux principaux groupes de CDK sont les isotypes et qui éliminent les points de contrôle du cycle cellulaire [G1 / S (CDK4 / cycline D, CDK6 / cycline D et CDK4 / cycline E), la phase S (CDK2 / cycline A) et G2 / M (CDK1 / cycline B)] et les régulateurs de l'ARN polymérase par phosphorylation (CDK7 / cycline H, CDK8 / cycline C, CDK9 / cycline T). Une étape clé dans la progression de la phase S se produit lorsque le facteur de transcription E2F1 forme un complexe avec la protéine DP qui se lie ensuite à l'ADN et initie la transcription du gène. CDK2 / cycline A est nécessaire pour neutraliser la transcription E2F1activité à travers la phosphorylation conduisant ainsi à libérer du complexe E2F1-DP et sa dégradation ultérieure. L'inhibition de CDK2 / cycline A est censé maintenir E2F1 dans son état ADN lié à l'activation persistante conduisant. Le niveau résultant de l'E2F-1 l'activité dépassera le seuil nécessaire pour induire l'apoptose p53 indépendante suggérant donc une stratégie thérapeutique. En raison de p53 et dérégulé voies pRb, des niveaux élevés de l'E2F-1 se produisent fréquemment dans les cellules cancéreuses et l'inhibition de la CDK2 / cycline A doit conduire à l'apoptose sélective dans les tumeurs et peut être considéré comme une cible de cancer validée 7.
Cliniquement inhibiteurs de CDK étudiés ciblent le site hautement conservée ATP liaison menant à traverser la réactivité parmi les plus de 500 protéines kinases dans le kinome humaine et qui pourrait donner lieu à des effets et de la toxicité 9 Side. Une autre approche est non-ATP inhibition compétitive en ciblant le recrutement de substrat à travers la CBGprésent sur la cycline sous-unité régulatrice positive et qui est donc distincte et distante de l'ATP site de liaison 10,11. Le CBG est principalement hydrophobe présente une rainure dans la cycline A, la cycline D et la cycline E et a été montré pour reconnaître une séquence consensus trouvée dans les substrats et des suppresseurs de tumeurs. Comme un peptide isolé, le motif de liaison de la cycline (CBM) se lie à la CBG et a été montré pour inhiber l'activité de kinase de CDK du cycle cellulaire. Le CBM a été optimisé pour un octapeptide (HAKRRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 de 0,07 ± 0,02 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 de 0,88 ± 0,34 M) et, en outre tronquée à un pentapeptide qui représente un bon compromis entre le poids moléculaire de la drogue la ressemblance et de la puissance (RRLIF, CDK2 / cycline A IC 50 de 1,01 ± 0,17 uM, CDK4 / cycline D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Les GBC composent d'une grande primaire et secondaire plus petite poche hydrophobe qui sont comblé par une acidic région (comprend Glu220, Glu224 et Asp283). Les déterminants de liaison clés de HAKRRLIF comprennent l'interaction de Ala2 avec les liaisons poche hydrophobe secondaire, appariement d'ions et d'hydrogène de Lys3, Arg 4 et arg5 avec la région acide et un degré élevé de complémentarité de Leu6 et Phe8 avec le site lipophile primaire. En outre, de nombreuses liaisons hydrogène sont contribué au squelette du peptide tandis Ile7 agit comme un résidu d'écartement permettant un contact optimal avec la poche primaire. Le mode de fixation et les interactions des HAKRRLIF avec CBG est montré dans la figure 2.
Cibler le CBM / CBG interaction protéine-protéine inhibe l'activité kinase de CDK2 de / cycline A, CDK2 / cycline E et CDK4 / cycline D, ce qui devrait déclencher l'apoptose à médiation par E2F1 des cellules cancéreuses sans affecter les cellules normales 7. Bien que CBM peptides dérivés sont des inhibiteurs efficaces de CDK du cycle cellulaire, il est peu probable qu'ils soient utiles comme médicaments en raison de leur métabolismel'instabilité et le manque général de la perméabilité cellulaire. À cette fin, nous avons appliqué la stratégie REPLACE afin de convertir ces inhibiteurs peptidiques puissants dans plusieurs composés de drogues pour la poursuite du développement de produits thérapeutiques anti-tumorales exploitant E2F1 déréglementé travers CDK2 / cycline A inhibition. Le protocole suivant résume travail qui a été accompli dans l'application de REPLACE à la gorge de la cycline. Dans le premier cas, le remplacement des groupes de plafonnement des drogues pour le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF ont été identifiés. En outre des améliorations dans ces groupes ont été étudiés dans une étude de validation supplémentaire pour REPLACE. Les résultats représentatifs de ces études sont également présentés.
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Protocol
1. Computational identification du potentiel à petites molécules des groupes de recouvrement
Remarque: En principe, une variété de pharmacophores accueil ou méthodes de recherche peut être utilisé pour prédire les groupes de coiffage potentiels. Le but principal de calcul dans REMPLACER études est d'identifier de petites molécules qui conservent les caractéristiques et les interactions des acides aminés qui sont substitués.
- Validation du protocole LigandFit d'accueil 14
Remarque: Dans des études antérieures, la méthode d'accueil (LigandFit 15, un module dans le moléculaire suite de programme de modélisation, Discovery Studio 3.0) a été validé afin d'assurer que cet algorithme est suffisante pour reproduire les modes de liaison des Ncaps connu et de montrer que les résultats obtenus pour composés inconnus sont prédictive 14.
- En utilisant les étapes (1,2 - 1,5) suivants, identifier les paramètres optimaux pour LigandFit comme suit: en PLP1ergy grille pour la génération de pose, la minimisation des poses générées et la fonction de notation PLP1 pour l'analyse des poses.
- Afin de limiter les conformations obtenus et à positionner de manière appropriée ligands pour la formation de liaison covalente dans le peptide coiffé, d'azote et de régler les atomes d'azote d'indole amide de Trp217 et Gln254 respectivement en tant que filtres d'interaction pour une liaison hydrogène.
- Conception et ancrer une bibliothèque d'alternatives de fragments dans la CDK2 / cycline Un récepteur (2UUE). Prioriser les groupes de coiffage potentiels pour la synthèse et l'approvisionnement commercial basé sur PLP1 notation, les interactions avec les filtres d'interaction et de complémentarité avec la CBG. Les différentes étapes nécessaires à LigandFit accueil sont les suivantes.
- Préparation du récepteur de site de liaison 14
- Importez le CDK2 / cycline A structure cristalline (id pdb: 2UUE) dans une fenêtre de visualisation dans le logiciel. Cette structure contient les FLIP précédemment identifié 5-méthyl-1-phényl-1 H-1, 2,4-triazole-3-carboxamide (3,5-DCPT) FRVR lié à la rainure de la cycline (Figure 3).
- Supprimer ou de garder en place les résidus FRVR (C-terminale). Quand la séquence du peptide est conservée, utiliser le groupe amino N-terminal du peptide en tant que filtre pour l'interaction ligand. De les «interactions ligand-récepteur" outils, de créer une sphère autour de la N-Cap 3,5-DCPT de Show / Hide place sphère. La sphère est créée pour définir la zone active dans le site de liaison où les interactions ligand-récepteur sont autorisés à se produire au cours de la liaison.
- Définir le site de liaison plus loin de la "trouver le site que le volume du ligand choisi" et supprimer le ligand 3,5-DCPT de la protéine. Effectuer cette étape pour définir le volume de la liaison au sein de la sphère créée.
- Set d'azote et des atomes d'azote d'indole amide des résidus Trp217 et Gln254 que des filtres d'interaction pour une liaison hydrogène. Réglez les filtres d'interaction de sorte que seuls les poses qui porcelaineRact avec les atomes de résidus de consigne sera filtrée pendant le processus d'accueil préservant ainsi des interactions importantes dans les poses amarrés.
- Préparation de ligands 14
- Concevoir une bibliothèque de 100 groupes de coiffage potentiels sur la base de critères tels que la masse moléculaire inférieure à 500, la présence d'un groupe carboxylate pour la ligature avec le peptide tronqué et l'inclusion de groupes hydrophobes appropriés (groupe phényle substitué) de van der Waals interaction dans la poche secondaire, indiqué dans le tableau 1.
- Sélectionner noyaux hétérocycliques pour mimer des interactions de liaison hydrogène avec le peptide et Trp217 substituants inclus pour remplacer les interactions ion-appariement de chaînes latérales basiques de l'HAKRRLIF. Dock ligands que des molécules d'aldéhyde respectifs de sorte que l'oxygène du carbonyle peut interagir avec l'atome d'azote d'amide Gln254 analogue à squelette peptidique dans le peptide parent (Tableau 1).
- Avant docroi, minimiser ligands conçus pour une conformation à faible énergie et de préparer dans un état d'ionisation appropriée en utilisant le protocole "Préparer ligands". Dessiner et exporter ces N bouchons potentiels dans le format de fichier .sdf dans ChemDraw pour une feuille de calcul avant d'être importés dans le logiciel.
Note: Préparer protocole de ligands est utilisée pour minimiser tous les ligands d'être amarré à leurs états d'énergie les plus bas et les frais d'ionisation ont été appliqués aux atomes applicables. Les paramètres par défaut sont utilisés pour cette étape.
- Accueil des ligands dans la cycline A Groove 14
- Sélectionnez la routine LigandFit de récepteur-ligand protocole de interactions ensemble du logiciel. Utilisation du récepteur et les ligands préparé comme entrée pour ce protocole.
- Pour ces essais, sélectionnez PLP1 comme grille de l'énergie, précisent que pose l'énergie soit réduit au minimum et que le nombre de poses générés 10. Laissez tous les autres paramètres, les valeurs par défaut.
Remarque: LigandFit estun procédé d'ancrage qui permet d'identifier et de générer des poses de grande affinité et complémentarité potentiel avec le site actif d'une protéine en utilisant un filtre de comparaison de forme à base qui est combinée avec une recherche de Monte Carlo algorithme de conformation. La grille de l'énergie utilisée par le programme d'accueil est le domaine pour générer interactions ligand-récepteur et les poses potentiels vigueur. PLP1 potentiel est linéaire par morceaux qui privilégie en particulier des interactions de liaison hydrogène et où le type de PLP atome est attribué pour chaque atome de ligand non hydrogène ou un atome non-hydrogène du récepteur.
- Analyse des résultats
- Dans le premier cas, l'affichage pose dans le programme de visualiseur puis trier par ordre décroissant des valeurs de la partition PLP1. Utiliser des fonctions telles que la notation PLP1 pour estimer l'affinité de liaison d'un ligand à base d'un quai ligand candidat pose géométrie et de l'interaction non covalente avec la structure de récepteur cible.
Remarque: Ici, la fonction PLP1 de notation a été trouvé à give les meilleurs résultats car il comprend une estimation de la liaison hydrogène. - Analyser visuellement le top 25% des poses marqués pour 1) superposabilité avec le groupe de coiffage connu (ayant un rapport écart quadratique moyen (RMSD) valeur inférieure à 2 a), 2) remplie filtres d'interaction et 3) la complémentarité visuel avec la rainure de la cycline . Il est admis que dans une pose amarré correctement (par rapport à une structure expérimentale) a une valeur RMSD de <2 Å.
- Examinez poses pour complémentarité visuelle, qui est défini comme ayant un remplissage efficace de la poche de liaison d'une manière qui soit compatible avec les relations structure-activité connue. Les filtres d'interaction sont définis pour inclure des restrictions d'atomes qui nécessitent contacts intermoléculaires connues pour être essentielles pour la liaison et / ou sont nécessaires pour positionner le groupe de coiffage potentiel dans la géométrie correcte pour la formation de liaisons amide. Trois exemples de poses amarrés des groupes N coiffage potentiels faisant des liaisons hydrogène avec INTERACTIONSn filtres sont représentés sur la figure 4.
- Dans le premier cas, l'affichage pose dans le programme de visualiseur puis trier par ordre décroissant des valeurs de la partition PLP1. Utiliser des fonctions telles que la notation PLP1 pour estimer l'affinité de liaison d'un ligand à base d'un quai ligand candidat pose géométrie et de l'interaction non covalente avec la structure de récepteur cible.
2. synthèse et la caractérisation de N -capping Groupes potentiels
- Synthèse de N groupes de coiffage.
- Pour la synthèse, utiliser tous les commerciaux à partir des matériaux, des solvants et des réactifs obtenue. Synthétiser groupes potentiels de N-coiffage en chimie organique de synthèse classique (Figure 5 12,13 pour un exemple).
- Effectuer la Chromatographie sur couche mince (CCM) sur gel de silice pour des réactions de contrôle.
- On dissout le produit de départ et le mélange de réaction (1 mg) dans la phase mobile et les repérer sur la plaque de CCM en utilisant des tubes capillaires.
- Placer la plaque de CCM dans la chambre de réception de phase mobile (l'acétate d'éthyle et d'hexane dans un rapport 35:65). Une fois la phase mobile atteint 90% de la plaque de CCM, enlever et sécher à l'air de la plaque.
- Utilisez la lumière UV pour détecter les matériels et de réaction à partir des mélanges comme des taches visibles. Calculer la R f de tous les spots (rapport de la distance parcourue par la place et la phase mobile).
Remarque: La réaction est terminée lorsqu'il n'y a pas lieu vu au Rf du produit de départ.
- Après l'achèvement de la réaction travailler jusqu'à le mélange de réaction en le plaçant dans un entonnoir de séparation et de lavage avec un acide aqueux ou d'une solution de base selon le cas. Recueillir le solvant organique, évaporer dans un évaporateur rotatif et sécher le produit brut obtenu sous vide.
- Dissoudre 500 mg de produit brut dans 3-5 ml de solvant approprié et ajouter à un 1 g de silice ou RP18 samplet et sécher sous air. Placez le samplet contenant le produit brut dans les / RP SNAP cartouches flash de silice et de purifier le matériau brut par Chromatographie flash haute performance automatisée (selon le protocole du fabricant) employant une colonne SNAP 100 g avec une course de gradient à partir de l'acétate d'éthyle 6%: 94 % d'hexanes à acétate d'éthyle à 50% et plus de 50% d'hexanes15 volumes de colonne.
- Sécher le produit purifié recueilli dans un solvant de Chromatographie éclair en utilisant un évaporateur rotatif par évaporation tout le solvant à sec et encore sécher le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels. Effectuer la caractérisation du produit purifié par RMN, MS et HPLC analytique.
- Pour RMN 1 H et 13 C RMN, peser environ 10 mg de l'échantillon purifié, la dissoudre dans un solvant deutéré approprié, et transférer le contenu d'un tube de RMN à sec pour enregistrer le spectre RMN 2,14.
- Enregistrez la RMN 1 H et 13 spectres RMN C avec un champ haute spectromètre de RMN (minimum 300 MHz). Acquérir les spectres de masse en utilisant un QTOF (Tandem quadruple 1 heure de spectromètre de masse de vol), ionisation par électronébulisation (ESI) ou VG 70S (double focalisation spectromètre de masse à secteur magnétique, EI) 2,14.
- Analyser la pureté des produits par CLHP avec un détecteur à barrettes de diodes et équipé avecC18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um colonne pour analyse. Utilisez un terme de gradient à partir de 100% de l'eau (acide trifluoroacétique à 0,1%) à 60% d'acétonitrile (de l'acide trifluoroacétique à 0,1%) de plus de 30 min et maintenir le gradient pendant 4 min. Extraire les chromatogrammes à 226 et 254 nm 2,14.
Remarque: puretés analytiques des composés évalués étaient> 95%.
3. La synthèse en phase solide pour la génération de flips 2
- Synthèse de flips de N-capped
- Assemblez composés peptidiques N-plafonnés par des méthodes de synthèse en phase solide standard en utilisant les étapes suivantes.
- Activer 5 équivalents de l'acide aminé C-terminal (Fmoc-Phe) dans 4,4 équivalents d'O -Benzotriazole- N, N, N ', N' tétraméthyl-uronium-hexafluoro-phosphate (HBTU, 221,93 mg) dans 2 ml de DMF pendant 5 min. Chargez le mélange HBTU Fmoc-Phe sur la résine Rink utilisant 6 équivalents de diisopropyléthylamine (DIPEA, 103.13mg) pendant 1 heure à température ambiante.
- Éliminer le groupe protecteur Fmoc du résidu C-terminal en utilisant 20% de pipéridine dans 3 ml de DMF pendant 10 min. Couple acides aminés ultérieurs (par exemple, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-PMC), étape par étape. A chaque étape, deux 5 équivalents de l'acide aminé suivant en utilisant 6 équivalents de DIPEA (103,13 mg) et 4,4 équivalents de HBTU (221,93 mg) dans 2 ml de DMF pendant 1 heure à température ambiante.
- Appliquer cycles de lavage (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 ml de DCM) après couplage d'acides aminés et de déprotection Fmoc étapes décrites ci-dessus. Après l'assemblage d'un peptide, ou deux groupes en utilisant 6 équivalents de DIPEA (103,13 mg) et 4,4 équivalents de HBTU (221,93 mg) de N-coiffage dans 2 ml de DMF pendant 1 heure à température ambiante.
- À l'issue de l'ensemble de peptide, traiter le mélange de réaction avec 2 ml de mélange de clivage (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N pour supprimer protecteurs de chaîne latérale des groupes, et clivent flips de la résine. Triturer le produit résultant avec de l'éther diéthylique froid pour précipiter et if nécessaire concentré dans un évaporateur rotatif.
- Assemblez composés peptidiques N-plafonnés par des méthodes de synthèse en phase solide standard en utilisant les étapes suivantes.
- Synthèse de flips coiffe N-C-plafonnés
- Peser et dissoudre le peptide Arg-Leu-terminal coiffé N et protégé (16,1 mg, 0,02 mmol) dans du dichlorométhane et ajouter [4- (3-chlorophénoxy) pyridin-2-yl] méthanamine (C-CAP) avec O - benzotriazole N, N, N ', N' tétraméthyluronium hexafluorophosphate (HBTU, 16,7 mg, 0,02 mmol) et de N, N-diisopropyléthylamine (DIPEA, 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Agiter et surveiller la réaction à la température ambiante jusqu'à ce qu'une CCM / HPLC indique la consommation complète du matériau de départ. Après l'achèvement de la réaction, on concentre le mélange réactionnel brut en utilisant un évaporateur rotatif, puis on sépare l'acétate d'éthyle et de l'eau.
- Séparer la phase aqueuse et la couche organique; laver la couche organique avec du NaOH 1 N, du HCl 1 N et de la saumure. Sécher la couche organique avec environ 1 g de sulfate de sodium et on concentre le produit dans un évaporateur rotatif. Finally traiter le produit O / N avec le mélange de clivage (95: 2,5: 2,5 acide trifluoroacétique / H 2 O / TIPS) pour la déprotection.
- Triturer le produit résultant avec de l'éther diéthylique froid et, si nécessaire, concentré dans un évaporateur rotatif jusqu'à siccité complète afin d'éliminer tout le solvant. En outre sécher le produit sous vide pour éliminer tous les solvants résiduels.
- Purification et la caractérisation de flips
- Purifier FLIP brut en utilisant des méthodes semi-HPLC préparative en phase inverse. Lyophiliser les FLIP purifiées et de caractériser leur masse moléculaire en utilisant la spectrométrie de masse 2,14.
- Déterminer la pureté analytique des FLIP par HPLC avec un détecteur à barrettes de diodes et équipé d'un C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 um colonne. Utilisation d'une méthode de gradient à partir de 95% de H 2 O (acide trifluoroacétique à 0,1%) / 5% d'acétonitrile (acide trifluoroacétique à 0,1%) à 35% de H 2 O (acide trifluoroacétique à 0,1%) / 65% d'acétonitrile (0,1% trifluoroacel'acide tic) sur 30 min et détiennent le gradient pendant 4 min. Extrait chromatogrammes à 226 et 254 nm.
4. polarisation de fluorescence Essai de liaison pour la détermination de la liaison compétitive 2,14
- Effectuez le test en noir 384 puits (138 pl) plaques en utilisant la procédure suivante.
- Diluer les échantillons, des peptides traceurs (4 nM) et des complexes de kinase (CDK2 / cycline A - 18 ug / ml, CDK4 / cycline D - 37 ug / ml) aux concentrations nécessaires dans le tampon de dosage (HEPES 25 mM pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, 1 mM de dithiothréitol (DTT).
- Pour chaque puits de la plaque de 384 puits, ajouter: 5 pi de CDK4D1 ou CDK2CA (0,3 pg / puits purifiée complexe humain recombinant de kinase), solution de composé de 5 pi, 5 pi de 30 nM peptide traceur (fluorescéinyle Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu- (3ClPhe) -Gly-fluorescéinyle ou Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly peptide traceur). Utiliser 5 pi de chaque DMSO (6%), buffer, traceur et 5 pi de DMSO (6%), le complexe de kinase, comme traceur puits témoins
- Après l'addition des tous les composants, centrifuger la plaque à 500 tours par minute pendant 1 min (41.16 XG) à température ambiante et ensuite incuber la plaque avec agitation pendant 45 min à température ambiante. En utilisant un lecteur de plaque multimode et un détecteur équipé 485 nm / 535 nm excitation / filtres d'émission et un miroir dichroïque lire l'intensité fluorescéine de chaque puits de la plaque.
- Calculer la polarisation moyenne relative (mp) pour tous les échantillons d'essai en utilisant l'équation ci-dessous montre. Déterminer les valeurs IC50 par régression logarithmique en corrélant les députés et les tests relatifs concentrations.
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Representative Results
Les interactions de HAKRRLIF avec la rainure de la cycline sont présentés sur la figure 2. Les résidus peptidiques qui représentent les principaux déterminants de liaison comprennent Ala2, Arg4, Leu6 et Phe8 par d'autres résidus de fournir des contributions de plus petites 12,13,18. Dans cette étude de cas la stratégie REPLACE a été utilisée dans le but de trouver des alternatives fragments pour les résidus dans le tétrapeptide N-terminale de HAKRRLIF, imitant principalement les interactions de Ala2 et Arg4. Une bibliothèque de fragments potentiels Ncap (tableau 1) a été construit sur la base des critères. Chaque molécule a été ancré dans le site de liaison libéré créé par troncature du groupe N-coiffage à partir de sa structure cristalline avec la cycline A (PDB ID: 2UUE). Alternatives de ligands potentiels ont été sélectionnés sur la base de l'analyse de pose et PLP1 notation comme une prédiction de l'affinité (exemples de poses amarrés sont présentés dans la figure 4). La synthèse d'un Ncap confirmé (1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique) est représentée sur la Figure 5 où cette molécule a été générée en trois étapes et on le purifie par Chromatographie éclair automatisée (figure 1 supplémentaire). La RMN-H 1, 13-RMN, MS et HPLC données de caractérisation d'un composé représentatif de 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique sont présentés dans les figures 1-5 complémentaire respectivement. La synthèse de flips N-coiffés et retourne N-capped-C-coiffés sont représentés sur les figures 7 et 8 et les données de caractérisation sont présentées dans le tableau 2. L'affinité de liaison à la fois pour CDK2 / cycline A et CDK4 / cycline D a été déterminée en utilisant le dosage FP décrit et les résultats sont présentés dans le Tableau 3. Parmi les composés testés, flips contenant triazole N-caps base ont été déterminés à avoir la plus grande affinité pour CDK2 / cycline A et CDK4 / cycline D et composé représentatifs ont été testés dans des dosages à base de cellules. Dans l'ensemble, les molécules FLIP identifiées ont été trouvées être plus comme médicament, et de conserver la plupart des interactions de l'octapeptide HAKRRLIF. Tétrapeptides Sélectionné possédaient puissance plus faible par rapport à HAKRRLIF étaient cependant d'activité comparable au pentapeptide RRLIF (tableaux 3 et 4). Ces résultats montrent que les composés obtenus avaient une meilleure image de la drogue, mais cela a été obtenue au prix d'une affinité de liaison quelque peu compromise.
L'activité anti-proliférative de ces ligands CGI a été évaluée et cellulaire CI50 inférieures à 30 uM ont été observés dans les lignées cellulaires de cancer U2OS et DU145.
Figure 1. Vue d'ensemble de la stratégie REPLACE. S'il vous plaît cl beurk ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Liaison et interactions de HAKRRLIF dans CBG panneau gauche:. Structure modélisée de HAKRRLIF lié à la CBG. La rainure de la cycline est constitué de deux poches hydrophobes - une poche primaire (droite plus grande, occupées par des Leu6 et Phe8) et une plus petite poche secondaire (à gauche, occupée par Ala2) et qui sont pontés par des résidus acides représentées en rouge. Panneau de droite: Autres interactions importantes comprennent des contacts de liaison d'hydrogène du squelette peptidique (avec Trp217, Gln254, Ile281), et les interactions d'appariement d'ions des trois résidus de base du peptide (avec Glu220, Glu224, Asp283). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 3. mode de liaison de 3,5-DCPTRLIF dans CBG. Reliure de 3,5-DCPT-FRVR est représenté avec des interactions de liaison hydrogène (représenté par des lignes en pointillés verts) avec des atomes de sidechain de Trp217 et Gln254. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.
Figure 4. Résultats d'accueil sélectionnés. Amarré poses de groupes N-3 plafonnement représentatifs sont présentés. Chacun de ces composés font liaisons hydrogène avec les atomes de filtres interaction de Trp217 et Gln254 et comme représenté en traits pointillés verts. Le substituant phényle rend interactions de Van der Waals avec la poche hydrophobe secondaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. 
Figure 5. Synthèse de 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Synthèse de flips N-plafonnés par synthèse en phase solide. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Synthèse de la N-caFLIP pé-C-plafonnés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Bibliothèque de petites molécules à quai et les prédictions résultant de l'énergie de liaison utilisant la fonction PLP1 de notation.
| Peptide | Pureté | Colonne Dimensions | Méthode | Débit | HPLC Temps de rétention | MW théorique | Observé MW |
| 5843 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 23,9 | 732 | 732,6 |
| 5773 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 22,4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 24,2 | 767,33 | 766,5 |
| 5762 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 9.0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 11.2 | 800,8 | 799,5 |
| 5764 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 9.4 | 749,9 | 749,6 |
| 5765 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 9.4 | 761,9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 20,4 | 761,9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 23,3 | 785,7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4,6 x 250 mm | 5-65% d'acétonitrile / eau / TFA à 0,1% | 1 ml / min | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Tableau 2. Données analytiques pour CGI peptides de liaison et retourne.
Tableau 3. La liaison in vitro de flips N-sélectionnés plafonnés à CDK2CA et CDK4CD.
Tableau 4. En liaison de sélectionné N & C vitro plafonné FLIP à CDK2CA et CDK4CD.
Supplémentaire Figure 1-5. Purification et caractérisation de la 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique.
Figure complémentaire 1. flash chromatogramme de produit issu de l'étape 1. Il ya quatre pics d'élution, le pic majeur éluant à l'acétate d'éthyle 55% / 45% d'hexane a été trouvé pour être le produit désiré. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. complémentaire 1 H-RMN de la 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-car acide carboxyliques. Le spectre RMN montre 3 protons méthyliques aliphatiques et 3 protons aromatiques. L'intégration de tous les trois pics est illustré ci-dessous le spectre RMN. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. 13-RMN supplémentaires de 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique. Il y a dix atomes de carbone dans la structure, RMN-C 13 avec 10 signaux pour chaque carbone atome. L'intégration de chaque pic est illustré ci-dessous le spectre RMN. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. MS supplémentaire de 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique. Le poids moléculaire du composé est représenté comme parent pic à 237. La réelle moléculaire poids du composé est 237,64. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. supplémentaire par CLHP de la 1- (3-chlorophényl) -5-méthyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxylique. La pureté du produit est déterminée comme étant de 100% comme le montre le chromatogramme de CLHP. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
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