Abstract
REPLACE es una estrategia única desarrollada para orientar con mayor eficacia las interacciones proteína-proteína (IBP). Su objetivo es ampliar el espacio disponible objetivo de drogas, proporcionando una mejor metodología para la identificación de inhibidores para estos sitios de unión y que representan la mayoría de los posibles objetivos farmacológicos. El objetivo principal de este trabajo es proporcionar una visión metodológica de la utilización y aplicación de la estrategia REEMPLAZAR que implica enfoques de química computacional y sintéticos. Replace es ejemplificado a través de su aplicación al desarrollo de quinasas no competitivo de ATP de ciclina (CDK) dependientes inhibidores como agentes terapéuticos anti-tumorales. CDK están desreguladas frecuencia en el cáncer y por lo tanto se consideran como objetivos importantes para el desarrollo de fármacos. La inhibición de CDK2 / ciclina A en la fase S se ha informado de promover la apoptosis selectiva de las células cancerosas de una manera independiente de p53 a través de la vía de E2F1. Focalización de la interacción proteína-proteína en la bindin ciclinag ranura (CBG) es un enfoque que permitirá a la inhibición específica de ciclo celular sobre las CDK transcripcionales. El CBG es reconocido por una secuencia de consenso derivada de CDK sustratos y proteínas supresoras de tumores denominado el motivo de unión (CBM) de ciclina. El CBM previamente ha sido optimizado para un octapéptido de p21Waf (HAKRRIF) y luego más truncado para un pentapéptido retener suficiente actividad (RRLIF). Los péptidos en general no están celular permeable, son metabólicamente inestable y por lo tanto el (reemplazo parcial con el ligando Alternativas a través Computacional Enriquecimiento) SUSTITUIR estrategia se ha aplicado con el fin de generar los inhibidores más similares a las drogas. La estrategia comienza con el diseño de péptidos inhibidores fragmento ligado (vueltas) que inhiben selectivamente ciclo celular complejos CDK / ciclina. Voltea se generaron mediante la sustitución de los residuos de forma iterativa HAKRRLIF / RRLIF con el fragmento como pequeñas moléculas (grupos de tapado), a partir de la N-terminal (NCAPs), seguidos de reemplazo enel C-terminal. Estos compuestos son puntos de partida para la generación de inhibidores de CDK no competitivos de ATP como agentes terapéuticos anti-tumorales.
Introduction
En este artículo, un estudio de caso de la aplicación de la (reemplazo por alternativas ligando parciales utilizando computacional enriquecimiento) SUSTITUIR estrategia para convertir inhibidores peptídicos de las interacciones proteína-proteína en más moléculas farmacéuticamente relevantes se describe 01.03. Mientras que los IBP son una fuente rica pero poco explotado de posibles objetivos de drogas, las metodologías existentes son claramente insuficientes para hacer estos ampliamente accesible. Las estrategias actuales incluyendo fragmento diseño basado en 4, cribado de alto rendimiento 5 y péptidos grapados 6 han proporcionadas avances, sin embargo, estos son, en muchos casos ineficaces. Como resultado, se requieren más progreso y enfoques más eficientes. REEMPLAZAR ha sido plenamente validado en el desarrollo de inhibidores de la quinasa que han mejorado las propiedades similares a las drogas y que tienen potencial de desarrollo como agentes terapéuticos antitumorales. Esta estrategia se ejemplifica en el desarrollo de inhibidores no de ATP de la célulaCDK ciclo e implica los siguientes: 1) la obtención de información estructural en 3D en las interacciones de HAKRRLIF / RRLIF con la unión de la ciclina ranura; 2) la determinación de los determinantes de unión importantes para la interacción de péptidos; 3) el truncamiento del péptido N-terminal que contiene uno o más determinantes de unión; 4) identificación computacional de potenciales de moléculas pequeñas alternativas (alternativas ligando parciales Plas) para la parte truncada del péptido y que retienen las interacciones clave del péptido parental; 5) la síntesis o el abastecimiento comercial de PLA predijeron para unirse ávidamente con el sitio sub previamente ocupado por el residuo (s) péptido borrado; 6) la síntesis de hojea la ligadura de las mejores PLA al péptido truncado mediante síntesis en fase sólida; 7) las pruebas de lanzamientos en una unión in vitro o ensayo funcional (polarización de la fluorescencia en el contexto / ciclina CDK), seguido de una caracterización adicional en un ensayo de viabilidad celular. Una representación esquemática de REEMPLAZAR strategy se muestra en la Figura 1. En este artículo, se discuten las iteraciones de la estrategia REPLACE y la aplicación de CDK2 / ciclina A se describe en detalle. CDK se cree que están desregulado directamente o indirectamente en la mayoría de los tumores y por lo tanto se consideran objetivos farmacológicos de cáncer apropiada 7. CDK requieren asociación con ciclinas para la activación completa y posteriormente fosforilan proteínas clave que intervienen en la regulación del ciclo celular 8. Los dos grupos principales de CDK son los isotipos que controlan los puntos de control del ciclo celular [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D y CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) y G2 / M (CDK1 / ciclina B)] y los reguladores de la ARN polimerasa a través de la fosforilación (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Un paso clave en la progresión de la fase S se produce cuando el factor de transcripción E2F1 forma un complejo con la proteína DP que luego se une al ADN e inicia la transcripción génica. CDK2 / ciclina A se requiere para neutralizar la transcripción E2F1actividad a través de la fosforilación lo que conduce a la liberación del complejo E2F1-DP y su posterior degradación. Se cree que la inhibición de CDK2 / ciclina A para mantener E2F1 en su estado unido de ADN conduce a la activación persistente. El nivel resultante de E2F-1 actividad superará el umbral requerido para inducir la apoptosis independiente de p53, por tanto, lo que sugiere una estrategia terapéutica. Debido a p53 desregulado y las vías de pRb, los altos niveles de E2F-1 se producen con frecuencia en las células cancerosas y la inhibición de CDK2 / ciclina A debería conducir a la apoptosis selectiva en tumores y puede ser considerado como un objetivo de cáncer validado 7.
Clínicamente inhibidores de CDK investigados se dirigen al sitio de unión ATP altamente conservado que conduce a cruzar la reactividad entre las proteínas superior a 500 quinasas en la kinome humana y potencialmente dando lugar a los efectos secundarios y la toxicidad 9. Un enfoque alternativo es-ATP no inhibición competitiva apuntando contratación sustrato a través de la CBGpresentes en la subunidad reguladora positiva ciclina y que es por lo tanto distinta y distante de ATP sitio de unión a 10,11. El CBG es principalmente un surco hidrófobo presente en la ciclina A, ciclina D y ciclina E y se ha demostrado para reconocer una secuencia de consenso que se encuentra en sustratos y supresores de tumores. Como un péptido aislado, el motivo de unión de ciclina (CBM) se une a la CBG y se ha demostrado que inhiben la actividad quinasa de las CDK del ciclo celular. El CBM ha sido optimizado para un octapéptido (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 0,07 ± 0,02 mM, CDK4 / ciclina D, IC 50 0,88 ± 0,34 mM) y además truncada a un pentapéptido que representa un buen compromiso entre el peso molecular para las drogas semejanza y la potencia (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 1,01 ± 0,17 mM, CDK4 / ciclina D, IC 50 25,12 ± 2,97 M) 12,13. Los CBGS consisten en una gran primaria y secundaria más pequeño bolsillo hidrofóbico que están puenteados por un acidiregión c (incluye Glu220, Glu224 y Asp283). Los determinantes de unión clave de HAKRRLIF incluyen la interacción de Ala2 con el bolsillo hidrofóbico secundaria, el emparejamiento de iones de hidrógeno y lazos de Lys3, Arg 4 y Arg5 con la región ácida y un alto grado de complementariedad de Leu6 y Phe8 con el sitio lipófilo primaria. Además, numerosos enlaces de hidrógeno son aportados desde el esqueleto del péptido, mientras que Ile7 actúa como un residuo espaciador permitir el contacto óptimo con el bolsillo primaria. El modo de unión y las interacciones de HAKRRLIF con CBG se muestra en la Figura 2.
Focalización de la interacción proteína-proteína CBM / CBG inhibe la actividad quinasa de CDK2 / ciclina A, CDK2 / ciclina E & CDK4 / ciclina D y esto debe dar lugar a E2F1 apoptosis mediada de las células cancerosas sin afectar a las células normales 7. Aunque CBM péptidos derivados son inhibidores eficaces de las CDK del ciclo celular, es poco probable que sean útiles como fármacos debido a su metabólicala inestabilidad y la falta general de la permeabilidad celular. Con este fin, hemos aplicado la estrategia REEMPLAZAR el fin de convertir estos inhibidores peptídicos potentes en más compuestos similares a las drogas para un mayor desarrollo de terapias antitumorales que explotan E2F1 desregulado través de CDK2 / ciclina A inhibición. El siguiente protocolo se resume el trabajo que se ha completado en la aplicación de REEMPLAZAR a la ranura de ciclina. En el primer caso, se identificaron reemplazos grupo de terminación similares a las drogas para el tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF. Además las mejoras en estos grupos fueron investigados en un estudio de validación adicional para REEMPLAZAR. También se presentan los resultados representativos de estos estudios.
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Protocol
1. Computacional Identificación de Potenciales pequeños Molécula Tapado Grupos
Nota: En principio, una variedad de atraque o farmacóforos métodos de búsqueda puede ser utilizado para predecir los grupos potenciales de tapado. El propósito principal de estudios computacionales en REPLACE es identificar pequeñas moléculas que conservan las características y las interacciones de los aminoácidos que están sustituidos.
- Validación del protocolo de acoplamiento 14 LigandFit
Nota: En los estudios anteriores, el método de acoplamiento (LigandFit 15, un módulo en la suite de programa de modelado molecular, Descubrimiento Studio 3.0) fue validado para asegurarse de que este algoritmo es suficiente para reproducir los modos de unión de conocida NCAPs y para demostrar que los resultados obtenidos para compuestos desconocidos son predictivos 14.
- El uso de los siguientes pasos (1,2 - 1,5), identificar los parámetros óptimos para LigandFit de la siguiente manera: en PLP1rejilla para la generación de ener- pose, minimización de poses generados y la función de puntuación PLP1 para el análisis de poses.
- Con el fin de limitar las conformaciones obtenidas y posicionar ligandos apropiadamente para la formación del enlace covalente en el péptido capsulado, establecer los átomos de nitrógeno de indol y nitrógeno de la amida de Trp217 y Gln254, respectivamente, como filtros de interacción para el enlace de hidrógeno.
- Diseño y atracar una biblioteca de alternativas de fragmentos en el CDK2 / ciclina A del receptor (2UUE). Dar prioridad a los grupos de tapado potenciales para la síntesis y el abastecimiento comercial basado en la puntuación PLP1, interacciones con filtros de interacción y complementariedad con el CBG. Los diversos pasos requeridos para LigandFit de acoplamiento son los siguientes.
- Preparación de receptor de sitio de unión 14
- Importe el CDK2 / ciclina A estructura cristalina (id pdb: 2UUE) en una ventana de visualización en el software. Esta estructura contiene la FLIP previamente identificada 5-metil-1-fenil-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamido (3,5-DCPT) rliF unido a la ranura de ciclina (Figura 3).
- Eliminar o mantener en su lugar los residuos rliF (C-terminal). Cuando se retiene la secuencia del péptido, utilizar el grupo amino N-terminal del péptido como un filtro de interacción para el ligando. De las "interacciones receptor-ligando" herramientas, crear una esfera alrededor de la N-cap 3,5 DCPT de Show / Hide sitio esfera. Se crea la esfera para definir la región activa en el sitio de unión donde se permiten las interacciones ligando-receptor que se produzca durante la unión.
- Definir el sitio de unión más lejos de la "encontrar sitio como volumen de ligando seleccionado" y eliminar el ligando 3,5-DCPT de la proteína. Llevar a cabo este paso para definir el volumen de unión dentro de la esfera creada.
- Establezca las indol átomos de nitrógeno y nitrógeno amida de los residuos Trp217 y Gln254 como filtros de interacción para el enlace de hidrógeno. Establezca los filtros de interacción de manera que sólo las poses que INTERACT con los átomos de residuos establecidos será filtrado durante el proceso de acoplamiento, por tanto, la preservación de las interacciones importantes en las poses atracados.
- Preparación de ligandos 14
- Diseño de una biblioteca de 100 posibles grupos de tapado sobre la base de criterios incluyendo el peso molecular inferior a 500, la presencia de un grupo carboxilato para la ligación con el péptido truncado y la inclusión de grupos hidrófobos apropiados (grupo fenilo sustituido) para interacción de van der Waals en el bolsillo secundaria como muestra en la Tabla 1.
- Seleccione anillos heterocíclicos para imitar las interacciones de unión de hidrógeno péptido con Trp217 y sustituyentes incluido para reemplazar las interacciones ion-emparejamiento de cadenas laterales básicas del HAKRRLIF. Acoplar los ligandos como las respectivas moléculas de aldehído de manera que el oxígeno del carbonilo puede interactuar con el átomo de nitrógeno de la amida de Gln254 similar al esqueleto peptídico en el péptido parental (Tabla 1).
- Antes de docrey, minimizar ligandos diseñados para una conformación de baja energía y prepararse en un estado de ionización apropiado usando el protocolo "Preparar ligandos". Dibujar y exportar estos potenciales tapas N en el formato de archivo .sdf en ChemDraw para una hoja de cálculo antes de ser importados en el software.
Nota: Preparar protocolo ligandos se utiliza para minimizar todos los ligandos para acoplar a sus estados de energía más bajos y los cargos de ionización se aplicaron a los átomos aplicables. Los parámetros por defecto se utilizan para este paso.
- Docking de los ligandos en el Ciclina A Groove 14
- Seleccione la rutina LigandFit de receptor-ligando conjunto protocolo interacciones del software. Utilice el receptor y los ligandos preparados como entrada para este protocolo.
- Por estas carreras seleccione PLP1 como red de energía, especifican que plantea sea la energía minimizada y que el número de poses generados como 10. Deje todos los otros parámetros a los valores predeterminados.
Nota: es LigandFitun método de acoplamiento que puede identificar y generar poses de alta complementariedad y la afinidad potencial con el sitio activo de una proteína utilizando un filtro de comparación de forma basada en que se combina con un algoritmo de búsqueda Monte Carlo conformacional. La rejilla de energía utilizada por el programa de acoplamiento es el campo de fuerza para generar interacciones ligando-receptor y poses potenciales. PLP1 potencial lineal por tramos que prioriza específicamente interacciones de enlace de hidrógeno y donde se le asigna el tipo de átomo de PLP para cada no hidrógeno átomo ligando o átomo receptor no hidrógeno.
- Analisis de resultados
- En el primer caso, la pantalla se plantea en el programa visualizador y luego ordenar por valores de la puntuación PLP1 descendente. Utilice funciones de puntuación tales como PLP1 para estimar la afinidad de unión de un ligando acoplado sobre la base de un ligando candidato pose de la geometría y la interacción no covalente con la estructura de receptor diana.
Nota: En este caso, la función de puntuación PLP1 resultó give los mejores resultados ya que incluye una estimación de enlaces de hidrógeno. - Analizar visualmente el 25% superior de las poses anotados para 1) superimposability con el grupo tapado conocido (que tiene una desviación del cuadrado medio relativo (RMSD) valor inferior a 2 a), 2) cumplió filtros de interacción y 3) la complementariedad visual con la ranura de la ciclina . Se acepta en que un correctamente acoplado plantear (en comparación con una estructura experimental) tiene un valor de RMSD <2 Å.
- Examine poses para complementariedad visual, que se define como tener llenado eficiente del bolsillo de unión de una manera que sea consistente con las relaciones estructura-actividad conocidos. Filtros de interacción se establecen para incluir restricciones de átomos que requieren contactos intermoleculares se sabe que son críticos para la unión y / o son requeridos para posicionar el grupo de terminación potencial en la geometría correcta para la formación del enlace amida. Tres ejemplos de poses atracados de potenciales grupos N-tapado haciendo enlaces de hidrógeno con Interaction filtros se muestran en la Figura 4.
- En el primer caso, la pantalla se plantea en el programa visualizador y luego ordenar por valores de la puntuación PLP1 descendente. Utilice funciones de puntuación tales como PLP1 para estimar la afinidad de unión de un ligando acoplado sobre la base de un ligando candidato pose de la geometría y la interacción no covalente con la estructura de receptor diana.
2. Síntesis y Caracterización de los grupos potenciales N -capping
- Síntesis de grupos N-taponado.
- Para la síntesis, utilice todos los comerciales materiales de partida, disolventes y reactivos como se obtiene. Sintetizar potenciales grupos N-tapado por la química orgánica sintética convencional (Figura 5 12,13 para un ejemplo).
- Realizar la cromatografía en capa fina (TLC) sobre gel de sílice para monitorear reacciones.
- Se disuelve el material de partida y mezcla de reacción (1 mg) en la fase móvil y localizarlos en la placa de TLC usando tubos capilares.
- Coloque la placa de TLC en la cámara que contiene la fase móvil (acetato de etilo y hexano en una proporción 35:65). Una vez que la fase móvil alcanza 90% de la placa de TLC, retirar y secar la placa.
- Utilice la luz ultravioleta para detectar las mezclas de materiales de partida y de reacción en forma de manchas visibles. Californiacular el R f de todos los puntos (relación de la distancia recorrida por el lugar y la fase móvil).
Nota: La reacción se completa cuando no hay mancha visto en el R f del material de partida.
- Después de la finalización de la reacción, la mezcla de reacción mediante la colocación en un embudo de decantación y lavado con ácido acuoso o solución de base según sea apropiado. Recoger el disolvente orgánico, se evapora en evaporador rotatorio y se seca el producto bruto obtenido a vacío.
- Disolver 500 mg de producto en bruto en el 3-5 ml de disolvente adecuado y añadir a un 1 g de sílice o RP18 samplet y seco bajo aire. Coloque el samplet que contiene el producto bruto en los cartuchos Flash / RP SNAP de sílice y se purifica el material crudo mediante cromatografía flash de alto rendimiento automatizado (de acuerdo con el protocolo del fabricante) empleando un g columna SNAP 100 con una carrera de gradiente a partir de 6% de acetato de etilo: 94 % de hexanos a 50% de acetato de etilo y 50% de hexanos más de15 volúmenes de columna.
- Secar el producto purificado recogido en el disolvente de cromatografía flash utilizando un evaporador rotativo por evaporación de todo el disolvente a sequedad y secar aún más el producto a vacío para eliminar todos los disolventes residuales. Realizar la caracterización del producto purificado por RMN, MS y HPLC analítica.
- Para 1 H RMN y 13 C NMR, pesar aproximadamente 10 mg de la muestra purificada, se disuelven en un disolvente deuterado apropiado, y transferir el contenido a un tubo de NMR seco para el registro de los espectros de RMN 2,14.
- Registre el 1H RMN y 13 C espectros de RMN con un alto campo RMN Espectrómetro (mínimo 300 MHz). Adquirir los espectros de masas utilizando un QTOF (Tandem cuádruple 1 hora de vuelo espectrómetro de masas), ionización por electrospray (ESI) o unos 70S VG (doble centrándose espectrómetro de masas de sector magnético, EI) 2,14.
- Analizar la pureza de los productos por HPLC con un detector de red de diodos y equipado conun C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 micras en la columna para análisis. Utilice una corrida de gradiente a partir de 100% de agua (ácido trifluoroacético al 0,1%) a 60% de acetonitrilo (ácido trifluoroacético al 0,1%) durante 30 min y mantener el gradiente de 4 min. Extraer los cromatogramas a 226 y 254 nm 2,14.
Nota: purezas analíticos de los compuestos evaluados fueron> 95%.
3. Síntesis en fase sólida para la Generación de lanza 2
- Síntesis del voltea N-coronado
- Ensamble compuestos peptídicos N coronadas de a través de métodos estándar de síntesis en fase sólida utilizando los siguientes pasos.
- Activar 5 equivalentes de aminoácido C-terminal (Fmoc-Phe) en 4.4 equivalentes de O -Benzotriazole- N, N, N ', N' tetrametil-uronio-hexafluoro-fosfato (HBTU, 221,93 mg) en 2 ml de DMF durante 5 min. Cargar la mezcla HBTU Fmoc-Phe a la resina Rink utilizando 6 equivalentes de diisopropiletilamina (DIPEA, 103,13mg) durante 1 hora a RT.
- Eliminar el grupo protector Fmoc del residuo C-terminal utilizando 20% de piperidina en 3 ml de DMF durante 10 min. Aminoácidos posteriores de los pares (por ejemplo, Fmoc-Ile, Fmoc-Leu, Fmoc-Arg-pmc) paso a paso. En cada paso, par 5 equiv del siguiente aminoácido usando 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) y 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) en 2 ml de DMF durante 1 hora a RT.
- Aplicar ciclos de lavado (5 x 10 ml de DMF + 5 x 10 ml de DCM) después de las etapas de acoplamiento de aminoácidos Fmoc y de desprotección descritos anteriormente. Después del montaje de péptidos, grupos usando 6 equivalentes de DIPEA (103,13 mg) y 4,4 equivalentes de HBTU (221,93 mg) par N-taponado en 2 ml de DMF durante 1 hora a RT.
- Una vez finalizado el montaje de péptidos, el tratamiento de la mezcla de reacción con 2 ml de la mezcla de escisión (90: 5: 5 TFA / H 2 O / TIPS) O / N para eliminar los grupos protectores de cadena lateral, y pegue voltea de la resina. Se tritura el producto resultante con éter dietílico frío para precipitar y if concentrado necesario en un evaporador rotatorio.
- Ensamble compuestos peptídicos N coronadas de a través de métodos estándar de síntesis en fase sólida utilizando los siguientes pasos.
- Síntesis de Flips-C-coronadas de cubiertas N
- Pesar y disolver el péptido Arg-Leu N-terminal tapado y protegido (16,1 mg, 0,02 mmol) en diclorometano, y añadir [4- (3-clorofenoxi) piridin-2-il] metanamina (C-cap), junto con O - benzotriazol N, N, N ', N' tetrametiluronio (HBTU; 16,7 mg, 0,02 mmol) y N, N-diisopropiletilamina (DIPEA; 6,5 mg, 0,02 mmol).
- Agitar y monitorear la reacción a temperatura ambiente hasta que la TLC / HPLC indica el consumo completo del material de partida. Después de la finalización de la reacción, se concentra la mezcla de reacción en bruto usando un evaporador rotatorio y luego partición entre acetato de etilo y agua.
- Separar la fase acuosa y la capa orgánica; se lava la capa orgánica con NaOH 1 N, HCl 1 N, y salmuera. Se seca la capa orgánica con aproximadamente 1 g de sulfato de sodio y se concentra el producto en el evaporador rotatorio. Finally tratar el producto O / N con la mezcla de división (95: 2,5: 2,5 ácido trifluoroacético / H2O / TIPS) para la desprotección.
- Se tritura el producto resultante con éter dietílico frío y si es necesario concentrado en el evaporador rotatorio a sequedad completa a fin de eliminar todo el disolvente. Secar aún más el producto al vacío para eliminar todos los disolventes residuales.
- Purificación y caracterización de volteretas
- Purificar voltea crudo usando métodos preparativos semi HPLC en fase inversa. Liofilizar las voltea purificadas y caracterizar su masa molecular mediante espectrometría de masas 2,14.
- Determinar la pureza analítica de los voltea por HPLC con un detector de red de diodos y equipado con una C18 (2) 100 A, 250 x 4,6 mm, 5 micras columna. Utilice un método de gradiente partiendo de 95% H 2 O (0,1% de ácido trifluoroacético) / 5% de acetonitrilo (0,1% de ácido trifluoroacético) a 35% H 2 O (0,1% de ácido trifluoroacético) / 65% de acetonitrilo (0,1% trifluoroaceácido tic) durante 30 minutos y mantener el gradiente de 4 minutos. Extracto de cromatogramas a 226 y 254 nm.
4. Ensayo de unión de polarización de fluorescencia para la determinación de unión competitiva 2,14
- Realizar el ensayo en placas utilizando el siguiente procedimiento negro 384 pocillos (138 l).
- Diluir las muestras, péptidos trazador (4 nM), y complejos de quinasa (CDK2 / ciclina A - 18 g / ml, CDK4 / ciclina D - 37 mg / ml) a las concentraciones requeridas en tampón de ensayo (25 mM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0,01% de Nonidet P-40, ditiotreitol 1 mM (DTT).
- A cada pocillo de la placa de 384 pocillos, añadir: 5 l de CDK4D1 o CDK2CA (0,3 mg / complejo bien purificada recombinante humana quinasa), la solución del compuesto 5 l, 5 l de 30 nM péptido trazador (fluoresceinilo-Ahx-Pro-Val Lys-Arg-Arg-Leu (3ClPhe) Gly o péptido trazador fluoresceinilo-Ahx-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Leu-Phe-Gly). Utilice 5 l de cada DMSO (6%), buffer, trazador y 5 l DMSO (6%), complejo quinasa, trazador como pocillos de control
- Después de la adición de los todos los componentes, centrifugar la placa a 500 rpm durante 1 min (41,16 xg) a TA y luego se incuba la placa con agitación durante 45 min a TA. Usando un lector de placa multimodo y equipado con detector de 485 nm / 535 nm de excitación / emisión y filtros de un espejo dicroico leer la intensidad de fluoresceína de cada pocillo en la placa.
- Calcular la media relativa de polarización (MP) para todas las muestras de ensayo utilizando la ecuación aparece más abajo. Determine los valores de IC50 por regresión logarítmica correlacionando mps relativos y probar concentraciones.
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Representative Results
Las interacciones de HAKRRLIF con la ranura de la ciclina se muestran en la Figura 2. Los residuos de péptidos que representan los determinantes de unión clave incluyen Ala2, Arg4, Leu6 y Phe8 con otros residuos de aportar contribuciones más pequeños 12,13,18. En este estudio de caso la estrategia REPLACE se ha utilizado con el fin de encontrar alternativas de fragmentos para los residuos en el tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF, imitando principalmente las interacciones de Ala2 y Arg4. Una biblioteca de posibles fragmentos NCAP (Tabla 1) se construyó sobre la base de los criterios. Cada molécula se acopló en el sitio de unión desocupado creado por el truncamiento del grupo N-limitación de su estructura cristalina con la ciclina A (PDB ID: 2UUE). Alternativas de ligando potenciales fueron seleccionados en base a análisis de pose y la puntuación PLP1 como una predicción de la afinidad (ejemplos de poses atracados se muestran en la Figura 4). La síntesis de un NCAP confirmado (1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico) se muestra en la Figura 5, donde esta molécula fue generada en tres pasos y se purificó por cromatografía flash automatizada (Figura 1). El 1H NMR, 13 RMN, MS y HPLC datos de caracterización de un compuesto representativo 1- (3-clorofenil) -5-ácido metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico se muestran en las figuras 1-5 complementario respectivamente. La síntesis del voltea N coronadas de y voltea-C coronadas de cubiertas N están representados en las figuras 7 y 8 y los datos de caracterización se muestran en la Tabla 2. La afinidad de unión tanto para CDK2 / ciclina A y CDK4 / ciclina D se determinó utilizando el ensayo de FP descrito y los resultados se muestran en la Tabla 3. De los compuestos probados, voltea con adición de triazol N-caps base se determinó que tenía la mayor afinidad por CDK2 / ciclina A y CDK4 / ciclina D y compuesto representativos se probaron en ensayos basados en células. En su conjunto, las moléculas FLIP identificadas se encontraron a ser más drogas similares, y para retener la mayor parte de las interacciones del octapéptido HAKRRLIF. Tetrapéptidos Tope poseían menor potencia en comparación con HAKRRLIF sin embargo eran de una actividad comparable a la pentapéptido RRLIF (Cuadros 3 y 4). Estos resultados muestran que los compuestos obtenidos había mejorado semejanza de drogas, pero éste se ha obtenido a costa de la afinidad de unión algo comprometida.
La actividad anti-proliferativa estos ligandos CGI se evaluó y se observaron celulares IC 50 's por debajo de 30 micras de líneas celulares de cáncer U2OS y DU145.
Figura 1. Visión general de la estrategia REEMPLAZAR. Por favor cl ick aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Unión y las interacciones de HAKRRLIF en CBG Panel izquierdo:. Siguiendo el modelo de la estructura HAKRRLIF unido a la CBG. La ranura ciclina consta de dos bolsillos hidrofóbicos - un bolsillo principal grande (derecha, ocupados por Leu6 y Phe8) y un bolsillo más pequeño secundaria (izquierda, ocupada por Ala2) y que están puenteados por residuos ácidos que aparecen en rojo. Panel derecho: Otras interacciones importantes incluyen contactos de unión de hidrógeno del esqueleto peptídico (con Trp217, Gln254, Ile281), y las interacciones de iones de apareamiento de los tres residuos básicos del péptido (con Glu220, Glu224, Asp283). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3. Modo de encuadernación de 3,5-DCPTRLIF en CBG. La unión de 3,5-DCPT-rliF se muestra con las interacciones de enlace de hidrógeno (representado por líneas de puntos verdes) con los átomos de la cadena lateral de Trp217 y Gln254. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Se muestran Figura 4. Selección de resultados de atraque. Atracado poses de 3 representativos grupos N-tapado. Cada uno de estos compuestos hacen que H-bonos con los átomos de filtro interacción de Trp217 y Gln254 y como se representa por líneas de puntos verdes. El sustituyente fenil hace interacciones de van der Waals con el bolsillo hidrofóbico secundaria. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 5. Síntesis de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Síntesis de N voltea coronadas de por síntesis en fase sólida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. Síntesis de N-cavoltea coronadas de pado-C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Biblioteca de pequeñas moléculas atracados y las predicciones que resultan de la unión de energía utilizando la función de puntuación PLP1.
| Péptidos | Pureza | Dimensiones de columna | Procedimiento | Tasa de flujo | Tiempo de retención HPLC | MW teórico | Observado MW |
| 5843 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 23.9 | 732 | 732.6 |
| 5773 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 22.4 | 801,77 | 800,55 |
| 5774 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 24.2 | 767,33 | 766.5 |
| 5762 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 9.0 | 731,91 | 731,65 |
| 5763 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 11.2 | 800.8 | 799.5 |
| 5764 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 10.1 | 766,34 | 765,55 |
| 5771 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 9.4 | 749.9 | 749.6 |
| 5765 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 10.1 | 766,35 | 755,65 |
| 5766 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 9.4 | 761.9 | 761,55 |
| 5767 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 20.4 | 761.9 | 761,55 |
| 5776 | > 75% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 23.3 | 785.7 | 784,55 |
| 5775 | > 90% | 4.6 × 250 mm | De 5-65% de acetonitrilo / agua / 0,1% de TFA | 1 ml / min | 9.9 | 751,34 | 750,45 |
Tabla 2. Datos analíticos para CGI péptidos de unión y voltea.
Tabla 3. La unión in vitro de la voltea N coronadas de seleccionados a CDK2CA y CDK4CD.
Tabla 4. En la unión de N & C seleccionado vitro coronó voltea a CDK2CA y CDK4CD.
Suplementario Figura 1-5. Purificación y caracterización de 1- (3-clorofenil) -5-ácido metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico.
Suplementaria Figura 1. flash cromatograma del producto obtenido a partir del paso 1. Hay cuatro picos de elución, el pico principal que eluye a 55% de acetato de etilo / hexanos 45% resultó ser el producto deseado. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.
Suplementaria Figura 2. 1H NMR de 1- (3-clorofenil) -5-metil-1H-1,2,4-triazol-3-car ácido carboxılico. El espectro de RMN muestra 3 protones metílicos alifáticos y 3 protones aromáticos. La integración de todos los tres picos continuación se muestra el espectro de RMN. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementaria Figura 3. 13 CNMR 1- (3-clorofenil) -5-ácido metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. Hay diez átomos de carbono en la estructura, 13 RMN con 10 señales para cada carbono átomo. La integración de cada pico se muestra debajo del espectro de RMN. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
ig4.jpg "/>
Suplementaria Figura 4. MS de 1- (3-clorofenil) -5-ácido metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. El peso molecular del compuesto se muestra como pico principal en 237. El actual molecular peso del compuesto es 237.64. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Suplementaria Figura 5. HPLC de 1- (3-clorofenil) -5-ácido metil-1H-1,2,4-triazol-3-carboxílico. La pureza del producto se determina como 100% como se muestra en el cromatograma HPLC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computational Chemistry | |||
| Accelyrs Discovery studio 3.0 | |||
| Dell Optiplex Workstations | |||
| Synthetic Organic Chemistry | |||
| Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6 mm, 5 μm column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI). | |||
| Flourescence Polarization Assay | |||
| 384 micro well plates, Micro pipets | Grenier Bio-one | 110256602 | |
| CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex) | BPS Bio Sciences | 40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A) | |
| assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1 mM dithiothretiol (DTT)) | |||
| 25 nM HEPES | CALBIOCHEM | 375368 | |
| NaCl | Fisher | 127838 | |
| Nonidet P-40 | US Biological | N3500 | |
| DTT | Aldrich | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
| Cell Culture | |||
| 96 well plates | Fisher | ||
| Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines | ATCC | ||
| NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP, MTT reagent | Fisher, Life technology, Alfa Aesar | ||
| Heamocytometer | VWR | ||
| -70 °C freezer | Revco (Ultima II) | ||
| Incubator | Thermo electron corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5804 R | |
| Refrigerator 4-8 °C | Isotemp Fisher | ||
| DTX880 multimode detector fitted with 595 nm filter | Beckman Coulter, Brea, CA | ||
References
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