Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Identifikation af reproduktionstoksicitet af de tusindvis af kemikalier i vores miljø har været en af de mest forjættende udfordringer inden for miljø og sundhed. Dette skyldes til dels, at de sparsomme model systemer, der kan (1) præcist rekapitule- nøgler funktioner i reproduktive processer og (2) gøre det i en mellem- til high-throughput fashion, uden behov for et stort antal hvirveldyr.
Vi beskriver her et assay i nematode C. elegans, der tillader hurtig identifikation af germline giftstoffer ved at overvåge induktion af aneuploide embryoner. Ved at gøre brug af et GFP reporter linje, er fejl i kromosom adskillelse resulterende fra kimcellelinje forstyrrelser let visualiseres og kvantificeres ved automatiseret fluorescensmikroskopi. Således screening af et bestemt sæt af forbindelser til dets toksicitet kan udføres i en 96- til 384-brønds plade-format i løbet af få dage. Sekundær analyse af positive hdens kan udføres for at afgøre, om kromosomfejl stammede fra meiotisk afbrydelse eller fra tidlige embryonale kromosom adskillelse fejl. Tilsammen dette assay er en hurtig first-pass strategi for hurtig vurdering af germline dysfunktion efter kemisk eksponering.
Introduction
Der er ca. 87.000 kemikalier, der er registreret for handel i USA, men kun et lille antal af disse er blevet testet for potentielle sundhedsmæssige virkninger 1. Af dem, der er blevet testet, har kun en del blevet vurderet for reproduktiv sundhed effekter skyldes til dels, at det er vanskeligt at bestemme ændring af de tidlige reproduktive begivenheder i pattedyr, især under kvindelig udvikling kønsceller og differentiering. Faktisk den første meiotiske begivenheder finder sted i de tidlige stadier af fosterudviklingen hos kvindelige pattedyr og er derfor svære at få adgang til og samle i antal egnede til screening.
Kimcellelinjen giver den afgørende forbindelse mellem generationerne, og dets relevante funktion er afhængig af den præcise gennemførelse af den indviklede program for Cellulær og kromosomal division kaldes meiose. Dysregulering af den meiotiske proces kan resultere i reduceret fertilitet og produktion afkønsceller og embryoner med en unormal antallet af kromosomer, en tilstand kaldet aneuploidi. Kromosom adskillelse fejl i meiose er yderst relevante for menneskers sundhed. Kromosomfejl er fælles, med en frekvens på 1 i 150 levendefødte, trisomi 21, 18 og 13 samt X og Y-kromosom fejl er de mest udbredte former 2,3. Desuden medfødte misdannelser, herunder kromosomale oprindelse, er den førende årsag til spædbarnsdød i USA 4 Tanken om, at miljømæssige påvirkninger kan påvirke kromosomal segregering og adfærd er ikke ny 5, men stadig dårligt forstået. Det er derfor afgørende at undersøge, hvilke af de kemikalier, der blev indført i vores miljø forstyrrer menneskers forplantningsevne, tidlig udvikling og generelle reproduktive sundhed.
I lyset af disse begrænsninger i de pattedyr modeller, har vi udviklet et high-throughput screen assay til at teste reproduktionstoksicitet i rundorm <em> C. elegans. Vi har mobiliseret flere vigtige funktioner, der tilbydes af denne almindeligt anvendte genetiske model system som sin lille størrelse, lave omkostninger, kort gengivelse cyklus, høj andel af kønsceller og nem manipulation 6. Orme kan dyrkes i 96-brønds plader eller i høje volumen flydende kulturer og på grund af deres gennemsigtighed kan direkte afbildes på plader til detektering af fluorescerende reportere. Den nedenfor beskrevne assay drager fordel af disse egenskaber og drager fordel af en orm stamme indeholdende fluorescerende reporter Pxol-1 :: GFP at detektere kimcellelinje forstyrrelser og induktion af embryonale aneuploidi.
Anvendelsen af denne reporter stamme er baseret på den generelt sjældne forekomst af hanner i en hovedsagelig hermafroditisk orm befolkning. Disse mænd (<0,2%) naturligt stammer fra fejl i adskillelse af X-kromosomet 7. Men som germlinie forstyrrelser ofte fører til fejl i adskillelse af autosomerog heterochromosomes det korrelerer med både en forhøjet forekomst af hanner fænotype (X missegregation) samt embryonisk letalitet (Autosom missegregation). For nemt at detektere induktion af hanner mens omgå problemet med embryoniske dødelighed er en han-specifik promotor (xol-1) anvendes til at drive ekspression af GFP i tidlige embryoner stadig indeholdt i ormen livmoder. Som sådan er fremkomsten af GFP-udtrykkende embryoner anvendes som proxy for tilstedeværelsen af aneuploide embryoner. Denne fremgangsmåde er tidligere blevet anvendt til at identificere gener, der er impliceret i kimcellelinje vedligeholdelse og meiose 8,9. Tilpasset til kemisk screening, er denne stamme anvendes i en medium til high-throughput skærm. Vigtigt er det, stammen trofast rapporterer aneugenicity af kemikalier og er derfor relevant for pattedyr reproduktive endpoints 10. Den her beskrevne assay vil være særlig nyttig for toksikologer i farmaceutiske og kemiske industri indstillinger søgertil hurtigt at vurdere toksiciteten af kemikalier i retning reproduktive endpoints. Desuden er denne analyse fuldt ud på linje med de statslige prioriteringer fremhævet i Toksicitet i st rapporten 21 århundrede 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne fremgangsmåde er den første store strategi til identifikation af germline giftstoffer skala. Det kræver brug af et GFP transgen Pxol-1 :: GFP indeholdende stamme, der trofast rapporterer induktion af aneuploidi i tidlige embryoner, der anvendes som en proxy for germlinie dysfunktion. Fremgangsmåden involverer omhyggelig synkronisering af en C. elegans orm befolkning og orme eksponering for kemikalier i 96-brønds format efterfulgt af billeddannelse af GFP-positive orme ved automat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. Genetics. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
