Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80

doi: 10.3791/52482 Published: May 3, 2015

Summary

Ce manuscrit décrit la détection de la sumoylation de protéines et ubiquitination kinétochoriens, Ndc10 Ndc80 et, dans le bourgeonnement levure Saccharomyces cerevisiae.

Abstract

Les modifications post-traductionnelles (PTM), tels que la phosphorylation, la méthylation, l'acétylation, l'ubiquitination, et sumoylation, régulent la fonction cellulaire de nombreuses protéines. PTM de protéines kinétochoriens qui associent avec l'ADN centromérique médiation ségrégation des chromosomes fidèle à maintenir la stabilité du génome. Approches biochimiques telles que la spectrométrie de masse et analyse western blot sont les plus couramment utilisés pour l'identification des PTM. Ici, un procédé de purification des protéines est décrite qui permet la détection à la fois de la sumoylation et ubiquitination des protéines kinétochoriens, Ndc10 et Ndc80, dans Saccharomyces cerevisiae. Une souche qui exprime polyhistidine-marquage Flag Smt3 (HF-Smt3) et marqué par myc Ndc10 ou Ndc80 a été construit et utilisé pour nos études. Pour la détection de la sumoylation, nous avons conçu un protocole pour purifier par affinité les protéines His-étiqueté sumoylated à l'aide de billes de nickel et utilisé une analyse western blot avec un anticorps anti-Myc pour détecter une sumoylated Ndc10e Ndc80. Pour la détection de l'ubiquitination, nous avons élaboré un protocole pour l'immunoprécipitation des protéines Myc-marqués et utilisé l'analyse de western blot avec l'anticorps anti-Ub pour montrer que Ndc10 et Ndc80 sont ubiquitinées. Nos résultats montrent que l'épitope protéine marquée de l'intérêt pour l'His-Drapeau étiqueté souche Smt3 facilite la détection de plusieurs PTM. Les études futures devraient permettre une exploitation de cette technique pour identifier et caractériser les interactions entre protéines qui sont tributaires d'un PTM spécifique.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

L'ubiquitination et sumoylation permettent la conjugaison de l'ubiquitine et le modificateur de petite ubiquitine (SUMO; Smt3 dans S. cerevisiae 1) à une protéine cible, respectivement. PTM de protéines kinétochoriens affectent leurs niveaux cellulaires et des interactions protéine-protéine au cours des différentes phases du cycle cellulaire afin d'assurer la ségrégation des chromosomes fidèle. Par exemple, les niveaux cellulaires de CSE4 / CENP-A et la protéine de kinetochore extérieure DSN1 sont réglementés par protéolyse ubiquitine pour assurer la stabilité du génome 2-5. La déstabilisation de équipements kinétochoriens-microtubules incorrectes nécessite la kinase B IPL1 / Aurora, qui phosphoryle et complexes Dam1 Ndc80 qui interagissent directement avec les microtubules 8.6. Malgré l'identification de plus de soixante-dix protéines kinétochoriens, il ya très peu d'études qui examinent les modifications de ces protéines avec PTM, par exemple, l'ubiquitine et SUMO. Une limitation importante est la capacité à préserver la PTMs pendant la purification et la rareté des anticorps sur mesure pour la détection de la sumoylation PTM tels que, la phosphorylation, la méthylation, et d'autres. Caractérisation des protéines kinétochoriens sumoylated Ndc10, CEP3, BIR1 et Ndc80 utilisé un anticorps personnalisé 9. En outre, Ndc10 a été impliquée en tant que substrat pour l'ubiquitination 10. HEC1 humain (Ndc80 chez S. cerevisiae) est également substrat pour ubiquitination, réglementé par APC / C-hCdh1 ligase E3 11. Par conséquent, Ndc10 et Ndc80 sont de bons candidats pour l'optimisation du protocole de détecter à la fois la sumoylation et ubiquitination en S. cerevisiae.

Pour faciliter l'identification de la sumoylation, nous avons construit des souches qui expriment HF-Smt3 et Myc-tagged Ndc10 ou Ndc80. L'utilisation de marqueurs d'epitope (HF: His6-Flag) minimise le bruit de fond dû à la réactivité croisée qui est fréquemment observé dans le sérum polyclonal dirigé contre une protéine candidate. Nous avons élaboré un protocole d'affinitépurifier les conjugués HF-SMT3 commercial et ensuite utilisé des anticorps anti-Myc et anti-Flag pour détecter la présence de sumolyated Ndc10 et Ndc80 dans la préparation purifiée Smt3. Pour ubiquitination, nous avons conçu un protocole d'immunoprécipitation modifiée qui conserve ubiquitination des protéines kinétochoriens marqué par myc et effectué une analyse western blot avec un anticorps commercial anti-Ub pour détecter ubiquitination de Ndc10 et Ndc80.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Croissance de cellules de levure

  1. Ensemencer les cellules de levure dans 30 ml de YPD (tableau 1) dans un petit flacon. Incuber à 30 ° C pendant la nuit avec agitation.
  2. Diluer les cellules à une densité optique de 0,2 à 600 nm (DO 600 = 0,2) dans 50 ml de YPD et incuber à 30 ° C avec agitation par secousses.
  3. Cultiver la culture jusqu'à une densité optique de 1,0 à 600 nm (DO 600 = 1,0).
  4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 2000 xg et jeter le surnageant.
  5. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 40 ml d'eau stérile et centrifuger pendant 5 min à 2000 x g pour laver les cellules. Jeter le surnageant et stocker le culot cellulaire à -20 ° C.

2. Extraction des protéines

  1. Resuspendre les cellules dans 0,5 ml de tampon guanidine glacée (tableau 1) pour le dosage d'excursion basse à l'aide de Ni-NTA Superflow ou des billes de tampon A (tableau 1) pour immunoprécipitation. Garder les tubes sur la glace en tout temps.
  2. Transfert à 2 ml tube de bouchon à vis.
  3. Ajouter le même volume de billes de verre (Table des Matières).
  4. Bead-a battu les cellules dans un mini cordon batteur (Table des Matières) pendant 2 min à température ambiante, puis le placer sur la glace pendant 2-3 min. Répétez cette opération trois fois.
  5. Vortex à haute vitesse à 4 ° C pendant 30-60 min. Vérifier les cellules par visualisation au microscope à faire en sorte que les cellules sont lysées.
    Remarque: Les cellules lysées apparaîtront fantômes sombres et manquent une frontière ou une forme définie. De façon optimale au moins 80% des cellules doivent être lysées.
  6. Percer un trou dans le fond du tube à l'aide d'une tige de poussée et le lieu dans une collection de 15 ml tube conique (bouchon à vis doit être lâche).
  7. Centrifuger à 1000 g pendant 1 min à recueillir le lysat.
  8. Transférer le lysat dans un tube de centrifugeuse micro.
  9. Centrifuger à 15 000 g pendant 30 min à 4 ° C pour récupérer les protéines extraites.
  10. Mesurer la concentration des protéines extraites à l'aide de la protéine assakit y (Table des matières) et de normaliser tous les extraits à contiennent la même quantité de protéines. Porter le volume total à 1 ml avec un tampon approprié.
    Note: Dans la région de 5 mg de protéine totale est obtenue à partir de 50 OD 600 cellules.
  11. Enregistrer 50 ul (250 pg de protéine si la protéine totale extraite de l'étape 5 est 2,10 mg) sous forme d'extrait de cellules entières (WCE). Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x (tableau 1) et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Charge 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).

3. Purification de HF SMT3 conjugués

  1. Obtenir des billes de Ni-NTA Superflow (Table des Matières) nécessaires pour les expériences (100 ul de billes par exemple) par centrifugation à basse vitesse (800-1,500 xg) pendant 1 min. Retirer le surnageant.
  2. Laver les perles 5x avec 1 ml de PBS (Table des Matières): Inverser haut-sur-bas jusqu'à ce que les billes sont remises en suspension, de recueillir les perles par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
  3. Suspension de billes dans 1 ml de tampon guanidine (tableau 1) et les aliquoter dans le nombre de tubes qui correspondent à des échantillons à traiter. Recueillir des perles par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant. Mélanger les perles bien en inversant haut sur le bas.
    Remarque: Mélanger perles bien en inversant bottom top-over.
  4. Pour chaque échantillon, ajouter 950 ul de la WCE restant (de l'étape 2.11: Extraction de protéines) à 100 ul de billes de Ni-NTA Superflow de.
  5. Incuber sur une plate-forme à bascule à 4 ° C pendant au moins 4 heures ou toute la nuit.
  6. Centrifugeuse à 800-1,500 g pendant 1 min à 4 ° C.
  7. Économisez 50 pi comme surnageant (SUP). Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Charge 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: anal Western blotana-).
  8. Laver les perles une fois avec 1 ml de tampon de guanidine pour 5-10 minutes sur une plate-forme à bascule.
  9. Laver les perles 5x avec 1 ml de tampon de rupture (tableau 1) pendant 5-10 minutes sur une plate-forme à bascule.
  10. perles de remettre en suspension dans 90 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x.
  11. Ajouter 10 pl de 1 M d'imidazole.
    Note: Imidazole aide à dissocier la protéine marquée par His des Ni-NTA beads due à l'interaction entre concurrence imidazole et les perles.
  12. Incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 3-5 min.
  13. Vortex, puis centrifuger à 13 000 g pendant 30 sec. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  14. Charge 10-20 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).
    Remarque: ul 10-20 correspond à 0,5-1,0 mg de l'entrée, si 5 mg de WCE est utilisé.

4. Immunoprécipitation des protéines kinétochoriens marqué par myc

  1. Obtenez-c-Myc lutte contre affinité gel d'agarose untibody (Table des Matières) nécessaire pour les expériences (25 ul par échantillon de résine) par centrifugation à basse vitesse (800-1,500 xg). Retirer le surnageant.
  2. Laver 5x de résine avec 1 ml de tampon A: Inverser haut-over-bas jusqu'à ce que la résine est remis en suspension, recueillent résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
  3. Suspension de résine dans 1 ml de tampon A et les aliquoter dans le nombre de tubes qui correspondent à des échantillons à traiter. Recueillir résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
    Remarque: Mélanger la résine et en inversant haut-over-bas.
  4. Ajouter 950 ul de la WCE restant (de l'étape 2.11: Extraction de protéines) à 25 ul de résine.
  5. Incuber sur un agitateur oscillant à 4 ° C pendant une nuit.
  6. Centrifugeuse à 800-1,500 g pendant 1 min à 4 ° C.
  7. Économisez 50 pi comme surnageant (SUP). Ajouter 50 ul de tampon d'échantillon Laemmli 2x et incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant à 3-5 min. Loannonce 10 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).
  8. Laver 5x de résine avec 1 ml de tampon A: Inverser haut-over-bas jusqu'à ce que la résine est remis en suspension, recueillent résine par centrifugation à basse vitesse, et retirer le surnageant.
  9. Remettre en suspension la résine dans 100 ul de tampon d'échantillon de SUMEB (tableau 1).
    Remarque: un tampon d'échantillon de SUMEB contient 8 M d'urée et 1% de SDS (état dénaturant fort).
  10. Incuber à 100 ° C dans un bloc chauffant pendant 3-5 min.
  11. Vortex, puis centrifuger à 13 000 g pendant 30 sec. Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
  12. Charge 10-20 pi de chaque échantillon dans un gel SDS-PAGE pour l'analyse Western Blot (Section 5: analyse Western blot).
    Remarque: ul 10-20 correspond à 0,5-1,0 mg de l'entrée, si 5 mg de WCE est utilisé.

5. Analyse Western Blot

  1. Charger les extraits de protéines de 4-12% de gels Bis-Tris (Table des Matières) et perfélectrophorèse ORM à 120 V pendant 90 min (tampon de marche: Table des matières).
  2. Transfert de protéines à partir de gel sur une membrane de nitrocellulose (Table des Matières) en utilisant un appareil de transfert à 30 V pendant 90 minutes (tampon de transfert: Table des Matières).
  3. Bloquer la membrane dans 5% de lait / 1x TBST (tableau 1) pendant 1 heure à température ambiante.
  4. Incuber la membrane avec l'anticorps primaire (Table des Matières) dans 5% de lait / 1x TBST nuit à 4 ° C. Pour les anticorps primaires, en utilisant une dilution de 1: 1000 (anticorps anti-Flag et anti-Ub) ou 1: 5 000 (anticorps anti-Myc).
  5. Laver 3x de la membrane pendant 10 min chacun avec 1x TBST.
  6. Incuber la membrane avec l'anticorps secondaire (Table des Matières) dans 5% de lait / 1x TBST pendant 1 heure à température ambiante. Utiliser une dilution 1: 5000 d'anticorps secondaire.
  7. Laver 3x de la membrane pendant 10 min chacun avec 1x TBST.
  8. Incuber membrane avec ECL workisolution ng (Table des Matières) pendant 5 min.
  9. Exposer la membrane sensible au bleu le film X-Ray (Table des matières) et de développer l'aide d'un développeur automatique (Table des matières).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pour détecter sumoylation de protéines kinétochoriens Ndc80 et Ndc10, les souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc (Ndc80 ou Ndc10) ont été construits (tableau 2), comme décrit précédemment 9,12. Conjugués HF-SMT3 ont été purifiés par affinité en utilisant des billes de Ni-NTA. Analyse par Western blot purifié HF-Smt3 avec un anticorps anti-Flag a permis la détection de formes sumoylated de substrats SUMO qui étaient absentes dans la souche de contrôle sans HF-Smt3 (figure 1A et 1B, panneau de gauche). Comme prévu, les multiples formes de substrats SUMO ont été détectés dans la souche HF-Smt3. Nous avons ensuite déterminé si Ndc80 Ndc10 et sont présents dans la HF-Smt3 conjugué purifié en faisant une analyse Western blot en utilisant un anticorps anti-Myc. Plusieurs bandes qui étaient de poids moléculaire plus élevé que celui de Ndc80 ou Ndc10 ont été clairement détectés (figure 1A et 1B, panneau de droite). En outre, de multiples bandes de deux Ndc80 et Ndc10ont été réduites dans les cellules traitées Nocodazole (figure 1C et 1D). Ces résultats montrent que la purification des protéines et analyse par Western blot décrites ici permettent la détection de la sumoylation de Ndc80 Ndc10 et, comme précédemment décrit neuf.

Pour détecter l'ubiquitination de Ndc80 et Ndc10, marqué par myc Ndc80 ou Ndc10 été immunoprécipités (IP) et l'analyse Western blot a été réalisée avec anti-Myc et anti-Ub anticorps (Figure 2). L'analyse des extraits de cellules entières (WCE) et le surnageant (sup) a confirmé l'expression de Ndc80-Myc et Ndc10-Myc (figure 2A). Les bandes de poids moléculaire plus faible sur le WCE peuvent représenter des produits de dégradation. IP échantillons sondés avec des anticorps anti-Myc ont montré des bandes multiples de haut poids moléculaire, ce qui suggère que Ndc80 et Ndc10 contiennent PTM. Un motif d'échantillons échelonnement IP sondées avec un anticorps anti-Ub a montré que Ndc80 et Ndc10 sont ubiquitinées (Figure 2A, α-Ub). Le modèle d'échelonnement des Ndc80 et Ndc10 ont été améliorés par un traitement avec un inhibiteur de protéasome (MG132) (Figure 2B, α-Ub), confirmant en outre que ces bandes représentent poly-ubiqutination. Les résultats représentatifs révèlent que les deux Ndc80 et Ndc10 sont des substrats pour la sumoylation et ubiquitination en S. cerevisiae et que les procédés de purification de protéines décrites sont utiles pour la détection de la sumoylation telles que MEA et l'ubiquitination. Selon notre connaissance, ce rapport est le premier que Ndc80 en S. cerevisiae est un substrat pour l'ubiquitination, bien médiée par l'ubiquitine protéolyse de l'homologue humain HEC1 a été précédemment publiée 11.

Figure 1
Figure 1: Purification de substrats sumolyated permet l'identification des protéines de kinétochoriens Ndc80 et Ndc10 comme substrats de SUMO Pr.oteins ont été extraits et des conjugués HF-SMT3 ont été préparés et analysés par analyse Western blot après séparation par SDS-PAGE. (A et B) et Ndc80 Ndc10 sont sumoylated. Les protéines ont été extraites à partir de cellules en croissance logarithmique dans YPD. Le panneau de gauche: Total des substrats SUMO ont été détectés avec un anticorps anti-Flag. Panneau de droite: Sumoylated Ndc80 ou Ndc10 a été détectée dans les conjugués HF-SMT3 lorsque sondé avec un anticorps anti-Myc. (C et D) et sumoylation de Ndc80 Ndc10 est réduite dans les cellules traitées nocodazole. Les cellules en croissance logarithmique dans YPD ont été traitées avec du DMSO (-) ou le DMSO + 20 pg / ml de nocodazole (+) pendant 2 heures à 30 ° C. HF-SMT3 conjugués ont été analysés par analyse Western blot en utilisant un anticorps anti-Myc. Souches de levure utilisées sont isogéniques (A et C) YPH1800 (Ndc80-Myc), YMB7862 (His-Flag-SMT3 Ndc80-Myc) et (B et D) YPH1734 (Ndc10-Myc), YMB7867 (His-Flag-SMT3 Ndc10-Myc).

Figure 2
Figure 2:. Ubiquitination de protéines kinétochoriens Ndc80 Ndc10 et extraction de protéine et immunoprécipitation ont été réalisées comme décrit dans le protocole. (A) et Ndc80 Ndc10 sont ubiquitinées. Les protéines ont été extraites à partir de cellules en croissance logarithmique dans YPD. Le total extrait de cellules (WCE), le surnageant (SUP), et les fractions (IP) immunoprécipités ont été soumis à SDS-PAGE. Western blots ont été utilisés pour détecter des protéines marqué par myc et ubiquitinées avec des anticorps anti-anti-Myc Ub et, respectivement. (B) L'ubiquitination de Ndc80 et Ndc10 est renforcée dans les cellules traitées avec un inhibiteur du protéasome MG132. Les cellules en croissance logarithmique dans YPD ont été traitées avec du DMSO (-) ou le DMSO + 50 pM MG132 (+) en présence de 0,003% de SDS pendant 3 heures à 30 ° C, comme décrit précédemment 13

Solution Composants
YPD 1% d'extrait de levure, 2% de Bacto-peptone, 2% de glucose
un tampon de guanidine 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0, 6 M de chlorure de guanidine, 0,5 M de NaCl
Tampon A 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM de NaCl, 0,2% de Triton, les inhibiteurs de la protéase 1x X-100
Tampon de rupture 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0, 20% de glycerol, 1 mM de PMSF
Tampon d'échantillon SUMEB 1% de SDS, 8 M d'urée, 10 mM de MOPS pH 6,8, EDTA 10 mM, 0,01% de bleu de bromophénol
2x Laemmli Sample Buffer 100 mM de Tris-HClpH 6,8, 4% de SDS, 20% de glycérol, 0,2% de bleu de bromophénol (Avant utilisation: ajouter b-mercaptoéthanol (BME) à une concentration finale de 200 mM)
1x TBST 137 mM de chlorure de sodium, 20 mM de Tris-Hcl pH 7,5, 0,1% de Tween-20

Tableau 1: Solutions.

Tableau 2. Les souches de levure utilisées dans cette étude *.
Souches Parent Génotype Référence
BY4741 MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 Ouvrir Biosystems
BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 Ouvrir Biosystems
YMB7278 BY4741 / BY4742 MATa his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0 HF-SMT3 :: LEU2 Cette étude
YPH1734 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC10-13Myc :: kanMX6 Montpetit et al., 2006
YPH1800 MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 his3Δ200 leu2Δ1 trp1Δ63 NDC80-13Myc :: His3MX6 Montpetit et al., 2006
YMB7862 YMB7278 / YPH1800 MATa ura3 leu2 his3 ade2 HF-SMT3 TRP1 :: LEU2 :: NDC80-Myc His3MX6 Cette étude
YMB7867 YMB7278 / YPH1734 MATa his3 leu2 ura3 lys2 trp1 HF-SMT3 :: LEU2 :: NDC10-Myc kanMX6 Cette étude
* Toutes les souches de levure sont obtenues à partir de Saccharomyces cerevisiae S288C.
Tableau 2: Les souches de levures utilisées dans cette étude.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

marqueurs d'épitopes tels que HA, Myc, Drapeau, et la TPS sont largement utilisés pour l'analyse biochimique des protéines. Construction de souches avec HF-Smt3 et protéines kinétochoriens marqué par myc, comme Ndc10 et Ndc80, facilite la détection des PTM tels que la sumoylation et ubiquitination. HF-Smt3 déroulant test permet la détection de protéines kinétochoriens sumoylated, Ndc10 et Ndc80 (Figure 1). Le protocole de purification par affinité et analyse western blot en utilisant un anticorps anti-Flag établir la spécificité de l'interaction entre HF et Smt3 protéines cibles comme des protéines modifiées ne sont pas détectés dans la souche témoin sans HF-Smt3. L'utilisation de l'étiquette Myc sur les substrats protéiques valide la présence de sumoylated Ndc10 et Ndc80 dans les conjugués HF-SMT3. En outre, sumoylation des deux Ndc10 et Ndc80 a été réduite dans les cellules traitées Nocodazole (figure 1C et 1D). Diminution de sumoylation de Ndc10 en réponse à treatmen nocodazolet, mais pas Ndc80, a été précédemment rapporté par Montpetit et al. 9. Cela peut être dû à des différences de protocole expérimental et l'utilisation d'un anticorps anti-SUMO personnalisé. Nos résultats pour la sumoylation de substrats kinétochoriens suggèrent qu'un protocole similaire peut être utilisé pour enquêter sur d'autres substrats SUMO candidat.

Pour détecter ubiquitination, des protéines de kinétochoriens Myc-marqués ont été immunoprécipités premier et les fractions de PI ont été sondés avec un anticorps anti-Ub (figure 2). Le schéma d'échelonnement et de Ndc10 Ndc80 a été augmenté lorsque les cellules ont été traitées avec MG132 pour inhiber la fonction du protéasome (figure 2B), ce qui indique que ces protéines sont des substrats du protéasome. Les fractions de PI ont échoué à détecter la sumoylation de Ndc10 ou Ndc80 dans l'analyse western blot avec un anticorps anti-Flag ou anti-Smt3 anticorps (données non présentées). Cela peut être dû à des raisons techniques, telles que les niveaux de substrat dans la fraction sumoylated IP ou le interference des marqueurs d'épitopes. Une nouvelle optimisation du protocole IP tels que la concentration de sels et les conditions de transfert de Western devrait faciliter la détection de plusieurs PTM de toute protéine d'intérêt. À l'heure actuelle, sumoylation est mieux détecté par le HF-Smt3 déroulant analyse suivie par des transferts Western des substrats SUMO candidat (Figure 1).

Plusieurs détails affectent l'efficacité de la purification des protéines et l'aptitude à détecter la PTM. Tout d'abord, tous les tubes doivent être conservés sur la glace pour inhiber les protéases, sauf comme indiqué. D'autre part, un rapport 1: 1 de suspension de cellules à des billes de verre est essentielle pour rompre les cellules par le batteur et / ou vortex bourrelet. La lyse cellulaire doit être surveillée par examen des cellules sous le microscope. Troisièmement, il est très important de préparer un lysat clarifié pour le pull down dosage ou IP. Centrifugation de vitesse courte ou faible peut contribuer à la contamination de débris cellulaires dans le lysat et cela affecte la capacité de DeTect le PTM. Enfin, une agitation vigoureuse des perles avec un grand volume de lysat clair (environ 1 ml) dans un tube de centrifugeuse de 1,5 ml de micro assure que les perles sont entièrement suspendus pour le dosage ou IPs tirer vers le bas. En résumé, les techniques de purification de protéines et de détection tel que celui décrit ici fournissent des indications sur la manière dont mécaniques importantes de protéines PTM kinétochoriens affecte leur structure et leur assemblage pour la ségrégation des chromosomes fidèle 14, 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass beads BioSpec Products 11079105 0.5 mm diameter
Mini beadbeater BioSpec Products #693 8 cell disrupter
Ni-NTA superflow Qiagen 30430 100 ml
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8215 1 ml
Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit Sigma-Aldrich A7470 1 ml
Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse Sigma-Aldrich F1804 Primary antibody, dilution 1:1,000
c-Myc antibody (A-14) Santa Cruz Biotechnology sc-789 Primary antibody, dilution 1:5,000
Purified mouse antibody monoclonal 9E10 Covance MMS-150P Primary antibody, dilution 1:5,000
Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody Covance MMS-258R Primary antibody, dilution 1:1,000
ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA934V Secondary antibody, dilution 1:5,000
ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab GE Healthcare Life Sciences NA931V Secondary antibody, dilution 1:5,000
DC protein assay Bio-Rad 500-0116
Nitrocellulose membrane Novex LC2001 0.45 mm pore size
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Novex NP0321BOX 1.0 mm, 10 well
NuPAGE MES SDS Running Buffer Novex NP0002 20x
NuPAGE Transfer Buffer Novex NP0006-1 20x
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34078
10x PBS pH7.4 GIBCO 70011-044
Blue sensitive X-Ray film Dbio DBOF30003
Automatic developer Kodak M35AX-OMAT
Nocodazole Sigma-Aldrich M1404 50 mg
MG-132 Selleck Chemicals S2619 25 mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
  2. Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
  3. Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
  4. Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. Genetics. 194, 513-518 (2013).
  5. Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
  6. Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
  7. Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
  8. Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
  9. Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
  10. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  11. Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
  12. Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. Genetics. 172, 783-794 (2006).
  13. Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
  14. Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
  15. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
Protein Purification Technique qui permet la détection de sumoylation et Ubiquitination de levure bourgeonnante kinétochoriens protéines Ndc10 et Ndc80
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).More

Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80. J. Vis. Exp. (99), e52482, doi:10.3791/52482 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter