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Immunology and Infection

एक गिलास समर्थित प्लानर लिपिड bilayer पर प्राकृतिक हत्यारा सेल रोग प्रतिरक्षण अन्तर्ग्रथन की सुपर संकल्प इमेजिंग

Published: February 11, 2015 doi: 10.3791/52502
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Center for Human Immunobiology, Texas Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine, 3Department of Pathology and Immunology, Baylor College of Medicine
* These authors contributed equally

Introduction

प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन (है) सेल सक्रियण और समारोह एक के लिए एक महत्वपूर्ण जंक्शन पर स्थित है। यह प्रतिजन प्रस्तुति और सेल की मध्यस्थता उन्मुक्ति बाहर किया जाता है जिसके द्वारा प्राथमिक माध्यम है। synapse गठन की जल्द से जल्द सूक्ष्म पढ़ाई एक सेल सेल एकत्रित 2 प्रणाली का उपयोग किया। इस दृष्टिकोण के साथ प्रमुख सीमा है कि यह इस प्रकार अन्तर्ग्रथनी संरचना ही के पर्यवेक्षक के दृष्टिकोण सीमित थे, के रूप में conjugates के अधिकांश, 'प्रोफ़ाइल में' देखा जाएगा कि है। 1999 में, डस्टिन प्रयोगशाला पहले McConnel प्रयोगशाला 4,5 ने बीड़ा उठाया गया था जो कांच-समर्थित लिपिड bilayer (SLB) तकनीक 3, के उपयोग से इस सीमा को संबोधित किया। प्रोटीन जुड़ा हुआ है और दो आयामों में आज़ादी से स्थानांतरित किया जा सकता है जिसमें एक गिलास समर्थित तलीय लिपिड सतह, के पक्ष में प्रतिजन पेश कोशिकाओं (APCs) का निपटारा इस दृष्टिकोण। इस विधि का प्रयोग, डस्टिन और उनके सहयोगियों टी में सीधे ऊपर सहकर्मी करने में सक्षम थेवह उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग, और पहली बार के लिए है की संरचना में एक "का सामना करने वाली चेहरा" देखो पाने Synapse।

SLB प्रणाली के उपयोग के साथ है, कल्पना की जा सकती है जिसके साथ विस्तार से केवल वर्तमान इमेजिंग तकनीक 6-8 की सीमाओं से प्रतिबंधित कर दिया गया है। मानक रोशनी तकनीक का उपयोग करना, न्यूनतम संकल्प (यानी, वे प्रतिष्ठित किया जा सकता है जिसमें दो अलग-अलग वस्तुओं के बीच न्यूनतम दूरी) <किया गया रेले की कसौटी 9 के आधार पर 200 एनएम गया है। इस सीमा अन्तर्ग्रथन कि मेकअप बहुत ठीक, आणविक पैमाने पर संरचनाओं की इमेजिंग hinders, और सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक 10-12 के विकास के लिए, जब तक इन संरचनाओं के दृश्य इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग तय कोशिकाओं की इमेजिंग तक ही सीमित था।

इस तरह के सिम के रूप में सुपर संकल्प तकनीक की एक किस्म के हाल के आगमन के साथ (संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी), पाम (photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी), तूफान (stochastical ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी), और STED 10-12, जांचकर्ताओं अब बारी में है की एक तेजी से स्पष्ट समझ प्रदान की गई है, जो अभूतपूर्व विस्तार में इन अन्तर्ग्रथनी संरचनाओं का अध्ययन करने में सक्षम हैं। STED माइक्रोस्कोपी के फायदे में 13 से पहले वर्णित किया गया है। यहाँ हम नव विकसित 660 एनएम कमी लेजर के साथ सुसज्जित STED माइक्रोस्कोपी के साथ सुपर संकल्प इमेजिंग का वर्णन है। पारंपरिक 592 एनएम कमी लेजर की तुलना में, 660 एनएम लेजर फ्लोरोसेंट रंजक (http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/ देखें), विशेष रूप से इन लाल fluorophores के एक व्यापक चयन के लिए अनुमति देता है।

अन्य प्रकाशनों एंटीबॉडी लेपित गिलास स्लाइड 13,14 पर एन.के. सेल synapses के STED इमेजिंग का वर्णन किया है। इधर, SLB प्रणाली एन.के. सेल अन्तर्ग्रथन अध्ययन करने के लिए सुपर संकल्प STED माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त है। इस तकनीक antibody- से अधिक लाभ हैएम्बेडेड सतह प्रोटीन एक फ्लैट दो आयामी सतह (XY विमान) में स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं, जिसमें एक तरल पदार्थ मोज़ेक, होने का लेपित स्लाइड। यह और अधिक ईमानदारी से एक लक्ष्य सेल की जैविक और मोबाइल सतह mimics, और फलस्वरूप बेहतर एक physiologically प्रासंगिक प्रतिरक्षा अन्तर्ग्रथन के गठन का स्मरण दिलाता है।

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य SLB प्रणाली और सुपर संकल्प STED माइक्रोस्कोपी के संयोजन से एन.के. कोशिकाओं की कैसे छवि को प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन का एक विस्तृत विवरण के साथ अंत उपयोगकर्ता प्रदान करना है। यह करने के लिए आवश्यक कदम के साथ अंत उपयोगकर्ता प्रदान करेगा: liposomes तैयार करते हैं, प्रोटीन-एम्बेडेड bilayers का निर्माण, लिपिड bilayers पर प्रोटीन घनत्व निर्धारित करते हैं, और STED माइक्रोस्कोपी का उपयोग सुपर संकल्प छवियों के अधिग्रहण। इन तकनीकों में इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र तक सीमित नहीं हैं, और मोटे तौर पर विषयों की एक किस्म में उपयोग किया जा सकता है।

Protocol

Liposomes 1. तैयारी

  1. 1,2-dioleoyl-एस.एन.-glycero-3-phosphocholine (DOPC) और 1,2-dioleoyl-एस.एन.-glycero-3-phosphoethanolamine-एन-कैप biotinyl की क्लोरोफॉर्म से निलंबित शेयर समाधान की राशि की गणना (बायोटिन पीई) वांछित अंतिम एकाग्रता में पतला शेयरों बनाने के लिए। 10 मिलीलीटर प्रत्येक में 400 माइक्रोन DOPC और 80 माइक्रोन बायोटिन पीई फॉस्फोलिपिड के अंतिम सांद्रता बनाने के लिए, अलग गिलास क्रोमैटोग्राफी ट्यूबों में 10 मिलीग्राम / एमएल DOPC के 629 μl और 88 μl 10 मिलीग्राम / एमएल बायोटिन पीई रखकर शुरू करते हैं।
    नोट: यह DOPC और बायोटिन पीई के क्लोरोफॉर्म से निलंबित शेयर समाधान के हस्तांतरण, जबकि समाधान (120 मिलीलीटर पानी युक्त 60 ग्राम पोटेशियम हाइड्रोक्साइड, KOH के लिए एक एल 95% इथेनॉल) सफाई से कांच हैमिल्टन सीरिंज और कांच क्रोमैटोग्राफी ट्यूबों साफ करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  2. रासायनिक हुड में आर्गन की एक धारा के साथ क्लोरोफॉर्म सूखी। Parafilm के द्वारा क्रोमैटोग्राफी ट्यूब सील।
  3. एक lyophiliz में एक उच्च वैक्यूम करने के लिए नव सूखे liposomes विषयएर हे / एन किसी भी अवशिष्ट क्लोरोफॉर्म दूर करने के लिए। 60-90 मिनट के लिए सूखी ही दिन पूरा होने के लिए।
  4. Lyophilizer चलाता है, कुछ कमजोर पड़ने बफर तैयार करते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, 25 मिमी Tris, पीएच 8.0 से मिलकर 25 मिलीलीटर की तैयारी; 150 मिमी NaCl; और (वजन) के द्वारा 2% N-octyl-β-डी-glucopyranoside (ओग) डिटर्जेंट। तो सूखी ओग पाउडर जोड़ने से पहले आर्गन साथ ऑक्सीजन विस्थापित, एक साथ पहली पहले दो अवयवों मिश्रण। तैयारी के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर ओग 0.2 माइक्रोन सेलूलोज एसीटेट झिल्ली के साथ समाधान है, और दुकान फिल्टर।
  5. इसके अलावा, लेकिन ओग के बिना, एक ही सांद्रता में Tris-खारा बफर के 1 एल के दो पेंच टॉप बोतलें तैयार करते हैं। प्रत्येक के तल में एक आसुत जल-साफ चुंबकीय हलचल पट्टी रखें। Tris-खारा बफर के 6 अतिरिक्त लीटर तैयार करें। आर्गन के साथ सभी बोतलों से ऑक्सीजन निकालें और के रूप में अच्छी तरह से 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें जगह है।
  6. Lyophilization के बाद, प्रत्येक का एक 4 मिमी समाधान बनाने के लिए Tris-खारा ओग बफर में सूखे लिपिड भंग। उदाहरण के बादवॉल्यूम्स, बायोटिन पीई ट्यूब DOPC ट्यूब के लिए 2 मिलीलीटर, और 0.2 मिलीलीटर जोड़ने।
  7. एक साथ DOPC लिपिड के साथ बायोटिन पीई लिपिड मिलाएं। युग्मित बायोटिन फॉस्फेट सिर समूहों की तरलता ख़राब कर सकते हैं, क्योंकि यह SLB की गतिशीलता में सुधार। 80 माइक्रोन बायोटिन पीई के अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए, 0.2 4 मिमी बायोटिन पीई की मिलीलीटर और 4 मिमी DOPC के 1 मिलीलीटर मिश्रण। तब Tris-खारा ओग बफर के 8.8 मिलीलीटर जोड़ने।
  8. 400 माइक्रोन DOPC के अंतिम एकाग्रता के लिए, बस Tris-खारा ओग के 9 मिलीलीटर के साथ 4 मिमी DOPC के 1ml मिश्रण।
  9. बर्फ के पानी के साथ sonicator भरें। एक उपयोगिता क्लैंप का उपयोग करके sonicator के केंद्र में पतला फॉस्फोलिपिड युक्त ग्लास ट्यूब डाल दिया। समाधान स्पष्ट हो जाता है जब तक 10 मिनट के लिए पतला फॉस्फोलिपिड Sonicate।
    नोट: sonication के गर्मी उत्पन्न करेगा के बाद से कम तापमान में रखने के लिए sonicator नहाने के पानी में बर्फ जोड़ें।
  10. तरल के ऊपर हवा में ऑक्सीजन को विस्थापित करने के आर्गन के साथ ट्यूबों में भरें, और parafilm के साथ उन्हें सील।
    11. Liposomes 2. डायलिसिस

    1. शुष्क डायलिसिस ट्यूबिंग के दो वर्गों में कटौती (आण्विक वजन कट ऑफ: 12-14,000, व्यास: 6.4 मिमी) उचित लंबाई के (इस उदाहरण में, 40 सेमी), प्रत्येक फॉस्फोलिपिड कमजोर पड़ने के लिए एक रोल से।
    2. उन्हें 2 मिनट के लिए एक गिलास बीकर में आसुत पानी की एक 200 मिलीलीटर में सोख करने की अनुमति देकर ट्यूबिंग वर्गों rehydrate।
    3. एक उच्च सेटिंग पर 5 मिनट के लिए इस माइक्रोवेव, या कम से कम पानी एक फोड़ा करने के लिए आता है जब तक।
    4. प्रत्येक ट्यूब के एक छोर पर एक गाँठ बाँध और Tris-खारा-ओग बफर के कुछ मिलीलीटर के साथ इंटीरियर बाहर कुल्ला। इसके बाद, कुशलता के अंदर शेष बफर की मात्रा को कम करने के लिए संभव के रूप में इस धोने बफर के रूप में ज्यादा बाहर निचोड़।
    5. सब हवा बाहर करने के लिए इतनी के रूप में एक लामिना का प्रवाह हुड में, एक छोटे से डायलिसिस ट्यूब बंद होने के साथ खुला समाप्त होता है प्रत्येक ट्यूब में पतला फॉस्फोलिपिड जोड़ने के लिए और दबाना। पूरी तरह हवा के बहिष्कार और नीचे clamping द्वारा नमूना की एक छोटी मात्रा के बलिदान की आवश्यकता होगी# 8220; पानी की लाइन "।
    6. ओग बिना Tris-खारा बफर के पहले से तैयार की बोतलों में नमूने विसर्जित कर दिया। 4 डिग्री पर हे / एन हलचल करने के लिए फिर से सील और जगह से पहले आर्गन साथ बोतल में ऑक्सीजन विस्थापित।
    7. कम से कम 3 बार के लिए ओग बिना Tris-खारा बफर की एक नई बोतल में हर 12 घंटे ट्यूबिंग स्थानांतरण।
    8. फौरन dialyzed लिपिड के हटाने से पहले, ऑक्सीजन को विस्थापित करने के आर्गन के साथ प्रत्येक भरकर लिपिड विभाज्य में जो छोटे ट्यूबों के एक नंबर तैयार करते हैं।
    9. 36 घंटे के बाद, लामिना का प्रवाह हुड में डायलिसिस की बोतलें ले और बोतलों से डायलिसिस ट्यूब को हटा दें। गीला पानी इकट्ठा करने के लिए हाथ पर एक बेंच डायपर या बीकर है।
    10. तब क्लिप हटाने के लिए और ध्यान से बर्फ पर आर्गन गैस से भरे पूर्व तैयार ट्यूबों में 1 मिलीलीटर aliquots में pipet के माध्यम से dialyzed लिपिड समाधान हस्तांतरण, क्लिप ऊपर डायलिसिस ट्यूबिंग काटें।
    11. जलीय liposome समाधान विभाज्य, मैं ऑक्सीजन फिर से विस्थापित करने के लिए आर्गन धारा का उपयोगएन प्रत्येक ट्यूब।
    12. 4 डिग्री पर liposomes स्टोर। स्थिर नहीं रहो।

    लिपिड bilayer पर एंटीबॉडी घनत्व 3. निर्धारण

    1. निम्नलिखित सांद्रता में, biotinylated, fluorescently लेबल एंटीबॉडी के एक कमजोर पड़ने श्रृंखला, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए मात्रा में 50 μl तैयार: (रिक्त) 0 एनएम, 10 एनएम, 50 एनएम, 100 एनएम, और 500 एनएम। (इसके बाद के रूप में "नमूना" श्रृंखला के लिए कहा गया है)।
    2. एक 96 अच्छी तरह से वी के नीचे प्लेट के 6 कुओं में सिलिका मोतियों की एक μl जोड़ें। वे व्यवस्थित करने के लिए करते हैं, के रूप में अच्छी तरह से pipetting से पहले मोती मिलाने के लिए सुनिश्चित करें।
      नोट: निलंबित बजाय सूखी मोतियों का आदेश दिया रहा है, पतला करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    3. : 1 के अनुपात में एक एक पर Biotinyl फॉस्फोलिपिड: इन मोतियों के लिए, दो मिश्रित DOPC की μl जोड़ें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए यह मत करो।
    4. माला और फॉस्फोलिपिड के साथ बातचीत के लिए प्रोत्साहित करने के लिए 10 सेकंड प्रत्येक के लिए मध्यम शक्ति में 3 बार एक vortexer पर थाली नाड़ी।
    5. 5% कैस के 150 μl जोड़ेंप्रत्येक अच्छी तरह से Ein। ऊपर pipetting द्वारा और तीन बार नीचे अच्छी तरह से मिलाएं।
    6. थाली, फिर 10 मिनट के लिए कैसिइन समाधान में सेते इसे बाहर से धो दें। धोने के लिए, HEPES के साथ 250 μl की कुल मात्रा के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक को भरने के 1% मानव सीरम albumin (एचएसए) के साथ खारा (HBS) बफर। 2 मिनट के लिए 1000 XG पर अपकेंद्रित्र। बाहर पिपेट और सतह पर तैरनेवाला के शीर्ष 200 μl त्यागें, और तीन धोने चक्र की कुल के लिए दो बार दोहराएँ।
    7. एक 333 एनजी / एमएल एकाग्रता में streptavidin के 50 μl जोड़ें। फिर 10 सेकंड 3x थाली नाड़ी, और यह 15 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर बैठते हैं। धो 3x चरण 6 में के रूप में अपार streptavidin दूर करने के लिए।
    8. पहले से तैयार कमजोर पड़ने श्रृंखला से fluorescently लेबल biotinylated एंटीबॉडी के 50 μl जोड़ें अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए (3.1 कदम देखें), और 20-30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर थाली की जगह। धो 3x चरण 6 में के रूप में अपार एंटीबॉडी हटाने के लिए।
    9. अंतिम धोने के बाद, फिर एक FACS ट्यूब के लिए स्थानांतरण, HBS / 1% एचएसए के 100 μl में मोती resuspend। दो बार इस दोहराएँ300 μl की कुल के लिए अच्छी तरह से सभी मोतियों की कुशल हटाने, यह सुनिश्चित करने के लिए, और प्रत्येक कुएं लिए ऐसा करते हैं।
    10. प्रवाह कोशिकामापी के परिणामस्वरूप ट्यूब लाओ। यह उन्हें पढ़ने के लिए समय है।
    11. प्रतिदीप्ति तीव्रता अंशांकन (FIC) मनका किट से 'बी' के रूप में चिह्नित की बोतल से एक बूंद जोड़ें एक FACS ट्यूब (इसके बाद "मानक श्रृंखला" के रूप में करने के लिए कहा गया है), और HBS / 1% एचएसए के 300 μl के साथ पतला।
    12. इस ट्यूब पढ़ा है, लेकिन बस अभी तक डेटा रिकॉर्ड नहीं है। अभी के लिए, बस खाली मोती ठीक से चुना जाता है यह सुनिश्चित। शिखर हिस्टोग्राम के दूर बाईं ओर पर है जब तक उपयुक्त चैनल में मापा मोतियों की प्रतिदीप्ति दिखा हिस्टोग्राम बनाओ, फिर नीचे उत्तेजना लेजर का वोल्टेज पाली।
    13. ट्यूब निकालें और एक ही ट्यूब (4 के माध्यम से एक लेबल) श्रृंखला में अन्य चार ट्यूबों में से प्रत्येक की एक बूंद जोड़ें। अब, फिर से मशीन में ट्यूब जगह है, और 5 अलग चोटियों के रूप में प्रकट करना चाहिए जो परिणामी डेटा, रिकॉर्ड है। नमूना श्रृंखला से प्रत्येक व्यक्ति ट्यूब पढ़ें।
    14. FACS विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, आधा अधिक से अधिक बिंदु पर मानक श्रृंखला हिस्टोग्राम में प्रत्येक चोटी की पूरी चौड़ाई में फैले एक गेट आकर्षित। यही कारण है कि प्रत्येक चोटी के लिए एक गेट है। प्रत्येक नमूने लिए एक ही है। एमएफआई प्रत्येक गेट के लिए (मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता) ध्यान दें।
    15. उपयुक्त जगह में एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम इनपुट मापा एमएफआई मूल्यों का उपयोग करना। इसके अलावा इनपुट MESF मूल्यों (समकक्ष घुलनशील Fluorochrome के अणुओं) मानक श्रृंखला में प्रत्येक बोतल के लिए (प्रत्येक मनका कोटिंग फ्लोरोसेंट अणु की औसत संख्या)। यह जानकारी प्लास्टिक पर निर्देशों ट्यूबों में आया जार का पालन करके पाया जा सकता है।
    16. Fluorophores की संख्या और मापा तीव्रता के बीच एक रैखिक संबंध बनाने, MESF मूल्यों के खिलाफ एमएफआई भूखंड जाएगा स्प्रेडशीट का उपयोग करें।
    17. प्रो करने के लिए डाई का अनुपात निर्धारित करने के लिए सूक्ष्म मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में 'प्रोटीन और लेबल' के मॉड्यूल का उपयोगलेबल एंटीबॉडी में Tein।
    18. इनपुट नमूना प्रोटीन की लेबलिंग दक्षता, लिपिड के साथ लेपित मोतियों की औसत व्यास, और प्रत्येक प्रविष्टि के लिए एमएफआई मूल्य। स्प्रेडशीट स्वचालित रूप से प्रत्येक प्रोटीन कमजोर पड़ने और प्रत्येक एकाग्रता में नमूना प्रोटीन की बोने घनत्व के लिए MESF मूल्यों की गणना करने के लिए कदम 3.16 में उत्पन्न लाइन ग्राफ से फार्मूला का प्रयोग करेंगे।

    4. अलग और संवर्धन मानव एन.के. कोशिकाओं

    1. विभाज्य 15 मिलीलीटर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में परिधीय रक्त या buffy कोट। पीबीएस 1 के अनुपात में 1% FBS युक्त के साथ इस खून पतला: 1।
    2. धीरे से एक 10 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक के साथ ट्यूब के नीचे करने के Ficoll के 13 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. अपकेंद्रित्र 20 त्वरक के साथ 1200 XG पर न्यूनतम और ब्रेक के बंद के लिए या अपने न्यूनतम सेटिंग्स में इस ट्यूब।
    4. Centrifugation के बाद, डब्ल्यू, (PBMCs) परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear की अस्थायी रूप से बादल सफेद मध्यम परत एकत्र करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोगhich बैठते हैं और एक स्पष्ट पीला ऊपरी परत और लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) के एक सब से नीचा परत के ऊपर बैठना, जो दोनों के लिए एक अधिक से बादल पीला रंग निचली परत, बीच चौराहे चाहिए। नोट PBMCs एकत्र करने में किसी भी लाल रक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए मत करो।
    5. एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एकत्र PBMCs प्लेस, और पीबीएस 1% FBS युक्त के साथ क्षमता को पतला। फिर अपकेंद्रित्र, 300 x जी पर 5 मिनट के लिए अधिकतम पर ब्रेक और एक्सीलेटर, के साथ इस बार।
    6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1% FBS युक्त पीबीएस के 10 एमएल में कोशिकाओं resuspend।
    7. कदम 4.6 में के रूप में एक बार फिर वही सेटिंग में centrifuging जबकि कोशिकाओं की गणना।
    8. एक बार फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और 10 मिलियन कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर R10 के माध्यम से कोशिकाओं resuspend।
    9. निर्माता के निर्देशों का पालन, एक 5 मिलीलीटर polystyrene ट्यूब में 30 लाख की कोशिकाओं को ले लो, और एक चुंबकीय जुदाई किट का उपयोग कर एन.के. कोशिकाओं को अलग। अलगाव के बाद, 500,0 के घनत्व पर कोशिकाओं एक अधिक और resuspend गिनतीR10 के पूरा मध्यम में 00 कोशिकाओं / एमएल (88% RPMI, 10% FBS के; 1% HEPES, 1% सोडियम पाइरूवेट) आईएल -2 (100 यू / एमएल) के साथ पूरक। सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री, और कम से संस्कृति 2-3 बार साप्ताहिक मध्यम बदलें।

    5. ग्लास-समर्थित प्लानर लिपिड bilayer कोडांतरण

    1. एक बीकर में 3: 1 के अनुपात में सल्फ्यूरिक एसिड के साथ 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड मिश्रण से 100 मिलीलीटर पिरान्हा समाधान तैयार है।
      नोट: हमेशा एक ठीक से नामित रासायनिक धूआं हुड में सल्फ्यूरिक एसिड की तरह हानिकारक एजेंटों के साथ काम से बाहर ले जाने के लिए।
    2. इस समाधान में 20-30 मिनट के लिए पिरान्हा समाधान में दो आयताकार # 1.5 coverslips के विसर्जित कर दिया।
      नोट: यह पिरान्हा समाधान द्वारा coverslips साफ करने के लिए आवश्यक है।
    3. Coverslips साफ किया जा रहा है जबकि पहले से 400 माइक्रोन DOPC लिपिड और पहले 80 माइक्रोन बायोटिन पीई लिपिड तैयार की एक ट्यूब तैयार की, एक ट्यूब ले। आर्गन की टंकी के लिए बर्फ पर उन्हें परिवहन।
    4. आर्गन के साथ एक नया microcentrifuge ट्यूब में ऑक्सीजन विस्थापित,: 1 के अनुपात फिर एक एक पर DOPC और बायोटिन पीई एक साथ जोड़ें। विशिष्ट मात्रा प्रयोगात्मक जरूरतों के आधार पर अलग अलग होंगे, लेकिन कम से कम 2 μl प्रत्येक पर होना चाहिए। रेफ्रिजरेटर के बाद के लौटने से पहले, के रूप में अच्छी तरह से एक बार फिर आर्गन गैस, और व्यक्तिगत अभिकर्मक ट्यूबों के साथ मिश्रण ट्यूब में ऑक्सीजन विस्थापित।
    5. वे सफाई खत्म हो रहे हैं, के बाद अच्छी तरह से आसुत जल के साथ coverslips कुल्ला। कुछ मिनट के लिए शुष्क हवा के लिए बाहर coverslips के सेट करें।
    6. कदम 5.4 में तैयार liposome मिश्रण के 1.5 μl वापस लेने और चैम्बर स्लाइड के लेन कक्षों में से एक में एक बूंद में यह विभाज्य। लेन प्रति दो बूंदों का उपयोग ठेठ है, लेकिन जरूरी नहीं है।
    7. जल्दी से और कुशलता की बूँदों से अधिक शुष्क coverslip जगह। Coverslip के लिए रखा जाता है एक बार वे विलय नहीं है कि इतनी बूंदों पर्याप्त स्थान दिया गया है कि सुनिश्चित करें। इसके अलावा, बूंदों कक्ष की दीवारों के किनारों को छूने के बिना, परिपत्र और अच्छी तरह से परिभाषित रहना सुनिश्चित करें। मजबूती से नीचे प्रेसके बीच है और प्रत्येक लेन के आसपास में coverslip और स्लाइड के बीच एक निर्विवाद मुहर सुनिश्चित करने के लिए।
    8. एक मार्कर पेन का उपयोग बूंदों के पदों को चिह्नित
    9. Bilayer ब्लॉक करने के लिए कक्ष के माध्यम से जलीय 5% कैसिइन के 100 μl गुजरती हैं। प्रवाह कक्ष में कोई बुलबुले हैं कि सुनिश्चित करने के लिए प्रयास करें।
    10. प्रत्येक गली में 333 एनजी / एमएल की एकाग्रता में streptavidin के 100 μl इंजेक्षन। आरटी पर 10-15 मिनट के लिए सेते हैं। इसके बाद, अतिरिक्त streptavidin को दूर करने के लिए प्रत्येक लेन के माध्यम से जोड़ने / 1% एचएसए के 3 मिलीलीटर चलाकर धो लें।
    11. ऐसे में पहले 20-30 मिनट के लिए अंधेरे में धारा 3 सेते में सबसे अधिक प्रभावी होने के लिए निर्धारित प्रोटीन एकाग्रता में एलेक्सा Fluor 568 के रूप में biotinylated fluorescently लेबल विरोधी CD16 के 100 μl जोड़ें। प्रत्येक लेन के माध्यम से जोड़ने / 1% एचएसए के 3 मिलीलीटर चलाकर फिर से धो लें।
    12. सेंट की गैर विशिष्ट बंधन का मौका किसी भी अतिरिक्त streptavidin बाँध और इस तरह खत्म करने के क्रम में कक्ष के माध्यम से एक एकाग्रता 25 एनएम पर डी-बायोटिन की 100 μl प्रवाहकोशिकाओं को reptavidin।
    13. HBS / 1% HSA में 500,000 / एमएल की एकाग्रता में एन.के. कोशिकाओं और resuspend गणना।
    14. कोशिकाओं नीचे कताई, वहीं लेन प्रति HBS / 1% HSA की एक और 3 मिलीलीटर के साथ चैम्बर के बाहर डी बायोटिन धो लें।
    15. पूर्व एन.के. कोशिकाओं को जोड़ने के लिए एक कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) या confocal माइक्रोस्कोपी पर photobleaching (FRAP) के बाद प्रतिदीप्ति वसूली से SLB पर ligands के गतिशीलता की जाँच करें।
    16. कोशिकाओं कताई समाप्त कर दिया है और वांछित एकाग्रता में resuspended किया गया है एक बार, प्रत्येक लेन करने के लिए 100 μl जोड़ें।
    17. 30-60 मिनट के लिए एक 37 डिग्री 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में चैम्बर रखें।
    18. इस ऊष्मायन अवधि के बाद, 10-20 मिनट के लिए आरटी पर 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक। Paraformaldehyde के दूर करने के लिए प्रत्येक लेन के माध्यम से पीबीएस के 3 मिलीलीटर चलाकर धो लें।
    19. बफर (5% सामान्य गधा सीरम और 0.2% पीबीएस में Tritron एक्स 100) अवरुद्ध 400 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
    20. दाग एफ actin और विज्ञापन से perforinडिंग पतला fluorescently लेबल phalloidin के 200 μl (1 यूनिट / मिलीलीटर से लेबल phalloidin) और fluorescently लेबल विरोधी perforin mAb (500 एनजी / एमएल विरोधी perforin एमएबी)। 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
    21. पीबीएस के 3 मिलीलीटर चलाकर धो लें। चैम्बर इमेजिंग के लिए तैयार है।

    STED का उपयोग कर लिपिड bilayer पर एन.के. Synapse 6. इमेजिंग

    1. सभी आवश्यक हार्डवेयर मॉड्यूल पर मुड़ें।
    2. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को शुरू करें। गुंजयमान स्कैनिंग और STED मॉड्यूल दोनों को सक्षम करें। इन चुनावों करने के बाद, सॉफ्टवेयर आरंभ करने के लिए के बारे में 3-5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    3. स्क्रीन के शीर्ष पर "विन्यास" टैब पर क्लिक करें।
    4. चुनें "लेजर विन्यास" तो सफेद रोशनी और STED 592 एनएम लेज़रों पर बारी।
    5. 100x उद्देश्य चुनें, और 592 एनएम कमी लेजर के साथ उत्तेजना लेजर बीम संरेखित।
    6. "लेजर विन्यास" मॉड्यूल का चयन 592 रिक्तीकरण बंद कर देते हैंलेजर, और 660 एनएम कमी लेजर पर बारी।
    7. लेंस पर, मंच पर स्लाइड रखें। सफेद रोशनी दीपक और oculars के उपयोग करते हुए ध्यान में सीमांकन bilayer क्षेत्र पर बाध्य कोशिकाओं लाओ।
    8. सीधे "विन्यास" टैब के अधिकार के लिए, "अधिग्रहण" टैब पर लौटें।
    9. "स्विच WhiteLight करने के लिए" टैब पर क्लिक करें, फिर उस पर मॉड्यूल की बारी है और उचित तरंगदैर्ध्य को उत्तेजना लेजर लाइन खींचें।
    10. तो तरंग दैर्ध्य की उचित सीमा धरना पता लगाने रेंज सेट, उन उपलब्ध की सूची से वांछित डिटेक्टर का चयन करें।
      नोट: उत्तेजना बीम के नीचे सीधे पता लगाने रेंज कभी नहीं रखा।
    11. बाएं हाथ के उपकरण पट्टी के नीचे में अनुक्रमिक स्कैन बातचीत को लाने के लिए बाएं हाथ में "Seqential" बटन पर "मोल" उपकरण पट्टी पर क्लिक करें। यह उपयोगकर्ता एकाधिक दृश्यों को जोड़ने के लिए प्रत्येक की अनुमति देता हैएक अलग रंग के लिए एक अलग उत्तेजना किरण के साथ। "फ्रेम के बीच" क्लिक करें और फिर चरणों 6.9 और 6.10 के रूप में प्रत्येक अतिरिक्त रंग के लिए उत्तेजना आवृत्ति, डिटेक्टर, और पता लगाने रेंज की स्थापना की।
    12. सभी सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं एक बार, अधिग्रहण की प्रक्रिया शुरू करने के लिए "प्रारंभ" मारा।
    13. पहले से 13 के रूप में वर्णित, STED deconvolution के लिए तैयार की सेटिंग का उपयोग कर मुक्त deconvolution के सॉफ्टवेयर (Huygens) लागू करें।

Representative Results

चित्रा 1 लिपिड bilayer पर एंटीबॉडी घनत्व के परिणाम से पता चलता है। सिद्धांत फ्लो (ए) के माध्यम से एमएफआई बनाम MESF के मानक वक्र बनाने के लिए मानक मोती का उपयोग करने के लिए है। नमूना श्रृंखला की एमएफआई मानक वक्र का उपयोग MESF में परिवर्तित कर दिया गया। लिपिड bilayer पर एंटीबॉडी घनत्व रैखिक एंटीबॉडी एकाग्रता (बी) के साथ जोड़ा जाता है। ग्लास से समर्थन तलीय लिपिड bilayer पर एन.के. अन्तर्ग्रथन के दो शो ट्रिपल रंग STED छवि चित्रा। लिपिड bilayer पर विरोधी CD16 एंटीबॉडी एफ actin के गठन और ध्रुवीकरण और एन.के. कोशिकाओं में प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन का केन्द्र पैनल में एफ actin जाल के माध्यम से perforin के प्रवेश को ट्रिगर, जम जाता है। इस संयुक्त दृष्टिकोण का प्रयोग, एक सफाई से सीधे एन.के. सेल पर CD16 की क्लस्टरिंग दर्पण जो SLB, भीतर विरोधी CD16 में लेबल fluorescently की microclusters निरीक्षण कर सकते हैं। पारंपरिक confocal छवि, CD16 CENTRA की संरचना की तुलनाएल क्लस्टर अधिक आसानी के कारण समाप्त परिवेश प्रतिदीप्ति को STED छवि में discerned है। इसके अलावा, एक्टिन cytoskeleton की फैटी काफी सुधार संकल्प के साथ देखा जाता है। पिछले टिप्पणियों 16,17 के अनुरूप, perforin पॉजिटिव अपघट्य कणिकाओं STED छवि, ज्यादातर confocal छवि में खो जाता है, जो एक महत्वपूर्ण विस्तार से कम एफ actin घनत्व के क्षेत्रों पर तैनात देखा जाता है।

चित्र 1
लिपिड bilayer पर 3G8 एंटीबॉडी की चित्रा 1. घनत्व। (ए) के मानक श्रृंखला के लिए MESF और एमएफआई के बीच रैखिक संबंध। (बी) प्रोटीन घनत्व और नमूना प्रोटीन कमजोर पड़ने श्रृंखला के लिए एकाग्रता के बीच रैखिक संबंध, प्रति fluorescently लेबल प्रोटीन मोनोमर्स की संख्या दिखा लिपिड-लेपित एसआई पर बढ़ती एकाग्रता के एक समारोह के रूप में इकाई क्षेत्रLica मोती।

चित्र 2
तलीय लिपिड bilayer पर एन.के. अन्तर्ग्रथन चित्रा 2. STED इमेजिंग। प्राथमिक एन.के. कोशिकाओं, SLB युक्त biotinylated fluorescently लेबल विरोधी CD16 (लाल) पर उत्तेजित तय, permeabilized, और फिर phalloidin (नीला) और विरोधी एफ actin के साथ दाग थे (हरा)। एक व्यक्ति के सेल पहले सामान्य confocal सेटिंग के तहत imaged, और फिर STED स्थापित किया गया था। Confocal और STED छवियों ह्युजेंस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर deconvoluted थे। स्केल बार, 1 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

वर्तमान अध्ययन की नवीनता यह एन.के. सेल synapses के अध्ययन करने के लिए STED साथ SLB तकनीक को जोड़ती है। पिछले अध्ययनों प्लाज्मा झिल्ली 6 पर टी सेल synapse गठन 8 और संकेत अणु की तस्करी का अध्ययन करने के TIRF साथ लिपिड bilayer imaged किया है। दूसरों एंटीबॉडी लेपित गिलास स्लाइड 13,14 का उपयोग कर एन.के. सेल synapses के STED इमेजिंग का वर्णन किया है। इस के साथ साथ आगे वर्णित संकर विधि लिपिड bilayer सतह पर सुपर संकल्प इमेजिंग द्वारा afforded बढ़ाया स्पष्टता, साथ एन.के. सेल अन्तर्ग्रथन इमेजिंग द्वारा इन प्रयासों पर बनाता है जो एक APC के बेहतर मॉडल गतिशील सतह।

SLBs वास्तविक लक्ष्य कोशिकाओं या APCs कि अधिकारी cytoskeleton है, लिपिड rafts का कमी कृत्रिम झिल्ली, और अन्य ligands के हैं, इस तकनीक ऐसी गतिशीलता और ligands के उन्मुखीकरण के रूप में महत्वपूर्ण सुविधाओं पुनरावृत्ति कर सकते हैं। इस SLB प्रणाली विदारक टी में एक न्यूनीकारक दृष्टिकोण के रूप में सेवा करने के लिए अनुमति देता हैIS के गठन और IS की गतिशीलता के लिए अलग-अलग रिसेप्टर्स और ligands की वह योगदान। SLBs की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता शोधकर्ताओं ने ऐसे confocal और TIRF माइक्रोस्कोपी के रूप में उच्च संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ इस तकनीक गठबंधन कर सकते हैं। STED माइक्रोस्कोपी की शुरूआत भी आगे अनुसंधान और इसके नैदानिक ​​अनुप्रयोगों में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करने, इस लाभ बढ़ जाती है।

इस प्रणाली का एक संभावित आलोचना SLB पर्याप्त रूप से इस प्रकार जिसके परिणामस्वरूप अन्तर्ग्रथन में संभावित रूप से गैर-शारीरिक शारीरिक विशेषताओं को जन्म दे रही है, एक APC के जटिल सतह की नकल नहीं करता है। यह SLB पर सतह अणुओं की सीमित प्रदर्शनों की सूची पूरी तरह से एक APC के विभिन्नतापूर्वक आबादी सतह पुनरावृत्ति नहीं करता सच है कि यह synapse गठन पर व्यक्तिगत रिसेप्टर और ligand बातचीत के प्रभाव का निर्धारण करने के जांचकर्ताओं की अनुमति देता है, कि इस सीमा को भी फायदेमंद हो सकता है ।

टीयहाँ इस प्रक्रिया में कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। सबसे महत्वपूर्ण अलावा liposomes की है कि ऑक्सीकरण इस तरह के कदम 1.10, 2.6, और 2.11 के रूप में लगातार ट्यूब और समाधान, में ऑक्सीजन को विस्थापित करने के आर्गन का उपयोग कर के माध्यम से रोका जा रहा है। लिपिड ऑक्सीकरण इस प्रकार आसानी से ले जाने और synaptic संरचना में भाग लेने के लिए सतह प्रोटीन की क्षमता बाधा कमी आई है, लिपिड गतिशीलता में परिणाम होगा। इसी तरह, यह lyophilization (कदम 1.2) द्वारा liposome में सभी क्लोरोफॉर्म दूर करने के लिए भी महत्वपूर्ण है। लिपिड bilayer में प्रोटीन घनत्व के निर्धारण में, यह पहली बार समूहों से मुक्त एक समरूप निलंबन में सिलिकॉन मोतियों को तितर-बितर करने के लिए महत्व का है। यदि आवश्यक हो, मोतियों की sonication के लिए लागू किया जा सकता है। Coverslips साफ कर रहे हैं जिसमें SLB कोडांतरण में, जल्दी कदम (5.1-5.8), बूंदों रखा जाता है, और coverslip महत्वपूर्ण हैं चिपका है। इनमें से किसी में एक गलती (धारा 5 की शुरुआत से) से अधिक प्रयोग शुरू करने की जरूरत है सकते हैं। इस कारण से, यह हैएक दुर्घटना के मामले में समय को बचाने के लिए आवश्यक हो जाएगा की तुलना में अच्छा अभ्यास अधिक coverslips साफ करने के लिए।

इस प्रणाली के साथ काम कर रहा है जब गैर-क्लस्टरिंग सबसे लगातार मुद्दा है। अंतिम चरण में कोशिकाओं visualizing, जब भी किसी भी फ्लोरोसेंट अन्तर्ग्रथन खोजने के लिए विफल रहता है, ले जाया जा सकता है कि कुछ कदम उठाए हैं। कोशिकाओं synaptically-शामिल सतह प्रोटीन चाहिए, कांच coverslip या दोहरी परत की सतह के लिए गैर-विशेष रूप से पालन कर सकते हैं जबकि आत्मीय सेल सतह रिसेप्टर के लिए एक और दाग, सेल दोहरी परत के साथ एक अन्तर्ग्रथन का गठन नहीं किया गया है कि यह पुष्टि करने के लिए चैम्बर के लिए जोड़ा जा सकता है unengaged सतह प्रोटीन कोशिका की परिधि के आसपास के रूप में फैलाना धुंधला दिखाई देना चाहिए, जबकि सेल bilayer इंटरफ़ेस के विमान में के रूप में अलग समूहों दिखाई देते हैं। इस विधि विफल करना चाहिए, एक विशेष मार्कर एक कोशिका की सतह पर पर्याप्त बहुतायत में व्यक्त किया जाता है अध्ययन करने के लिए उम्मीद कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए प्रवाह cytometry के माध्यम से उनकी कोशिकाओं की जांच होनी चाहिए। कुछ सतह proteआईएनएस विवो संस्कृति में लंबे समय से अधिक नीचे विनियमित होने के लिए जाना जाता है।

इस प्रोटोकॉल विवरण विशेष रूप से कैसे एन.के. सेल synapse गठन कल्पना करने के लिए करते हैं, SLB प्रणाली केवल कदम 5.11 में प्राथमिक ligand के प्रतिस्थापन के द्वारा किसी भी कल्पनीय immunocyte में synapse गठन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एकाधिक ligands के भी एक साथ जोड़ा जा सकता है। एक भी दोहरी परत के भीतर सतह प्रोटीन पालन के लिए एक streptavidin बायोटिन प्रणाली का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं। निकल NTA: हिस्टडीन बातचीत भी व्यवहार्य हैं। हालांकि, की वजह streptavidin के उच्च शक्ति और विशिष्टता के लिए: बायोटिन संपर्क, हमारी प्रयोगशाला में इस प्रणाली पसंद करती हैं। एक भी कदम 5.13 में निर्धारित घनत्व से bilayer पर जोड़ा कोशिकाओं की एकाग्रता, साथ ही परिपक्वता के विभिन्न चरणों में synapses के निरीक्षण के क्रम में बाद में ऊष्मायन अवधि की अवधि भिन्न हो सकते हैं। इस कोर्स के इंट्रासेल्युलर एसटीआर visualizing की संभावना शामिल है, हालांकि यह भी, जीते किया जा सकता हैuctures (वे पहले से ही एक दूसरे से जुड़ने फ्लोरोसेंट टैग के साथ चिह्नित कर रहे हैं जब तक हमारी प्रयोगशाला में कुछ इस तरह बदल सेल लाइनों का उपयोग करता है)। इस वजह से यह प्रोटोकॉल में संभव अनुकूलन के उच्च डिग्री करने के लिए, एक बुनियादी लिपिड गतिशीलता 15, Synapse गठन सहित, इम्यूनोलॉजी, कोशिका जीव विज्ञान, और जैव रसायन में सवालों की एक अविश्वसनीय रूप से विविध रेंज को संबोधित करने के लिए, STED इमेजिंग के साथ साथ बुनियादी SLB तकनीक का उपयोग कर सकते हैं 16, इंट्रासेल्युलर 17 संकेत, और ट्यूमर सेल मेटास्टेसिस 18।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine		 Avanti  850375C Liposome preparation
18:1 Biotinyl Cap PE
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt)		 Avanti  870273C  Liposome preparation
Argon gas, compressed Airgas  UN1006 Liposome preparation
A lyophilizer Labconco  Freezone 7740020 Liposome preparation
Lyophilizer tubes Labconco  7540200 Liposome preparation
Chromatography Columns Santa Cruz sc-205558 Liposome preparation
1 M Tris pH 8.0 Ambion  AM9856 Liposome preparation
5 M NaCl Ambion  AM9759 Liposome preparation
Octyl-β-D-glucopyranoside Sigma-Aldrich  O1008 Liposome preparation
Dialysis tubing Spectrum Labs  132676 Liposome preparation
96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) Corning 3896 antibody density determination
Non-functionalized silica beads Bangs Laboratories  SS06N antibody density determination
FACS tubes Fisher Scientific  14-959-2A  antibody density determination
QuantumTM MESF beads Bangs Laboratories Variable antibody density determination
Casein  Sigma-Aldrich  C0875 Lipid bilayer preparation
HEPES buffered saline + 1% HSA Homemade Lipid bilayer preparation
Streptavidin  Life technologies  434301 Lipid bilayer preparation
Fluorescently-labeled biotinylated protein  Homemade Lipid bilayer preparation
ibidi Sticky-Slide VI 0.4 ibidi  80608 Lipid bilayer preparation
25x75 mm glass coverslip ibidi  10812 Lipid bilayer preparation
Hydrogen peroxide (30%) Fisher Scientic  BP2633 Lipid bilayer preparation
Sulfuric acid Sigma-Aldrich  258105 Lipid bilayer preparation
D-Biotin Invitrogen  B20656 Lipid bilayer preparation
Lens paper VWR  54826-001 For imaging
Type F Immersion Oil Leica  11 513 859 For imaging
A Leica TCS STED microscope Leica For imaging

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 96 प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं प्रतिरक्षाविज्ञानी अन्तर्ग्रथन इमेजिंग STED समर्थित लिपिड bilayer सुपर संकल्प
एक गिलास समर्थित प्लानर लिपिड bilayer पर प्राकृतिक हत्यारा सेल रोग प्रतिरक्षण अन्तर्ग्रथन की सुपर संकल्प इमेजिंग
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Zheng, P., Bertolet, G., Chen, Y.,… More

Zheng, P., Bertolet, G., Chen, Y., Huang, S., Liu, D. Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer. J. Vis. Exp. (96), e52502, doi:10.3791/52502 (2015).

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