Introduction
Den immunologiske synapse (IS) ligger på et kritisk knutepunkt for celle-aktivering og funksjon 1. Det er den primære mediet som antigen presentasjon og cellemediert immunitet blir utført. De tidligste mikroskopiske studier av synapse formasjon utnyttet en celle-celle konjugat system 2. Den viktigste begrensning med denne tilnærmingen er at de fleste av konjugatene vil sees 'i profil ", som det var, og dermed begrense observatørens riss av den synaptiske strukturen selv. I 1999 Dustin laboratoriet løses denne begrensning ved anvendelse av glass-støttet lipidbilag (SLB) teknikken 3, som hadde vært Hydro tidligere av McConnel laboratorie 4,5. Denne tilnærmingen kastes av antigen-presenterende celler (APC) i favør av en glass-støttet lipid plane overflate, inn i hvilket proteinene kan bli festet og bevege seg fritt i to dimensjoner. Ved hjelp av denne metoden, Dustin og kolleger var i stand til å kikke rett opp i than Synapse med høyoppløselig fluorescens mikroskopi, og for første gang får en "face-to-face" se på strukturen i ER.
Med bruk av SLB-systemet, har detaljer som IS kan visualiseres vært begrenset bare av begrensningene i nåværende bildeteknikker 6-8. Ved hjelp av standard belysningsteknikker, den minste oppløsning (dvs. minsteavstand mellom to distinkte objekter, karakterisert ved at de kan skilles) har vært <200 nm på grunn av Rayleigh-kriterium 9. Denne begrensning hindrer avbildning av meget fine, molekylær skala strukturer som utgjør synapse, og til utvikling av superoppløsningsavbildningsteknikker 10-12, ble visualiseringen av disse strukturene begrenset til avbildning av fikserte celler ved å bruke elektronmikroskopi.
Med den siste ankomsten av en rekke superoppløsningsteknikker, slik som SIM-kort (strukturert belysning mikros), PALM (photoactivated lokalisering mikroskopi), STORM (stokastiske optisk rekonstruksjon mikroskopi), og STED 10-12, etterforskere er nå i stand til å studere disse synaptiske strukturer i enestående detalj, noe som igjen har gitt en stadig mer avklart forståelse av IS. Fordelene med STED mikroskopi har blitt beskrevet før 13. Her beskriver vi super-oppløsning bildebehandling med STED mikros utstyrt med den nyutviklede 660 nm uttømming laser. Sammenlignet med den konvensjonelle 592 nm uttømming laser, gjør det mulig for 660 nm laser for et bredere utvalg av fluorescerende fargestoffer (se http://nanobiophotonics.mpibpc.mpg.de/old/dyes/), spesielt disse røde fluoroforer.
Andre publikasjoner har beskrevet STED avbildning av NK celle synapser på antistoffbelagte glass 13,14. Her er SLB system kombinert med super-oppløsning STED mikroskopi for å studere NK celle synapse. Denne teknikken har den fordel i antistoff-belagte objektglass ved å være en fluid mosaikken, i hvilket den innebygde overflateproteiner kan bevege seg fritt i en flat to-dimensjonal overflate (xy-planet). Dette etterligner flere trofast den organiske og mobile overflaten av en målcelle, og følgelig bedre sammenfatter dannelse av et fysiologisk relevant immun synapse.
Målet med denne protokollen er å gi sluttbrukeren med en detaljert beskrivelse av hvordan du bilde den immunologiske synapse av NK-celler ved å kombinere SLB system og super-oppløsning STED mikroskopi. Det vil gi sluttbrukeren med de nødvendige skritt for å: forberede liposomer, konstruere protein-embedded bilagene, bestemme protein tetthet på lipiddobbeltlag, og skaffe seg super-oppløsning ved hjelp STED mikroskopi. Disse teknikkene er ikke begrenset til feltet av immunologi, og kan grovt utnyttet på tvers av en rekke disipliner.
Protocol
1. Fremstilling av liposomer
- Beregne mengden av kloroform-suspendert stamoppløsninger av 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-fosfokolin (DOPC) og 1,2-dioleoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (Biotin-PE) å gjøre utvannede aksjer på ønsket sluttkonsentrasjon. For å gjøre sluttkonsentrasjoner på 400 mikrometer DOPC og 80 mikrometer Biotin-PE fosfolipider ved 10 ml hver, start ved å plassere 629 pl 10 mg / ml DOPC og 88 mL 10 mg / ml Biotin-PE i separate glass kromatografi rør.
MERK: det er viktig å rense glass Hamilton sprøyter og glassrørene ved kromatografiske rensing løsning (1 liter 95% etanol og 120 ml vann inneholdende 60 g kaliumhydroksyd, KOH), ved overføring av kloroform-suspendert stamløsning av DOPC og Biotin-PE. - Tørk kloroform med en strøm av argon i den kjemiske hette. Tett kromatografi tube med parafilm.
- Utsette de nylig tørkede liposomene til et høyt vakuum i en lyophilizer O / N for å fjerne eventuelle gjenværende kloroform. For samme dag ferdigstillelse, tørr for 60-90 min.
- Mens lyofiliseringsanordning går, forberede noen fortynningsbuffer. For denne protokollen, forberede 25 ml består av 25 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; og 2% (beregnet på vekt) n-oktyl-β-D-glukopyranosid (OG) vaskemiddel. Bland de første to bestanddeler sammen først, og deretter fortrenge oksygenet med argon før tilsetning av det tørre pulver OG. Etter forberedelse, filtrere OG løsning med 0,2 mikron celluloseacetatmembran, og oppbevares ved 4 ° C.
- I tillegg fremstille to skrue øverste flasker med 1 liter Tris-saltbuffer ved de samme konsentrasjoner, men uten OG. Plasser en destillert vann-renset magnetisk rørestav i bunnen av hver. Forbered ytterligere 6 liter av Tris-saltvannsbuffer. Fjerne oksygen fra alle flasker med argon og plassere dem ved 4 ° C i tillegg.
- Etter lyofilisering oppløses det tørkede lipider i Tris-saltløsning OG-buffer for å lage en 4 mM løsning av hver. Etter eksempelvolumer, tilsett 2 ml til DOPC tube og 0,2 ml til Biotin-PE rør.
- Bland sammen de biotin-PE lipidene med DOPC lipider. Dette forbedrer den bevegeligheten i SLB, som koplet biotin kan nedsette fluiditeten av fosfathode-grupper. For å lage en endelig konsentrasjon på 80 uM Biotin-PE, bland 0,2 ml 4 mM biotin-PE og 1 ml 4 mM DOPC. Deretter legger 8,8 ml av Tris-saltvann OG-buffer.
- For en sluttkonsentrasjon på 400 uM DOPC, rett og slett å blande 1 ml 4 mM DOPC med 9 ml Tris-saltoppløsning OG.
- Fyll sonicator med isvann. Sett glassrøret med den fortynnede fosfolipid i midten av sonikator ved hjelp av et verktøy klemme. Sonikere fortynnet fosfolipid i 10 minutter inntil løsningen blir klar.
MERK: Legg is inn i sonikator vannbad for å holde temperaturen lav siden sonikering vil generere varme. - Fyll rørene med argon for å fortrenge oksygen i luften over væsken, og forsegle dem med parafilm. 2. Dialyse av liposomer
- Skjær to seksjoner av tørr dialyserør (molekylvekt cut-off: 12-14,000, diameter: 6,4 mm) av passende lengde (i dette eksempel 40 cm), en for hver fosfolipid fortynning fra rullen.
- Rehydrere Rørseksjonene ved å tillate dem å suge i en 200 ml destillert vann i et begerglass for 2 min.
- Mikrobølgeovn dette i 5 min ved en høy innstilling, eller i det minste inntil vannet kommer til å koke.
- Knytte en knute ved den ene ende av hvert rør og skylle ut det indre med noen få ml Tris-saltløsning-OG-buffer. Deretter ble omhyggelig presse ut så mye av denne vaskebuffer som mulig for å minimalisere mengden av gjenværende buffer inne.
- I en laminær hette, legger de fortynnede fosfolipider i hvert rør og klemme de åpne endene med en liten dialyserør nedleggelse, slik som å utelukke all luft. Komplett luft utelukkelse vil kreve ofring av et lite volum av prøven ved klemming under &# 8220; vannlinjen ".
- Fordype prøvene i de forberedt tidligere flasker Tris-saltvann buffer uten OG. Fortrenger oksygen i flasken med argon før re-forsegling og sted å røre O / N 4 °.
- Overføre røret til en ny flaske med Tris-saltvannsbuffer uten OG hver 12 time i minst 3 ganger.
- Kort før fjerning av det dialyserte lipider, forberede et antall små rør i å alikvot lipidene ved å fylle hver med argon for å fortrenge oksygenet.
- Etter 36 timer, ta dialyse flasker inn i laminær hette og fjerne dialyse rør fra flaskene. Ha en benk bleie eller beger på hånden for å samle den våte avrenning.
- Skjær dialyseslangen over klippet, deretter fjerne klippet og nøye overføre dialyserte lipid løsning via pipette inn en ml porsjoner i pre-forberedt rør fylt med argon gass på is.
- Delmengde den vandige liposomoppløsningen, bruker argonstrøm å fortrenge oksygen igjen jegn hvert rør.
- Oppbevar liposomene ved 4 ° C. Må ikke fryses.
- Tilbered en fortynningsserie av biotinylert, fluorescens-merket antistoff, 50 ul i volum for hver fortynning, ved de følgende konsentrasjoner: 0 nM (blank), 10 nM, 50 nM, 100 nM og 500 nM. (Heretter referert til som "prøveserie").
- Tilsett 1 mL av silikaperler inn i 6 brønner i en 96-brønn v-bunn plate. Pass på å riste perlene godt før pipettering, som de pleier å bosette.
MERK: Hvis å ha bestilt tørre perler snarere enn suspendert, følger produsentens instruksjoner for å fortynne. - Til disse perlene, tilsett 2 mL av blandet DOPC: Biotinyl fosfolipider i 1: 1-forhold. Gjør dette for hver brønn.
- Puls platen på en vortexer på middels styrke 3 ganger i 10 sek hver for å oppmuntre samhandling med perler og fosfolipider.
- Legg 150 mL av 5% casein til hver brønn. Bland godt ved å pipettere opp og ned tre ganger.
- La platen inkuberes i kaseinløsning i 10 minutter, og deretter vaske det ut. Å vaske, fylle hver brønn til et totalvolum på 250 ul med HEPES bufret saltvann (HBS) med 1% humant serumalbumin (HSA). Sentrifuger ved 1000 x g i 2 min. Pipette ut og kast de 200 mL av supernatant, og gjenta to ganger for totalt tre vaskesykluser.
- Tilsett 50 pl av streptavidin ved en 333 ng / ml konsentrasjon. Puls platen igjen 3x 10 sek, og la det sitte på en shaker i 15 min. Vask 3x som i trinn 6 for å fjerne ubundet streptavidin.
- Tilsett 50 pl av fluorescensmerkede biotinylert antistoff fra den tidligere fremstilte fortynningsserie (se trinn 3.1) til hver brønn, og erstatte platen på ristemaskin i 20-30 min. Vask 3 x så i trinn 6 for å fjerne ubundet antistoff.
- Etter den siste vask, resuspendere kulene i 100 ul HBS / 1% HSA, og deretter overføre til en FACS rør. Gjenta dette to ganger tilsikre en effektiv fjerning av alle perlene fra brønnen, for totalt 300 ul, og gjøre dette for hver brønn.
- Bringe de resulterende rørene til strømningscytometer. Det er tid til å lese dem.
- 1 dråpe av flasken som er merket "B" i fluorescensintensitet kalibrering (FIC) perlesett (heretter referert til som "standard series") til en FACS-rør, og fortynn med 300 ul HBS / 1% HSA.
- Les dette røret, men ikke registrere data ennå. For nå, bare sørge for at de blanke perler er riktig nullstilt. Gjør et histogram som viser fluorescens av perlene målt i riktig kanal, deretter skifte spenningen til eksitasjon laser ned til toppen er helt til venstre i histogrammet.
- Fjern røret og tilsett en dråpe av hvert av de andre fire rør i serien (merket 1 til 4) til det samme røret. Nå plasserer røret i maskinen igjen, og ta den resulterende data, som skal vises som 5 forskjellige topper. Lese hvert enkelt rør fra prøveserien.
- Ved hjelp av FACS-analyse-programvare, tegne en port som strekker seg over hele bredden av hver topp i serie histogrammet ved halv-maksimal punkt. Det er en gate for hver topp. Gjør det samme for hver prøve. Legg merke til MFI (gjennomsnittlig fluorescens intensitet) for hver gate.
- Ved hjelp av en regnearkprogram innspill de målte MFI verdier på riktig sted. Også legge inn MESF (Molekyler ekvivalenter Løselig fluorokrom) verdier (gjennomsnittlig antall fluorescerende molekyler belegg hver perle) for hver flaske i standardserien. Denne informasjonen kan finnes ved å følge instruksjonene på plast jar rørene kom inn.
- Bruk regnearket vil plotte MFI mot MESF verdier, og skaper en lineær sammenheng mellom antall fluoroforene og den målte intensiteten.
- Bruke modulen av 'proteiner og etikettene i mikro-volum-spektrofotometer for å bestemme forholdet mellom farvestoff til protein i det merkede antistoff.
- Input merkingseffektivitet av prøveprotein, den gjennomsnittlige diameteren til kuler belagt med lipider, og MFI-verdien for hver oppføring. Den arket vil automatisk bruke formelen fra linjegraf som genereres i trinn 3,16 til å beregne MESF verdier for hvert protein fortynning og poding tetthet av prøven protein ved hver konsentrasjon.
- Alikvote 15 ml perifert blod eller buffy coat inn i en 50 ml konisk tube. Fortynn denne blod med PBS inneholdende 1% FBS i forholdet 1: 1.
- Legg 13 ml Ficoll svakt ned mot bunnen av røret med en 10 ml serologisk pipette.
- Sentrifuger dette røret i 20 min ved 1200 xg med gasspedalen og bruddet av eller på sitt laveste innstillinger.
- Etter sentrifugering ved å bruke en serologisk pipette for å samle opp flytende uklar, hvit midtre lag av perifere mononukleære blodceller (PBMC), wjør skal sitte, og skjæringspunktet mellom et klart gult øvre lag og en mer uklar svakt farget nedre lag, som begge sitter over en nederste lag av røde blodceller (RBC). Merk Ikke for å samle noen RBC i å samle PBMC.
- Plasser de oppsamlede PBMC i et nytt 50 ml konisk rør og fortynn til kapasitet med PBS inneholdende 1% FBS. Sentrifuger på nytt, denne gang med bremsepedalen og på maksimum, i 5 min ved 300 x g.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 10 ml PBS inneholdende 1% FBS.
- Telle cellene mens sentrifuge enda en gang på samme innstillinger som i trinn 4.6.
- Kast supernatanten igjen og resuspender cellene i R10-medium ved en tetthet på 10 millioner celler / mL.
- Ta 30 millioner celler i en 5 ml polystyren rør, og isolere NK-celler ved hjelp av en magnetisk separasjon kit, etter produsentens anvisninger. Etter isolering, telle cellene en mer og resuspender med en tetthet på 500,000 celler / ml i R10 komplett medium (88% RPMI, 10% FBS, 1% HEPES, 1% natriumpyruvat) supplert med IL-2 (100 U / ml). Kultur på 37 ° i en CO 2 inkubator, og erstatte medium 2-3 ganger ukentlig.
- Forbered 100 ml piraja løsning ved å blande 30% hydrogenperoksid med svovelsyre i et forhold på 1: 3 i et begerglass.
MERK: Du må alltid utføre arbeid med skadelige stoffer som svovelsyre i en ordentlig utpekt avtrekksskap. - Inn i denne løsningen, fordype to rektangulære # 1.5 Dekk i piraja løsning for 20-30 min.
MERK: Det er viktig å rengjøre Dekk av piraja løsning. - Mens glassene blir rengjort, kan en på forhånd fremstilt rør av 400 pm DOPC lipider og en slange av tidligere fremstilt 80 pM Biotin-PE lipidene. Transportere dem på isen til argon tanken.
- Fortrenge oksygen i et nytt mikrosentrifugerør med argonderetter legge sammen DOPC og Biotin-PE ved et 1: 1 forhold. Spesifikke volum vil variere basert på eksperimentelle behov, men bør være på minimum 2 pl hver. Fortrenge oksygen i blandingen røret en gang til med argon-gass, og de enkelte reagensrørene også, før retur sistnevnte til kjøleskapet.
- Etter at de er ferdig med rengjøringen, skyll grundig glassene med destillert vann. Still Dekk ut til luft tørke i noen minutter.
- Uttak 1,5 ul av liposom-blanding som ble fremstilt i trinn 5.4 og delmengde det i en eneste dråpe til én av kjørefelt kamre av kammer lysbilde. Bruken av to dråper per kjørefelt er typisk, men ikke nødvendig.
- Raskt og effektivt plassere den tørre dekkglass over dråper. Sørg for at dråpene er tilstrekkelig avstand slik at de ikke fusjonere når dekkglass er plassert. Videre sørge for at dråpene forbli sirkulær og veldefinert, uten å berøre kantene på kammerveggene. Trykk godt nedi mellom og rundt hvert kjørefelt for å sikre en vanntett forsegling mellom dekkglass og lysbilde.
- Markerer posisjoner av dråpene ved hjelp av en tusj
- Passere 100 ul av en vandig 5% kasein gjennom kammeret for å blokkere bilaget. Prøv å sørge for at det ikke er noen bobler i flyten kammeret.
- Injisere 100 ul streptavidin ved en konsentrasjon på 333 ng / ml i hvert kjørefelt. Inkuber i 10-15 minutter ved RT. Deretter vaskes ved å kjøre 3 ml HBS / 1% HSA gjennom hver bane for å fjerne overskudd av streptavidin.
- Tilsett 100 ul biotinylert fluoresceinmerket anti-CD16 eksempel Alexa Fluor 568 på proteinkonsentrasjon tidligere bestemt å være mest effektive i avsnitt 3. Inkuber i mørket i 20-30 min. Vask igjen ved å kjøre 3 ml HBS / 1% HSA gjennom hvert kjørefelt.
- Strømnings 100 ul av D-biotin i en konsentrasjon 25 nM gjennom kammeret for å binde overskytende streptavidin og derved eliminere muligheten for ikke-spesifikk binding av streptavidin til cellene.
- Count NK-celler og resuspender i en konsentrasjon på 500.000 / ml i HBS / 1% HSA.
- Mens spinne ned cellene, vaskes D-biotin ut av kammeret med et annet 3 ml HBS / 1% HSA pr kjørefelt.
- Sjekk mobilitet av ligander på SLB av fluorescens gjenoppretting etter fotobleking (FRAP) på en total intern refleksjon fluorescens (TIRF) eller konfokalmikroskopi før du legger NK-celler.
- Når cellene er ferdig spinning og er blitt resuspendert i den ønskede konsentrasjon, tilsett 100 ul til hver bane.
- Plasser kammeret i et 37 ° 5% CO2 inkubator i 30-60 min.
- Etter denne inkubasjonsperiode fiksere cellene med 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 10-20 min. Vask ved å kjøre 3 ml PBS gjennom hvert kjørefelt for å fjerne paraformaldehydet.
- Tilsett 400 ul blokkeringsbuffer (5% normalt esel serum og 0,2% Tritron X-100 i PBS). Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
- Stain F-aktin og perforin ved annonsending 200 ul fortynnet fluorescens-merkede phalloidin (1 enhet / ml merket phalloidin) og fluorescens-merket anti-perforin mAb (500 ng / ml anti-perforin mAb). Inkuber ved RT i 1 time.
- Vask ved å kjøre 3 ml PBS. Kammeret er klar for avbilding.
- Slå på alle nødvendige maskinvaremoduler.
- Start opp bildeanalyse programvare. Aktiver både resonans skanning og STED moduler. Når du har gjort disse valgene, vent i ca 3-5 min for programvaren for å starte.
- Klikk på "Configuration" -fanen øverst på skjermen.
- Velg "Laser Config" og deretter slå på det hvite lyset og STED 592 nm lasere.
- Velg 100x objektiv, og justere eksitasjon laserstrålen med 592 nm uttømming laser.
- Velg "Laser Config" modul, slå av 592 uttømminglaser, og slå på 660 nm uttømming laser.
- Plasser lysbildet på scenen, over linsen. Bringe cellene bundet på den avgrensede bilags regionen i fokus ved bruk av hvitt lys lampe og okulars.
- Tilbake til "Kjøp" -kategorien, direkte til høyre for "Configuration" -kategorien.
- Klikk på "Bytt til Whitelight" -kategorien, og slå den modulen på og dra eksitasjon laserlinjen til riktig bølgelengde.
- Velg ønsket detektor fra listen over de som er tilgjengelige, og deretter sette registreringsområdet til å omfatte den aktuelle spekter av bølgelengder.
MERK: ALDRI sette registreringsområdet rett under eksitasjon bjelke. - Klikk på "Seqential" -knappen i venstre "Hent" verktøylinjen for å få opp Sequential Scanning dialog i bunnen av venstre verktøylinjen. Dette gjør det mulig for brukeren å legge til flere sekvenser, hvermed en annen bjelke eksitasjon for en annen farge. Klikk "Mellom Frames", og deretter sette eksiteringsfrekvensen, detektor, og deteksjonsområde for hver ekstra farge som i trinn 6,9 og 6,10.
- Når alle innstillingene er optimalisert, trykk "Start" for å starte anskaffelsesprosessen.
- Påfør gratis deconvolution programvare (Huygens) med en innstilling designet for STED dekonvolvering, som tidligere beskrevet 13.
3. Bestemmelse av antistoff tetthet på lipid bilaget
4. isolere og dyrking Menneskelig NK-celler
5. Montering av Glass-støttet Planar lipidbilag
6. Imaging av NK Synapse på lipidbilag hjelp STED
Representative Results
Figur 1 viser resultatet av antistoffet tettheten på det ytre lipid bilaget. Prinsippet er å bruke standard-perler for å gjøre den standardkurve for MESF versus MFI via flowcytometri (A). MFI av prøveserie ble omdannet til MESF ved hjelp av standardkurven. Antistoffet tetthet på lipid bilaget er lineært korrelert med antistoffkonsentrasjon (B). Figur 2 viser den trippel-farge STED bilde av NK synapse på glass-støtte plant lipidbilag. Anti-CD16-antistoff på lipid bilaget akkumuleres, utløser F-aktin-dannelse og polarisasjonen og gjennomtrengning av perforin via F-aktin mesh på det sentrale panel av immunologisk synapse i NK-celler. Ved hjelp av denne kombinert tilnærming, kan man rent observere microclusters av fluorescensmerkede anti-CD16 i SLB, som direkte speiler clustering av CD16 på NK-cellen. Sammenlignet med den konvensjonelle konfokalt bilde, strukturen av CD16 central klynge er lettere observert hos STED bildet på grunn av utarmet ambient fluorescens. Videre er den ultra av aktin cytoskjelettet sett med vesentlig forbedret oppløsning. I overensstemmelse med tidligere observasjoner 16,17, blir perforin-positive lytiske granulater sett plassert over regioner med lav F-aktin densitet i STED bilde, et viktig detalj som for det meste tapt i konfokalt bilde.
Figur 1. Tetthet av 3G8-antistoffet på lipid bilaget. (A) lineær korrelasjon mellom MESF og MFI for standard serier. (B), lineær korrelasjon mellom densitet og proteinkonsentrasjon for prøveproteiner fortynningsserie, som viser antallet fluoresceinmerkede protein monomerene pr arealenhet som en funksjon av økende konsentrasjon på lipid-belagt siLica perler.
Figur 2. STED avbildning av NK synapse på plane lipidbilag. Primær NK-celler ble stimulert i SLB inneholdende biotinylert fluoresceinmerket anti-CD16 (rød), fast, permeabilisert og deretter farget med phalloidin (blått), og anti-F-aktin (grønn). En enkelt celle ble først fotografert under normal konfokal innstillingen, og deretter STED innstilling. Konfokale og STED bildene ble deconvoluted hjelp Huygens programvare. Skala bar, en mikrometer. Klikk her for en større versjon av dette tallet.
Discussion
Nyheten av denne studien er at den kombinerer SLB teknikk med STED å studere NK celle synapser. Tidligere studier har avbildet lipidbilaget med TIRF å studere T celle synapse formasjon 8 og signalmolekyl trafficking på plasmamembranen 6. Andre har beskrevet STED avbildning av NK celle synapser hjelp antistoffbelagte glass 13,14. Hybridmetoden beskrevet her lenger bygger på dette arbeidet med CCD-NK-cellen synapse med forbedret klarhet gis av super-oppløsning bildebehandling på lipidbilag overflate, som bedre modeller den dynamiske overflaten av en APC.
Selv SLBs er kunstige membraner mangler av cytoskjelettet, lipid flåter og andre ligander som faktiske målceller eller APC besitter, kan denne teknikken rekapitulere viktige funksjoner som mobilitet og orientering av ligander. Dette gjør at SLB system for å tjene som en reduksjonistisk tilnærming i dissekere tHan bidrag fra hvert av reseptorer og ligander for dannelse av IS og dynamikken i ER. Den viktigste funksjonen i SLBs er at forskerne kan kombinere denne teknikken med høyoppløselige bilde tilnærminger, for eksempel konfokal og TIRF mikroskopi. Innføringen av STED mikros ytterligere øker denne fordelen, og gir enestående innsikt i IS forskning og dens kliniske applikasjoner.
En potensiell kritikk av dette systemet er at SLB ikke i tilstrekkelig grad å etterligne den komplekse overflaten av en APC, og dermed gi opphav til potensielt ikke-fysiologiske anatomiske trekk i de resulterende synapser. Mens det er sant at den begrensede repertoar av overflatemolekyler på SLB ikke fullt ut rekapitulere den heterogent befolket overflaten av en APC, kan denne grensen også være fordelaktig ved at det tillater forskere for å bestemme innvirkningen av individuelle reseptor og ligand interaksjoner på synapse dannelse .
Ther er flere viktige trinn i prosessen. Blant de mest kritiske er at oksydasjon av liposomene forebygges ved konstant ved hjelp av argon for å fortrenge oksygen i røret, og løsningen, for eksempel i trinn 1,10, 2,6 og 2,11. Oksidasjon av lipidene vil resultere i redusert lipid mobilitet, og dermed hindrer muligheten for overflateproteiner for å bevege seg fritt og delta i synaptisk strukturering. Likeledes er det også viktig å fjerne all kloroform i liposomet ved lyofilisering (trinn 1.2). Etter bestemmelse av proteintetthet i det ytre lipid bilaget, er det viktig først å dispergere silikonperler til en homogen suspensjon uten klynger. Om nødvendig, kan sonikering av perler anvendes. I montering av SLB, de tidlige trinnene (5,1 til 5,8), karakterisert ved at dekkglass er renset, dråpene er plassert, og dekkglass er festet er avgjørende. En feil i noen av disse kan nødvendiggjøre starter eksperimentet over (fra begynnelsen av § 5). Av denne grunn er detgod praksis å rengjøre flere Dekk enn vil være nødvendig for å spare tid i tilfelle et uhell.
Non-clustering er den hyppigste spørsmålet når du arbeider med dette systemet. Hvis, når visualisere cellene i det siste trinnet, unnlater man å finne noen fluorescerende synapser, er det noen få skritt som kan tas. En annen flekk for beslektede celleoverflate-reseptoren kan tilsettes til kammeret for å verifisere at cellen ikke har dannet en synapse med bilaget, mens celler kan feste seg ikke-spesifikt til glass dekkglass eller to-lags overflate, postsynaptisk-overflateproteiner involvert bør vises som atskilte klynger på planet for den celle dobbeltlag-grensesnitt, mens unengaged overflateproteiner bør fremstå som diffus farging rundt hele omkretsen av cellen. Dersom denne metoden svikter, bør man ta sine celler via strømningscytometri for å sikre at den bestemte markøren man håper å studere uttrykkes i tilstrekkelig mengde på celleoverflaten. Viss overflate proteins er kjent for å være nedregulert i løpet av lang sikt in vivo kultur.
Mens denne protokollinformasjon spesifikt hvordan å visualisere NK-celle synapse formasjon, kan SLB-systemet brukes til å studere synapse-dannelse i en hvilken som helst immunocytt tenkelig enkelt ved substitusjon av den primære ligand i trinn 5.11. Multippel-ligander kan også tilsettes samtidig. Man trenger heller ikke bruke en streptavidin-biotin system for å følge de overflateproteiner i bilaget. Nikkel-NTA: histidin interaksjoner er også levedyktig. Imidlertid, på grunn av den høye styrke og spesifisitet av streptavidin: biotin interaksjonen, foretrekker vårt laboratorium dette systemet. Man kan også variere konsentrasjonen av celler er lagt ut på bilaget fra den foreskrevne tettheten i trinn 5.13, så vel som varigheten av den etterfølgende inkubasjonsperioden for å observere synapser på ulike stadier av modnings. Dette kan også gjøres levende, selv om dette selvfølgelig utelukker muligheten for å visualisere intracellulær structures (med mindre de allerede er merket med en smeltet fluorescerende tag; vår lab bruker noen slike endrede cellelinjer). På grunn av høy grad av tilpasning mulig i denne protokollen, kan man bruke vanlig SLB teknikk, sammen med STED bildebehandling, for å løse et utrolig variert utvalg av spørsmålene i immunologi, cellebiologi, og biokjemi, inkludert grunnleggende lipid dynamikk 15, synapse formasjon 16, intracellulær signalisering 17, og tumorcellemetastase 18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC) 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine |
Avanti | 850375C | Liposome preparation |
| 18:1 Biotinyl Cap PE 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (sodium salt) |
Avanti | 870273C | Liposome preparation |
| Argon gas, compressed | Airgas | UN1006 | Liposome preparation |
| A lyophilizer | Labconco | Freezone 7740020 | Liposome preparation |
| Lyophilizer tubes | Labconco | 7540200 | Liposome preparation |
| Chromatography Columns | Santa Cruz | sc-205558 | Liposome preparation |
| 1 M Tris pH 8.0 | Ambion | AM9856 | Liposome preparation |
| 5 M NaCl | Ambion | AM9759 | Liposome preparation |
| Octyl-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | O1008 | Liposome preparation |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132676 | Liposome preparation |
| 96-well V-bottom polystyrene plate (untreated) | Corning | 3896 | antibody density determination |
| Non-functionalized silica beads | Bangs Laboratories | SS06N | antibody density determination |
| FACS tubes | Fisher Scientific | 14-959-2A | antibody density determination |
| QuantumTM MESF beads | Bangs Laboratories | Variable | antibody density determination |
| Casein | Sigma-Aldrich | C0875 | Lipid bilayer preparation |
| HEPES buffered saline + 1% HSA | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| Streptavidin | Life technologies | 434301 | Lipid bilayer preparation |
| Fluorescently-labeled biotinylated protein | Homemade | Lipid bilayer preparation | |
| ibidi Sticky-Slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | Lipid bilayer preparation |
| 25x75 mm glass coverslip | ibidi | 10812 | Lipid bilayer preparation |
| Hydrogen peroxide (30%) | Fisher Scientic | BP2633 | Lipid bilayer preparation |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | Lipid bilayer preparation |
| D-Biotin | Invitrogen | B20656 | Lipid bilayer preparation |
| Lens paper | VWR | 54826-001 | For imaging |
| Type F Immersion Oil | Leica | 11 513 859 | For imaging |
| A Leica TCS STED microscope | Leica | For imaging |
References
- Dustin, M. L., Long, E. O.
- Monks, C. R., Freiberg, B. A. K. upferH., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395 (6697), 82-86 (1998).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Hafeman, D. G., von Tscharner, V., McConnell, H. M. Specific antibody-dependent interactions between macrophages and lipid haptens in planar lipid monolayers. Proc Natl Acad Sci USA. 78 (7), 4552-4556 (1981).
- Tscharner, V., McConnell, H. M. Physical properties of lipid monolayers on alkylated planar glass surfaces. Biophys J. 36 (2), 421-427 (1981).
- Crites, T. J., Chen, L., Varma, R. A TIRF microscopy technique for real-time, simultaneous imaging of the TCR and its associated signaling proteins. J. Vis. Exp. , (2012).
- Prins, K. C., Vasiliver-Shamis, G., Cammer, M., Depoil, D., Dustin, M. L., Hioe, C. E. Imaging of HIV-1 envelope-induced virological synapse and signaling on synthetic lipid bilayers. J. Vis. Exp. , (2012).
- Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. , (2008).
- Michalet, X., Weiss, S. Using photon statistics to boost microscopy resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (13), 4797-4798 (2006).
- Huang, B., Bates, M., Zhuang, X.
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat. Methods. 6 (1), 21-23 (2009).
- Hell, S. W.
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J. Vis. Exp. , (2014).
- Rak, G. D., Mace, E. M., Banerjee, P. P., Svitkina, T., Orange, J. S. Natural killer cell lytic granule secretion occurs through a pervasive actin network at the immune synapse. PLoS Biol. 9 (9), e1001151 (2011).
- Leutenegger, M., Ringemann, C., Lasser, T., Hell, S. W., Eggeling, C. Fluorescence correlation spectroscopy with a total internal reflection fluorescence STED microscope (TIRF-STED-FCS). Opt Express. 20 (5), 5243-5263 (2012).
- Liu, D., Bryceson, Y. T., Meckel, T., Vasiliver-Shamis, G., Dustin, M. L., Long, E. O. Integrin-dependent organization and bidirectional vesicular traffic at cytotoxic immune synapses. Immunity. 31 (1), 99-109 (2009).
- Liu, D., Peterson, M. E., Long, E. O. The adaptor protein Crk controls activation and inhibition of natural killer cells. Immunity. 36 (4), 600-611 (2012).
- Wu, J. C., et al. Antibody conjugated supported lipid bilayer for capturing and purification of viable tumor cells in blood for subsequent cell culture. Biomaterials. 34 (21), 5191-5199 (2013).
