Summary
본 프로토콜의 목적은 비만 세포의 분비 기능 게놈 분석을 허용하는 방법을 개발하는 것이었다. 프로토콜 관심과 실시간 유전자 cotrasfected 형광 리포터 유전자의 분리 정량 평가에 기초가 분비 과립의 형태 학적 분석.
Abstract
마스트 셀 (MC)를 형성 미리 새로 합성, 알레르기 염증 및 면역 매개 물질을 방출하여 생리 학적 및 병리학 적 기능을 수행하는 면역 체계의 분비 세포이다. MC들 '매개 알레르기 및 면역 반응에서 남중 여러 조직과 장기에 영향을 미친다. MC 매개체의 합성, 저장 및 방출은 매우 통제된다. 예비 형성된 매개체는 세포막과 융합 세포 외 유출에 의해 규제 대상 콘텐츠를 해제 세포질 분비 과립 (SG)에서 포장된다. 우리는 SG를 대상으로하고 내인성 SG 매개체와 함께 조절 된 방식으로 방출된다 리포터 유전자를 사용하여 원하는 유전자의 공동 발현에 기초하여 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 MC SG를 분석하고 트리거 세포 외 유출에 생합성에서 자신의 타임 라인을 모니터링 높은 해상도 네 차원 공 초점을 수 있습니다. 따라서, 간 유전자의 스크리닝이 프로토콜을 이용하여자신의 표현형 및 기능에 미치는 영향에 대한 추정치는 MC SG를의 생합성 및 세포 외 유출을 제어하는 분자 메커니즘을 해독과 관련된 규제를 식별 허용한다. 이에 따라, 건강과 질병에서의 MC 기능을 설명 세포 메커니즘으로 더 통찰력이 제공되어야한다.
Introduction
마스트 셀 (MC)은 가장 관절염, 천식, 호산 구성 식도염, 만성 피부염 및 관상 동맥 질환 및 3,5- 포함한 과민성 쇼크 1,2-뿐만 아니라 다른 병리 알레르기 및 염증성 반응에서 이들의 참여를 위해 공지되어있는 면역 세포 암 3,4. 또한, MC라면은 동종 이식 허용 5,6 유도 예를 들어, 박테리아와 기생충에 대한 숙주 방어와 면역 반응의 억제에 의해 모두, 선천성 및 후천성 면역에 중요한 역할을한다.
MC들은 + / CD117 + 능성 전구 세포 (7) CD34에서 개발, 골수에서 유래. 커밋 골수 MC 전구 세포는 혈류에 방출 및 결합 조직과 상피 표면 (8) 내에서 주로 지역화 주변 조직으로 마이그레이션 할 수 있습니다. 성숙 및 터미널 차별화는 결국 영향 O에서 달성주변 환경의 8,9 내에서 F 사이토 카인.
MC라면 누구의 만남 면역 글로불린 E (IgE) 항체 생성의 결과를 입력 알레르겐 (항원),은 (Ag)에 의해 활성화 될 수있다. 동일의 Ag에 다시 노출시 IgE 항체를 결합 셀의 가교 다음에 MC의 FcεRI 수용체, 그러한 IgE 항체의 결합, FcεRI 집계 및 세포 탈과립에 절정 신호 캐스케이드의 개시의 결과는 [10, 11에서 검토] . MC들도, 신경 펩티드 -5,12- 의해 독립적 IgE 항체의 활성 (13), 세균성 및 바이러스 성 항원 14,15 집합 적 분비 기본적인 면역 세포 및 사이토 카인이라고도 5,13,12,16 양전하 펩티드의 수를 독소 17. MC들도 상기 염증 반응을 증폭 자신 방출 매개체 많은 의해 활성화된다.
MC라면은 면역을 포함 분비 과립 (SG를)로 포장된다이러한 카이 메이즈와 트립 타제, 혈관 내피 성장 인자와 여러 사이토 카인과 케모카인 8,9 등의 히스타민과 (설치류) 세로토닌 같은 혈관 활성 아민, 프로테오글리칸, 단백질 분해 효소를 포함하여 규제 매개체. 이러한 매개체는 "갈 준비"하고 MC들이 적절한 자극에 의해 활성화되면, 이러한 매개체는 분 18, 19 초 만에 규제 세포 외 유출 (탈과립)에 의해 세포에서 방출된다. 이러한 초기 이벤트는 아라키돈 산 대사 물질, 여러 사이토 카인 및 케모카인 블랭킷을 포함한 생물학적 효능 물질의 큰 배열의 드 노보 합성 및 방출 이어진다. 새로 합성 된 제품의 출시는 독립적으로 SG 릴리스 발생합니다. 종합적으로, 이러한 매개체는 초기와 후기 단계 염증 및 알레르기 반응을 시작합니다. 따라서, MC 활성화 및 탈과립를 차지 메커니즘을 이해하는 것은 이론 및 임상 꼬마 도깨비의 모두는ortance.
유 전적으로 기본 및 배양의 MC를 조작에 어려움이 제대로 해결 남아 MC 탈과립의 기초가되는 메커니즘을 규명하는 시도를 방해하고있다. 관심의 유전자와 함께이 문제를 극복하기 위해, 우리는 공동 형질 점막 비만 세포주, 래트 호 염기 구성 백혈병 리포터 기재 분석법을 개발 하였다 (RBL) -2H3 (본원 RBL라고 함) 또는 골수 유래의 MC (BMMCs) 30 뉴로 펩타이드 Y (NPY)는 SG의 기자로, 단량체 RFP (MRFP)에 융합.
NPY는 이전에 다른 시스템에서 내생 SG 마커의 동작을 요점을 되풀이 나타났다. MRFP 형광 둔감 pH가 발현하기 때문에 또한 NPY는 MRFP-96- 웰 플레이트 및 형광 플레이트 판독기를 사용하여 산성 SG를 시각화 할뿐만 아니라 세포 외 유출의 정량적 평가를 허용한다. 우리는 NPY-MRFP가 RBL 세포와 BMMCs의 산성 SG를 전달됩니다 보여 주었다과 세포에서 분리 될 때내생 SG화물 (즉, β-소사 미나와 세로토닌) (30, 32)과 함께 규제 방식. 이 프로토콜은 자신의 표현형과 RBL 세포 32 SG 특성과 탈과립에 기능에 미치는 영향에 대한 관심의 선별 유전자를 할 수있는 고해상도 이미지 기반의 방법을 제공합니다. 즉,이 프로토콜은 실시간 MC SG를 추적 및 면적 또는 체적의 크기, 그들의 수, 조립의 동력학, 세포 골격을 따라 자신의 이동 및 다른 조건 하에서 세포막과의 궁극적 인 융합 정량화 할 수있다. 예를 들어, DNP - 특이 IgE 항체와 세포를 민감하고 다른 섭동에서 다가의 Ag (DNP 결합 혈청 알부민)와 세포를 트리거 (즉, 중량 또는 돌연변이 유전자의 발현, 또는 약리학 적 조작을 통해 관심의 유전자의 최저) 및 셀을 제어하는 비교.
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Protocol
RBL 세포 배양 미디어 1. 준비
- (이 ~ 1 % PEST한다) (이 10 % FBS한다) 소 태아 혈청 56 ㎖로 낮은 혈당 둘 베코의 수정 이글 배지 (DMEM)의 500 ml를 혼합 한 다음 페니실린 스트렙토 마이신의 5.5 ml를 추가합니다.
- 4 ° C에서 0.22 μm의 기공 크기 및 저장소와 500 ~ 1,000 ml의 병 - 최고 진공 필터를 사용하여 미디어를 필터링합니다.
RBL 세포의 배양 (2)
- 어느 플레이트 또는 플라스크에서 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 된 분위기에서 RBL 세포 성장. 10cm 플레이트에서 성장하고있다 RBL 세포는 10 ml의 매체로 보충 및 10 ~ 7 세포 / 플레이트의 합류 단층을 형성해야한다.
- 세포 층이 합류 해 가면, 낮은 밀도로 배양을 replate.
- 진공에 연결된 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 플레이트 / 플라스크로부터 배지를 제거한다.
- (37 데워진와 세포 단층을 씻어전체 단층을 (볼륨이 문화 판 / 플라스크의 크기에 따라 달라집니다 커버 ° C) 0.25 % 트립신 / EDTA; 10cm 판 2 ㎖). 이것은 세포를 분리한다.
- 또한, 인산염과 세포 단층은 식염수 (PBS)를 버퍼 씻어 PBS를 제거 및 / EDTA를 데워진 (37 ° C) 트립신을 추가합니다. 이 단계는 빠른 세포를 분리.
- 37 ° C (이하 10 분)에 인큐베이터에서 플레이트 / 플라스크를 놓습니다.
- 가 분리 된 경우 확인하기 위해 광학 현미경으로 세포를 검사합니다. 세포가 10 분 후 분리하지 않은 경우, 부드럽게 플레이트 / 플라스크에 누릅니다.
- 세포를 일시 중단 배양 플레이트 / 플라스크에 배지를 추가 (매질의 부피는 적어도 트립신 용액의 부피보다 더 큰 2 배이어야한다).
- 25 ° C에서 200g에서 3 분간 원심 분리하여 세포를 펠렛.
- 배지에서 세포를 재현 탁. 1시 10분에 의해 세포를 희석하고 새로운 배양 접시에 씨앗. 그들은 REAC 때까지 48 ~ 72 시간 동안 세포를 품어H 약 90 % 합류점.
- 최대 3 개월 (30 유로)에 대해 동일한 절차 (제 2.2.1-2.2.8)을 반복합니다.
형질 미디어 3. 준비.
- K-파이프의 pH 7, 칼슘 아세테이트의 1 mM의 솔루션과의 Mg 2+ 아세테이트 100 mM의 용액 100 mM의 솔루션을 준비합니다.
- DMEM 매체를 사용하는 20 mM로 K-파이프의 pH 7의 100 mM의 용액을 희석시키고, (2)의 최종 농도로 10 μM Mg를 2+ 아세테이트 100mM의 용액의 최종 농도 칼슘 아세테이트 1mM의 용액을 추가 mm이다.
- 칼륨 글루타민산의 무게를 128 mm의 최종 농도 솔루션에 추가, 잘 섞어 사용할 때까지 4 ° C에 보관하십시오. -20 ° C에서 남은 해결책 (예., K-파이프, 칼슘 아세테이트, 마그네슘 2+ 아세테이트)를 유지합니다.
RBL 세포의 형질 4.
- 플레이트를 사용 / 플라스크로부터 배지를 제거진공에 연결 멸균 파스퇴르 피펫.
- 전체 단층을 포함해야한다 데워진 (37 ° C) 트립신 / EDTA와 세포 단층을 씻어. 37 ° C (이하 10 분)에 인큐베이터에서 플레이트 / 플라스크를 놓습니다. 세포가 광학 현미경을 이용하여 분리 한 경우 확인합니다.
- 세포를 일시 중단 배양 플레이트 / 플라스크 배지 (추가 미디어의 볼륨은 트립신 용액의 부피보다 적어도 2 큰이어야한다).
- 혈구 계를 이용하여 세포 수를 계산.
- 25 ° C에서 200 XG에서 3 분 동안 원심 분리하여 1.5 × 10 7 세포 펠렛. 상층 액을 버리고 형질 매체의 280 μl를 추가합니다. 4mm의 큐벳에 반응 혼합물을 전송합니다.
- 추가 NPY-MRFP 플라스미드의 20 μg의 제어 빈 플라스미드 또는 시험 플라스미드 중 30 μg의. 반응 혼합물의 최종 부피는 300 μL이어야한다.
- 즉시 10 분 동안 얼음에 배치합니다. 잔여 물과 페이지에서 큐벳을 닦아9 밀리 300 V에서 전기에 roceed.
- 세포 외 유출의 측정을 위해 300 ㎕의 매체를 포함하는 24 잘 조직 배양 접시에 즉시 세포를 replate. 물론 각각에 대한 반응 믹스 (4 × 10 5 세포)의 8 μl를 추가합니다. 제어를위한 추가 우물에 4 × 10 5 비 형질 전환 세포를 추가합니다. 적어도 모든 형질에 대한 각각의 치료를 위해 우물을 중복이 수있는 충분한 우물을 준비합니다.
- 시간 경과 현미경, 80 ㎕의 배지를 함유하는 8 웰 챔버 붕규산 커브 글라스 시스템에서 즉시 세포 replate. 각 실에 대한 반응 믹스 (7.5 × 10 4 세포)의 1.5 μl를 추가합니다. (커버 글라스의 중심에있는 챔버 이미지로 쉽게 커버 글라스의 가장자리에 실을 사용하지 않도록하십시오).
참고 : 중요한 것은, 모든 셀이 트리거가 발생하지 가끔 시간 경과 현미경 인해 8 잘 챔버 borosi의 초점 손실과 드리프트에 폐지된다licate 커버 글라스 시스템. 따라서 각 형질에 대한 각각의 치료를 위해 최소 8 챔버를 준비합니다. - FcεRI 중재 활성화를위한 세포를 민감를 들어, 미디어 (적어도 2 시간 동안 IgE 항체와 세포를 배양)에 마우스 DNP 특정 단일 클론 IgE 항체의 1 ㎍ / ㎖를 추가합니다.
- 18-24 시간 후에 세포가 플라스미드를 발현하는지 확인하기 위해 형광 현미경을 사용한다. MRFP 형광 여기 및 방출 파장은 다음과 같습니다 λEx 584, λEm 607 nm의. NPY-MRFP는 SG를에 해당 기공 구조에 나타납니다. 제 2 관심 유전자 형광 태그에 융합되는 경우 동일한 셀 양쪽 플라스미드의 공동 발현을 확인하기 위하여 형광 현미경을 사용한다. 테스트 GFP 유전자가 융합 된 경우 예를 들어, GFP 형광의 여기 및 발광 파장은 : λEx 488 λEm 507 ㎚이다. GFP 태그 단백질은 NPY-MRFP을 표현 같은 세포에 나타납니다.
- 세포 외 유출 측정의 경우 t 진행O를 5 단계 및 시간 경과 현미경은 6 단계로 진행합니다.
5. NPY-MRFP 세포 외 유출을 측정
- 타이로드 버퍼의 준비 :
- 54 mM의 KCl을 20 mM의의 MgCl 2, 2.74 M 염화나트륨과 DDW 8 mm의의 NaH 2 PO 4 용액을 준비합니다. 잘 혼합하고 4 ℃에서 저장한다. 이 단계는 20 배 타이로드 버퍼의 준비입니다.
- 20 mM의 헤 페스 용액의 pH 7, 1.8 mM의 염화칼슘 2, 1 ㎎ / ㎖ BSA, 5.6 mM의 포도당과 DDW에서 타이로드 20 배의 1 ~ 20 희석을 준비하고 잘 섞는다. 이 단계는 1 배 타이로드 버퍼의 준비입니다.
- -20 ℃에서 1X 타이로드 및 저장 버퍼 나누어지는. 반복되는 동결 융해을 피하십시오.
- 24 웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 타이로드 버퍼로 3 회 세척한다. 웰을 제어하는 200㎕의 타이로드 완충액을 첨가함으로써 자극되지 않은 세포를 준비한다.
- / 웰의 20 배의 10 μL 시약 [(예 1000 NG / ml의 DNP-BSA 또는 DNP 활성화 농축 준비-HSA은 (Ag), 200 μM 칼슘 이온 운반체 (예 : A23187), 20 μm의 칼슘 이온 운반체 및 1,000 nm의 12-O- 테트라 데카-13 아세테이트 (TPA)]의 조합. 시약은 DMSO에 저장되어있는 경우, 1 % DMSO를 함유하는 타이로드 완충액으로 20 배 농도로 희석 시약. 30 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 96 웰 플레이트에 잘 신중하게 각각의 상층 액을 제거 얼음에 배치하고 빛으로부터 피할 수 있습니다. (상층 액은 세포에서 방출 된 키메라 펩타이드 NPY-MRFP를 포함).
- 각 웰을 0.5 % 트리톤 X-100을 함유하는 200 ㎕의 타이로드 완충액을 첨가하고, 10 분 동안 37 ° C에서 배양한다. (이 단계는 세포에서 방출되지 NPY-MRFP의 나머지를 포함하는 세포 용 해물의 준비를위한 중요하다). 세포 용 해물을 수집하고 96 웰 플레이트에 전송, 얼음에 배치하고 빛으로부터 피할 수 있습니다.
- fluoresc를 사용하여 세포 상등액 및 세포 용 해물의 형광을 측정런스 플레이트 판독기, 590-이 20 nm 대역 여기 필터 및 635- 35 nm의 대역폭 방출 필터를 사용.
- 출시 NPY-MRFP의 비율을 계산한다
참고 : 형광 판독기 측정 임의의 형광 단위 (AFU). AFU 값은 기계 및 감도와 형질 감염 효율에 의존한다.- 빈 nontransfected RBL 세포의 형광도를 설정합니다. 총 형광 각 상층 액의 AFU (상층 액을 해당 해물 + AFU의 AFU)을 나누고 100을 곱합니다.
세포 외 유출의 6 시간 경과 현미경
- 8- 웰 챔버 붕규산 커브 글라스 시스템에서 형질 감염된 세포 / 챔버의 7.5 x 104을 시드. 18-24 시간 후, 챔버에서 배양 배지를 제거하고, 타이로드 완충액으로 3 회 세척
- 각 실에 타이로드 버퍼의 72 μl를 추가합니다. 10 배 농도로 타이로드 버퍼의 활성화 시약을 희석. <리> 가열 챔버 (37 ° C) 및 CO 2 컨트롤러 (4.8 %)과 40X 또는 63X 목적으로 장착 된 공 초점 형광 현미경을 사용합니다. 현미경 시스템 켜기 : 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저를. 가열 된 챔버 실험을 시작하기 전에 적당한 온도에 있는지 확인합니다.
- 가열 된 챔버 챔버를 놓고 챔버 정확하고 안정적으로 설치되어 있는지 확인하십시오.
- 관련 형광에 따라 형광 빛을 켜고 형질 감염된 세포를 시각화. 관심의 셀이 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 필드에 한 번 형광을 끕니다. 그것은이 필드가 2-3 형질 감염된 세포를 포함하는 것이 중요합니다. 형질 전환 된 세포를 잘 퍼져 있지만 서로 닿지 않도록해야합니다.
- 잡음 및 과포화뿐만 아니라 독성을 최소화하기 위해 (현미경)에 따라 레이저 전력을 조정하고, 이득을 설정하고, 신호 대 잡음비를 수정 오프셋. 에 빠른 스캔하거나DER 레이저 박람회 (평균 2)의 지속 기간을 최소화한다.
- 이 레이저 파워의 감소 가능 최대 핀홀 크기를 조정하고 장시간 집중 화상을 유지한다. 원하는 경우 Z 스택 이차원 공 촛점 광학 조각의 3 차원, 잡음비 최상의 신호를 제공하는 한 통풍 유닛 (AU)에 핀홀 크기를 조정하고 획득 연속 주사로 화상을 재구성하기 위해, 파라미터 세트 광학 조각 ≤0.7 μm의와 Z -axes.
- 15 ~ 30 초마다 수집 및 15 분에 총 취득의 기간 사이의 시간 간격을 설정하고 이미지를 획득 시작합니다. 취득 5 분 후에 시계열을 일시. 10 배 트리거의 8 μl를 추가하고 즉시 인수를 계속합니다.
- , 사진을 저장 디컨 볼 루션 소프트웨어를 사용하여 디컨 볼 루션을 수행하고 세 가지 차원 이미지와 Imaris 소프트웨어를 사용하여 동영상에 스택을 재구성.
- Imaris 소프트웨어 공 초점 형광 현미경에 의해 수득되었다 deconvoluted 시계열 화상으로부터 데이터를 가져. 이 소프트웨어는 40 개 이상의 현미경 파일을 읽습니다. 소프트웨어는 파일을 읽을 수없는 경우; TIF 파일 및 가져 오기로 파일을 변환합니다.
- 오픈 데이터 세트 프레스 편집의 끝 시점을 추가하려면 -> 새 데이터 세트를 시간 포인트를 추가하고 가져옵니다.
- 표면 마법사 옵션을 사용하여 MRFP 채널의 표면을 만듭니다. 기본 알고리즘을 선택합니다. NPY-MRFP의 채널을 선택합니다. 소음을 줄이기 위해 평활화 옵션을 표시한다. 작은 세부 사항은 0.05 μm의 지역 상세 수준을 감소의 손실을 방지합니다.
- 강도 임계 값을 설정합니다. 새로운 회색 화면이 표시됩니다. "설정"으로 이동하여 "중심점"을 "표면"에서 스타일을 전환합니다.
- 선택된 개체의 속성에서 통계 탭으로 이동하여 상세 탭과 특정 값 SUC을 선택형광 강도로서 H, 볼륨 등
- 데이터를 검토하고 값이 이미지와 호환되는지 확인합니다. 예를 들어, 두 개 이상의 인접하는 하나의 더 큰 과립은 과립으로서 측정 될 수있다. 평균 과립 크기를 정량화 과립의 실제 개수에 병합 된 과립의 크기를 나눈다.
- 엑셀 파일에 원하는 데이터 세트를 내보내고 데이터를 분석한다.
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Representative Results
때문에 MC들의 낮은 형질 전환 효율의 유전자 조작은 내생 SG를 매개체에 의해 측정 된 평균 분비의 판독에 영향을 떠나지 않을 것이다. 그럼에도 불구하고, 독점적 목적 유전자를 발현 세포 집단을 모니터링하는 리포터 유전자 NPY-MRFP 완전히 공동 발현과 같은 세포에 동시 형질 플라스미드, NPY-MRFP 모니터링 결과를 설정하여. 따라서, 종래의 방법에 비해이 분석의 장점은 선택적으로 유 전적으로 조작 된 세포 (도 1)를 모니터링 할 수있는 능력이다.
사실, 우리는 수용성 NSF [N-에틸 말레이 민감한 융합] 부착 단백질 수용체 (SNARE) 단백질과 랩 GTP 아제 가족의 44 회원을 포함하여 기공을 인신 매매를 조절하는 유전자를 선별 한이 분석을 사용하여. 우리는 SGsize, 수,화물 조성과 세포 외 유출 (23)을 조절하는 유전자를 확인했다.
W전자는 (30) 무선 접속 베어러 (RAB)를 식별하는 변경 (즉, 억제하거나 자극) 중 하나 인 Ag 또는 칼슘 이온 운반체의 조합 포르 에스테르 TPA (이온 / TPA) (23)에 의해 자극 된 RBL 세포에서 세포 외 유출을. 공 초점 이미징은 세포 또는 SG를 (30, 32)의 형태를 변경 극적인 표현형의 원인이 덫과 무선 접속 베어러 (RAB)를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이 단백질의 공 초점 이미징은 세포 또는 SG 형태 (30, 32)에 극적인 표현형을 발생 8 덫과 무선 접속 베어러 (RAB)를 한 것으로 밝혀졌습니다. 이 프로토콜을 이용하여, 우리는 각각의 SG를 추적하고 그 크기, 형광 강도, 그들의 운동과 세포 외 유출의 측정을 수행 할 수 있었다. 예를 들어, 우리는 SG (30)의 생합성을 조절 제로 Rab5를 식별. Rab5는 엔도 시토 시스와 엔도 좀의 융합 (24)의 마스터 레귤레이터로 확인되었습니다. 우리는 구조적으로 마이너스 (CN) GDP 고정 Rab5의 내생 적 표현 동종의 돌연변이 (Rab5A, Rab5B 및 Rab5C) 또는 전자의 공동 발현을 보여 주었다shRNA를을 대상으로 Rab5A / B / C의 XPRESSION은 숫자 30에 수반 증가와 함께 크게 SG를 '크기를 감소. 반대로, GTP 고정, 구성 적 활동 (CA) Rab5A 돌연변이의 표현 (Rab5A Q79L는 여기에 "CA의 Rab5A") 초기 엔도 좀의 동형 융합 (EES) (24)를 촉진하는 것으로 알려져, 거인의 형성 결과 우리가 그들의 분비화물 NPY-MRFP의 내용과 세로토닌 및 규제 패션 30 exocytose 그들의 용량에 따라 SG를 식별 Rab5A 장식 소포.
그림 2는 NPY-MRFP 함유 SG를의 형태 계측 학적 분석을 보여줍니다. CA의 Rab5A 발현 세포에서의 평균의 SGS 볼륨> 제어 GFP 발현 자신의 번호가 20 배 감소하면서 세포 (도에서 에스 지에스의 평균 부피보다 큰 20 배 높다 44 μm의 (3)의 값에 도달 2A). 반비례 관계수와 SG를 (그림 2A)의 크기 사이의 SG를의 Rab5 매개 확대가 동형 융합을 포함하는 것이 좋습니다. CA의 Rab5A에 의해 형성 SG를을 포함하는 거대한 NPY-MRFP 그렇지 않으면 할 수 없습니다 세부 SG를 모니터링 할 수있는 고해상도에서 살아있는 세포의 공 초점 현미경 이미징을 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 가능성이 가장 높은, 거대한 SG를 사이에 흩어져있는 작은 구조와 함께 SG를 융합 엔도 좀 (그림 2B)에 대응에 Rab5A을 발견했습니다. 또한, 우리는 보여 주었다 새로 형성된 SG를 가진 Rab5A의 선택과 과도 협회는 새로 생성 된 입자가 다른 SG를 (30)와 융합 할 수있는 능력을 보유하고있는 융해 장치와 호환되는지 제안 새로 형성된 SG를 가진 Rab5가 일시적으로 바람직 동료 그.
그림 3은 CA의 발현에 의해 형성되었다 MC 거대한 SG를 대표 시간 경과 이미지를 보여줍니다Rab5A 자극 후 하나의 SG의 해상도에서 세포 외 유출의 반응 속도. MC의 엑소 시토 시스하는 동안, SGS는쪽으로 이동하고 세포막과 융합. 결과적으로 분비화물이 세포 외 공간에 세포로부터 방출된다. 이 실험 시스템에서, NPY-MRFP는 세포에서 분리하고, 세포 상청액에서 발견. 세포 상청액 NPY-MRFP의 형광은 형광 판독기로 측정 할 수있다. MRFP는 NPY-상청액 희석되기 때문에, 그것의 형광 신호를 검출 또는 형광 현미경에 의해 시각화 될 수 없다. NPY-MRFP 형광 강도와 NPY-MRFP 함유 SG를 자신의 disappearance.Therefore, 자극 세포와 NPY의 측정의 라이브 세포 이미징의 수축에 신속하고 극적인 감소에 세포 외 유출 결과 중 과립에서 NPY-MRFP의 릴리스 -mRFP 형광 강도 또는 NPY-MRFP 포함 SG 크기의 세포 외 유출의 반응 속도의 정확한 평가를 제공개별 과립. 그림 3b는 칼슘 이온 운반체와 세포를 자극 한 후 SG를의 형광 강도를 보여줍니다. 세포막과 융합되지 않은 단일 SG의 형광 강도가 일정하게 유지하면서 SGS는, 상이한 시간 포인트 (즉, 2, 3, 6 및 11 분 후 자극)에서 세포 외 유출을 겪는다.
그림 1 :. 프로토콜의 주요 단계의 그림 RBL 세포는 NPY-MRFP 및 관심 분야와 제어 플라스미드 대응의 두 번째 유전자 동시 형질 감염된 즉시 된 커버, 8 잘 챔버 붕규산 커버 글라스 시스템 또는 96 웰 플레이트에 접종한다. 다음 날, 휴식의 NPY-MRFP이 함유 SG를의 이미지 트리거 세포를 공 초점 현미경 (A)에 인수된다. restin의 또한, 세포 외 유출g는 96 웰 플레이트 리더 형광 (B)에-MRFP NPY의 방출을 측정하여 정량을 트리거 cellsis.
그림 2 :. SG를 '크기의 정량화 RBL 세포는 NPY-MRFP 및 GFP 중 하나 또는 GFP-CA의 Rab5A와 동시 형질 감염된 8 웰 챔버 붕규산 커버 글라스 시스템에 접종 하였다. 24 시간 후, 8 웰 챔버는 레이저 공 초점 현미경에 장착 된 가열 실 (37 ° C)에 넣었다. 광학 슬라이스 0.7 μm의 연속 된 이미지의 Z 스택 이미지는 63X 오일 / 1.4 개구 목표를 사용하여 촬영 하였다. 이미지는 deconvoluted하고 세 가지 차원 이미지는 Imaris 소프트웨어에 의해 건설되었다. 에스 지에스 및 숫자의 부피 Imaris 소프트웨어 (A)를 사용하여 계산 하였다. NPY-MRFP 함유 granu의 일부레 Rab5A (화살촉) 내에 포함 된 것으로 보인다. 다른 사람은 벌거 벗은 또는 Rab5A (화살표)와 브리지입니다. 스케일 바 = 5 μm의 (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. activatedRBL 세포의 단일 SG의 해상도의 범위와 세포 외 유출의 반응 속도를 측정 RBL 세포는 NPY-MRFP 및 GFP-CA의 Rab5A와 시드 IN8 웰 챔버 붕규산 커버 글라스 시스템과 동시 형질 감염된되었다. 24 시간 후 웰 IN8 챔버는 가열 실 (37 ° C)를 갖춘 공 초점 레이저 현미경에 배치하고, 세포를 10 μM의 Ca2 + 이온 운반체로 변했을. 이미지는 63X 오일 / 1.4 개구 목표를 사용하여 매 15 초를 인수했다. 이미지deconvoluted 다음 Imaris 소프트웨어에 의해 처리했다. 스케일 바 = 5 μm의 (A). NPY MRFP - 함유 과립의 평균 형광 강도는 Imaris 소프트웨어에 의해 결정하고, 데이터는 시간 0 (외 Ca2 + 이온 운반체의 첨가 시간)에 따라 표준화 하였다. 화살표 SGcargo의 릴리스 wasnoted되는 시점 (B)를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 세포 외 유출에 대한 리포터 유전자를 사용하여 살아있는 세포에서의 에스 지에스의 시간 경과 3 차원 화상으로의 MCS 엑소 사이토 시스 및 네 개의 값 (x, y, z, t) 치수 정량화 정량화 결합한 혁신적인 전략을 설명한다. 이 기술은 일찍 성숙을 통해 골지체에서 자신의 출구, 세포 외 유출의 능력과 탈과립를 획득하는 등 시작하는 등 모니터링 SG를 같은 MC 기능에 미치는 영향에 대한 단백질의 가족의 검사를 할 수 있습니다. 함께 SG를의 형태 학적 및 운동 특성 분석과 세포 외 유출의 측정의 조합은 테스트 단백질이 MC 기능을 중재하는 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 따라서이 방법을 사용하여, 대상 유전자의 유전자 조작은 MC SG를 저장하고 그들의화물을 해제하는 새로운 분자 메커니즘을 공개 할 수 있습니다. 특히, NPY는 MCF-7 세포, 세포주 유래의 FR 다른 분비 세포에서 엑소 시토 시스에 대한 리포터로서 역할을 할 수톰 인간 유선 선암 (31),하는 chromaffin 세포 (34)와 췌장 β 세포 (35).
유전자 조작은 기능적인 네트워크를 연구에 대한 현재 사용할 수있는 가장 강력한 도구입니다. 삭제가 병렬 네트워크 간의 크로스 토크를 적용하거나 중복으로 인한 영향을 미치지 않을 것이다 다른 단백질과는 대조적으로 유전 조작은 삭제 시스템의 붕괴를 적용 할 각 네트워크에 필수적인 단백질의 식별을 허용한다. 그러나, MC들 중 낮은 형질 감염 효율, 단지 세포의 작은 분획은 "조작"테스트 DNA를 발현되어 내인성 매개 물질의 엑소 사이토 시스를 측정 할 때. 내인성 매개 물질의 엑소 사이토 시스를 따라서 측정 할 때, 전체 행 판독 형질 감염된 세포의 기여가 작은 것이다. 따라서, 이러한 접근 방법을 채택하려고하는 MC들에 규제 세포 외 유출과 관련된 복잡한 네트워크를 탐구하는 것이었다 하mpered. 이 기술은 낮은 형질 전환 효율의 장애물을 극복하고 표현, 최저 관심의 유전자의 돌연변이 유발을 통해 발생 MC SG를의 표현형 교대를 관찰 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다.
이 기술은 일시적 형질 트리플 기능을 사용하여 네트워크의 상호 작용과 계층 모드를 조사하는 확장 될 수있다. 결과는 특정 표현형을 구출 할 수있는 유전자를 결정하기 위해 분석 될 것이다; 더 극적인 표현형을 일으키거나 영향을주지 않습니다. 이러한 형질 조합에 기초하여, 세포 외 유출 네트워크는 구성 될 수있다. 예를 들어, 삼중 형질 전환을 이용하여, 우리는 Rab5 종속 융합 SG (25)의 공정에서 하류 중재자 SNARE 단백질 VAMP8을 확인할 수 있었다.
이 방법은 하나의 SG를의 해상도에 시각화 및 세포 외 유출의 정량화를 허용합니다. 실제로 우리는 SG를 표시 차동 응답이 STIM 것을 보여줄 수 있었다ULI. 다른 MC하지 않았거나 SG의 융합체의 차동 동역학 이유하면서 세포막과 융합 특정 SG를 남아 이유에 대한 이유를 판별한다. 이 실험 방법을 사용하여 미래 연구는 이러한 질문에 대답 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 예를 들어, 다른 올무 또는 개별 SG를에 무선 접속 베어러 (RAB)과 세포 외 유출 능력과의 상관 관계 및 단일 SG의 해상도에서 세포 외 유출의 반응 속도의 정량화는 세포 외 유출의 새로운 규제를 공개해야한다.
이 기술의 주요 제한은 단백질의 과발현은 세포의 기능이나 형태에 영향을 미칠 수 있기 때문에 유전자 조작이다. 따라서, 상보적인 방법으로 결과를 확인하는 것이 필수적이다. 예를 들어, 구조적 활성 돌연변이의 과발현은 세포 외 유출, 항시 네거티브 체의 효과를 저해하거나 유전자의 노크시뿐만 아니라 테스트되어야한다.
이 기술을 사용하여, 우리는 지문을 확인해MC의 세포 외 유출에 영향을 미치거나 SG 형태를 변경 MC 기능의 IED 새로운 규제. SGS 인증원 형태 계측 학적 특성과 함께 세포 외 유출 측정의 조합은 깊은 기능에 대한 통찰력과 시험 단백질의 작용 메커니즘을 제공합니다.
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Acknowledgments
우리는 NPY-MRFP의 cDNA의 선물 박사는 미국 Ashery 감사합니다. 우리는 박사 감사합니다. MJ 코프 론 (Kofron), L. 틀먼, M. Shaharbani 및 현미경에 귀중한 도움을 Y. Zilberstein 및 이미지 분석. 우리는 또한이 원고의 중요한 읽기 박사 조셉 오를리 감사합니다. 이 작품은 과학에 대한 이스라엘 아카데미가 설립 한 이스라엘 과학 재단의 연구비에 의해 지원되었다 (12분의 1,139 RS-E에.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
