Summary

التحقيق ماست الخلية الإفرازية حبيبات. من البناء الحيوي لالإيماس

Published: January 26, 2015
doi:

Summary

وكان الهدف من هذا البروتوكول إلى تطوير طريقة من شأنها أن تسمح التحليلات الجينومية الوظيفية لإفراز الخلايا البدينة. ويستند هذا البروتوكول على التقييم الكمي لإطلاق سراح من الجين مراسل الفلورسنت cotrasfected مع الجينات في المصالح في الوقت الحقيقي تحليلات التشكل حبيبة إفرازية ل.

Abstract

الخلايا البدينة (MC) هي الخلايا الإفرازية للجهاز المناعي التي تحقق وظائفها الفسيولوجية والمرضية عن طريق الإفراج عن وسطاء الحساسية، التهابات وimmunoregulatory قبل تشكيلها وتوليفها حديثا. وسطاء إم سي إس "تؤثر على الأنسجة والأعضاء متعددة بلغت ذروتها في استجابات حساسية والمناعة. وينظم درجة عالية من التوليف والتخزين والإفراج عن وسطاء MC. معبأة الوسطاء شكلت قبل في حبيبات إفرازية حشوية (SG) أن تلتحم مع غشاء البلازما والافراج عن محتواها بواسطة إيماس المنظم. نقدم بروتوكول، على أساس المشاركة في التعبير عن الجينات في المصالح مع الجين المراسل أن يتم استهداف لجان الدراسات وإصدارها بطريقة المنظم جنبا إلى جنب مع وسطاء SG الذاتية. بروتوكول يتيح عالية الدقة أربعة متحد البؤر الأبعاد يحلل من MC جان الدراسات ومراقبة الجدول الزمني الخاصة بهم من نشوء حيوي لإيماس تشغيلها. وهكذا، وذلك باستخدام هذا البروتوكول لفحص الجينات من بينمؤسسة لالمظهرية والوظيفية تأثيرها يسمح فك رموز الآليات الجزيئية التي تتحكم في نشوء حيوي وإيماس من MC جان الدراسات وتحديد الجهات الرقابية المعنية. وبالتالي، ينبغي أن تقدم مزيدا من الإيضاحات عن الآليات الخلوية التي تمثل وظيفة إم سي إس في الصحة والمرض.

Introduction

الخلايا البدينة (MC) هي خلايا المناعة التي اشتهر مشاركتهم في الحساسية والتهابات مثل التهاب المفاصل والربو والتهاب المريء بالحمضيات، التهاب الجلد المزمن وصدمة الحساسية 1،2 فضلا عن الأمراض الأخرى بما في ذلك مرض الشريان التاجي 3،5 و السرطان 3،4. وبالإضافة إلى ذلك، إم سي إس تلعب أدوارا هامة في المناعة الفطرية والتكيفية، سواء في الدفاع المضيف ضد البكتيريا والطفيليات وقمع الاستجابات المناعية، على سبيل المثال حمل المزروع التسامح 5،6.

المعلقون تنشأ من النخاع العظمي، وتطوير من CD34 + / CD117 + الخلايا الاصلية المحفزة 7. يتم الافراج نخاع العظام ملتزمة الأسلاف MC إلى مجرى الدم وتهاجر إلى الأنسجة الطرفية توطين في الغالب داخل الأنسجة الضامة والأسطح الظهارية 8. وحققت النضج والتمايز النهائي في نهاية المطاف تحت تأثير سو السيتوكينات داخل الوسط 8،9 المحيطة بها.

المعلقون يمكن تفعيلها من خلال مثيرة للحساسية (مستضد، حج)، الذي أدى إلى جيل من الغلوبولين المناعي E (IgE و) لقاء اكتب الأجسام المضادة. ربط هذا إيج لمستقبلات FcεRI مولودية، تليها عبر ربط الخلايا ملزمة الجلوبيولين على إعادة التعرض لنفس حج، والنتائج في FcεRI تجميع والشروع في سلسلة مما يشير إلى أن يبلغ ذروته في تحبب خلية [استعراضها في 10،11] . يتم تنشيط إم سي إس أيضا، بشكل مستقل عن فريق الخبراء الحكومي الدولي، من خلال نيوروببتيد 5،12، والسموم 13، بكتيريا ومولدات المضادات الفيروسية 14،15، وعدد من الببتيدات موجبة الشحنة يشار إليها مجتمعة ب secretagogues الأساسية، الخلايا المناعية والسيتوكينات 5،13،12،16 ، 17. يتم تنشيط المعلقون أيضا من قبل العديد من وسطاء لهم صدر الخاصة، الأمر الذي يزيد من تضخيم الاستجابة الالتهابية.

معبأة المعلقون مع حبيبات إفرازية (جان الدراسات) التي تحتوي على المناعةوسطاء التنظيمية، بما في ذلك الأمينات فعال في الأوعية، مثل الهستامين والسيروتونين (في القوارض)، البروتيوغليكان، البروتياز، مثل كيماز وتريبتاز، عامل نمو بطانة الأوعية الدموية والعديد من السيتوكينات و chemokines 8،9. هذه هي وسطاء "على استعداد للذهاب" وحالما يتم تفعيل المعلقون من قبل التحفيز المناسب، وأصدرت هذه سطاء من الخلايا عن طريق إيماس تنظيم (تحبب) في بضع ثوان إلى دقائق 18،19. ويتبع هذا الحدث الأولي من التوليف دي نوفو وإطلاق مجموعة كبيرة من المواد الفعالة بيولوجيا، بما في ذلك الأيض حمض الأراكيدونيك، السيتوكينات متعددة وكيموكينات 20،21،22. الافراج عن المنتجات تصنيعه حديثا يحدث بشكل مستقل عن إطلاق SG. بشكل جماعي، وهذه سطاء الشروع الردود في وقت مبكر والمرحلة المتأخرة التهابات والحساسية. ولذلك، فهم آليات المحاسبة لتفعيل MC وتحبب كلاهما عفريت النظري والسريريortance.

صعوبة التلاعب وراثيا إم سي إس الابتدائية ومثقف وأعاقت محاولات لتوضيح الآليات الكامنة MC تحبب، والتي ظلت حلها بشكل سيئ. للتغلب على هذه المشكلة وضعنا مقايسة على أساس مراسل بواسطة خط الخلية المخاطية الصاري transfecting المشترك، الفئران سرطان الدم مستقعد (RBL) -2H3 (المشار إليها هنا RBL) أو نخاع العظام المستمدة إم سي إس (BMMCs) 30 مع الجينات في المصالح و نيوروببتيد Y (NPY) تنصهر لRFP أحادى (mRFP)، كمراسلة SG.

تم NPY توضح مسبقا تلخيص سلوك علامات SG المحلية في النظم الأخرى. وعلاوة على ذلك، لأن mRFP مضان هو الرقم الهيدروجيني حساسة والتعبير عن NPY-mRFP يسمح التصور من لجان الدراسات الحمضية وكذلك التقييم الكمي للإيماس باستخدام لوحات 96-جيدا وقارئ لوحة مضان. لقد أظهرنا أن يتم تسليم NPY-mRFP لجان الدراسات الحمضية خلايا RBL وBMMCs ويتم تحريرها من الخلايابطريقة المنظم إلى جانب البضائع SG الذاتية (أي، β-هيكسوزامينيداز والسيروتونين) 30، 32. يوفر هذا البروتوكول منهجية قائمة على التصوير عالية الدقة التي تسمح الجينات فحص الفائدة لالمظهرية وتأثيرها على خصائص وظيفية SG وتحبب في خلايا RBL 32. على وجه التحديد، وهذا البروتوكول يسمح في الوقت الحقيقي تتبع MC جان الدراسات والكمي لمنطقتهم أو حجم وحدة التخزين، عددهم، حركية التجمع والتنقل على طول الهيكل الخلوي الخلية والانصهار في نهاية المطاف مع غشاء البلازما تحت ظروف مختلفة. على سبيل المثال، توعية الخلايا مع DNP محددة إيج والتسبب في الخلايا مع حج متعددي (DNP مترافق ألبومين المصل) تحت الاضطرابات المختلفة (أي ضربة قاضية للجينات من الفائدة، على التعبير عن الجينات WT أو متحولة، أو التلاعب الدوائية) و مقارنة للسيطرة على الخلايا.

Protocol

1. إعداد RBL خلية الثقافة وسائل الإعلام مزيج 500 مل من المتوسط ​​تعديل النسر انخفاض مستوى السكر في Dulbecco لفي (DMEM) مع 56 مل من مصل بقري جنيني (وهذا يجعل 10٪ FBS)، ثم قم بإضافة 5.5 مل من البنسلين ستربتومايسين (وهذا يجعل ~ 1٪ من الآفات…

Representative Results

ونظرا لكفاءة ترنسفكأيشن منخفضة من إم سي إس، من غير المرجح أن يترك أثرا على قراءات من متوسط ​​إفراز قياس وسطاء جان الدراسات الذاتية التلاعب الجيني. ومع ذلك، من خلال إنشاء كامل شاركت في التعبير لمراسل الجين NPY-mRFP والبلازميد-transfected شارك في نفس الخلايا، رصد النتائج NPY-mRFP …

Discussion

وصفنا استراتيجية مبتكرة تجمع بين الكمي لإم سي إس إيماس وأربعة (س، ص، ض، ر) quantifications البعد عن طريق ثلاثي الأبعاد التصوير ساقطا وقت جان الدراسات في الخلايا الحية باستخدام الجين مراسل إيماس. هذه التقنية تتيح فحص عائلات البروتينات من حيث أثرها على وظيفة MC مثل جان الدراسات…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور U. عاشري لهدية من NPY-mRFP [كدنا]. نشكر الدكاترة. MJ Kofron، L. ميتلمان، M. Shaharbani، وY. زلبرشتاين للحصول على مساعدة لا تقدر بثمن مع المجهري وصورة ويحلل. كما نشكر الدكتور جوزيف أورلي لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم إسرائيل، التي تأسست من قبل الأكاديمية الوطنية الإسرائيلية للعلوم (1139-1112 إلى RS-E).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

References

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

Play Video

Cite This Article
Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

View Video