Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

Resumen

El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción.

Resumen

Los mastocitos (MC) son células secretoras del sistema inmune que logran sus funciones fisiológicas y patológicas mediante la liberación de mediadores alérgicos, inflamatorios e inmunorreguladores preformados y recién sintetizados. Mediadores MCs 'afectan a múltiples tejidos y órganos que culminaron en las respuestas alérgicas e inmunológicas. La síntesis, el almacenamiento y la liberación de los mediadores MC están muy regulados. Los mediadores preformados se embalan en gránulos secretores citoplásmicos (SG) que se fusionan con la membrana plasmática y liberan su contenido por exocitosis regulada. Se presenta un protocolo, basado en la co-expresión de un gen de interés con un gen reportero que se dirige a la SGS y se libera de una manera regulada junto a los mediadores endógenos SG. El protocolo permite una alta resolución de cuatro dimensiones confocal análisis de la MC SGS y el seguimiento de su línea de tiempo de la biogénesis de exocitosis disparado. Por lo tanto, el uso de este protocolo para la detección de genes de interest por su impacto fenotípica y funcional permite descifrar los mecanismos moleculares que gobiernan la biogénesis y exocitosis de la MC SGS y la identificación de los reguladores implicados. Por ello, deben proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos celulares que dan cuenta de la función MCs en la salud y la enfermedad.

Introducción

Mastocitos (MC) son células inmunes que son mejor conocidos por su participación en las reacciones alérgicas e inflamatorias tales como la artritis, el asma, la esofagitis eosinofílica, dermatitis crónica y shock anafiláctico ^1,2, así como otras patologías como la enfermedad de las arterias coronarias y ^3,5 cáncer de ^3,4. Además, MCs juegan un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa, tanto en la defensa del huésped contra las bacterias y los parásitos y por la supresión de las respuestas inmunes, por ejemplo la inducción de tolerancia aloinjerto ^5,6.

MCs se originan en la médula óse....

Protocolo

1. Preparación de RBL Cell Culture Media

1. Mezclar 500 ml de medio de Eagle modificado bajo nivel de glucosa de Dulbecco (DMEM) con 56 ml de suero fetal bovino (esto hace que el 10% de FBS), y luego añadir 5,5 ml de penicilina estreptomicina (esto hace ~ 1% de plagas).
2. Filtra los medios de comunicación mediante el uso de 500-1.000 ml Botella-Top Filtros de Vacío con 0,22 m de tamaño de poro y se almacena a 4 ° C.

2. Cultura de células RBL

1. Se cultivan las células RBL en una atmósfera humidificada de 5% de _CO2 a 37 ° C, ya sea en placas o frascos. Células RBL que crecen en placas de 10 cm deben....

Resultados

Debido a la baja eficiencia de transfección de MCs, las manipulaciones genéticas son poco probable que deje un impacto en las lecturas de la secreción de promedio medidos por los mediadores endógenos SGs. Sin embargo, mediante el establecimiento de completa co-expresión del gen reportero NPY-mRFP y el plásmido co-transfectadas en las mismas células, el seguimiento de los resultados de NPY-mRFP exclusivamente en el seguimiento de la población de células que expresa el gen de interés. Por lo tanto, la ventaja de este ensa.......

Discusión

Se describe una estrategia innovadora que combina la cuantificación de MCs exocitosis y cuatro (x, y, z, t) cuantificaciones dimensión por imágenes en tres dimensiones de tiempo transcurrido de las Comisiones de Estudio en las células vivas utilizando un gen reportero de exocitosis. Esta técnica permite la detección de las familias de proteínas por su impacto en la función MC como SG de monitoreo a partir tan pronto como su salida del Golgi a través de su maduración, la adquisición de competencias exocitosis y degranula.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM	Sigma-Aldrich	D6046-500ML	Cálido en 37 ° C baño de agua antes de usar
Suero fetal bovino	GE cuidado de la salud Ciencias de la vida	SH30071.01
Penicilina-estreptomicina	Tecnologías de
Membrana de acetato de celulosa, tamaño de poro 0.22  μ m	Sigma-Aldrich	CLS430769-1EA
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos Corning	CLS430167		Sigma-Aldrich
Solución de tripsina/EDTA (TE)	Tecnologías de vida	R001100	Calentar en 37 ° C baño de agua antes
de usar PIPES sal dipotásica	Sigma-Aldrich	108321-27-3
Acetato de calcio hidratado	Sigma-Aldrich	114460-21-8
Acetato de magnesio tetrahidratado	Sigma-Aldrich	M5661
Ácido L-glutámico sal de potasio monohidrato (glutamato de potasio)	Sigma-Aldrich	G1501
cubetas de electroporación de 4 mm	celulares	EP-104
IMPULSOR DE GENES CON CONTROLADOR DE PULSO & CAPACITANCIA	Bio rad
		CLS3524
Corning Placas de 96 pocillos	Sigma-Aldrich	CLS3367 o CLS390
Lector de fluorescencia de placa de 96 pocillos- Infinite 200	Tecan
	Sigma-Aldrich	C7522	Evite la exposición directa a la luz
12-O-tetradecanoil-13-acetato (TPA)	Calbiochem	P3766
anti-DNP monoclonal IgE	Sigma-Aldrich	D8406
DNP-BSA/ DNP-HAS	Sigma-Aldrich	A6661	Evite la exposición directa a la luz
Triton-x-100	Sigma-Aldrich	T8787
Microscopio fluorescente confocal:
Zeiss LSM 510
Leica	SP5
Nikon A1 invertido
Software Imaris	BITLANE
Microsoft exel o Prism u otro software
Otro reactivo:
Cloruro de magnesio	MERK	5833
Cloruro de sodio	MERK	6404
Cloruro de calcio	MERK	2382
Albúmina sérica bovina	Sigma-Aldrich	A4503
Glucosa	BDH Laboratorios	284515V
Fosfato monosódico	MERK	5345
Agua

la vida proyectos Cubreobjetos con cámara Thermo scientific 155411 24 pocillos, fondo plano Sigma-Aldrich Ionóforo de calcio A23187 de análisis estéril