Summary

Mast Hücre Salgı granüller incelenmesi; biyosentezi adlı ekzositozu için

Published: January 26, 2015
doi:

Summary

Bu protokolün amacı, mast hücresi salgısının fonksiyonel genomik analiz sağlayacak bir yöntem geliştirmektir. Protokol çıkar ve gerçek zamanlı gen ile cotrasfected bir flüoresan raportör geninin salınımının nicel değerlendirilmesine dayanır salgılama granülün en morfolojisinin analiz eder.

Abstract

Direk Hücreler (MC) oluşan önceden ve yeni sentezlenmiş, alerjik iltihap ve bağışıklık mediatörler salgılayarak kendi fizyolojik ve patolojik fonksiyonlarını yerine bağışıklık sisteminin salgı hücreleri bulunmaktadır. MCnin arabulucular alerjik ve bağışıklık yanıtları sonuçlanan birden dokuları ve organları etkiler. MC aracıların sentezi, depolama ve serbest derece düzenlenir. Önceden oluşturulmuş arabulucular plazma zarı ile kaynaştırmak ve düzenlenmiş ekzositoz kendi içeriğini serbest sitoplazmik salgı granülleri (SG) paketlenir. SGS hedeflenen endojen SG aracıların yanında düzenlenmiş bir şekilde serbest bırakılan bir raportör gen ile ilgi konusu bir genin ortak ifadesine dayalı bir protokol, mevcut. protokol MC SG- analizleri ve tetiklenen ekzositoz için biyogeneze kendi zaman çizelgesini takip yüksek çözünürlüklü dört boyutlu konfokal sağlar. Böylece, inter genleri taranması için bu protokolü kullanarakkendi fenotipik ve fonksiyonel etki için est MC SG- ve biyogenezi ve ekzositoz düzenleyen moleküler mekanizmaları deşifre ve ilgili düzenleyici belirlenmesi sağlar. Böylece, sağlık ve hastalık MCs işlevi hesap hücresel mekanizmaları içine daha fazla anlayışlar sağlanmalıdır.

Introduction

Direk Hücreler (MC), en iyi, artrit, astım, eozinofilik özofajit, kronik dermatit ve koroner arter hastalığı 3,5 ve anafilaktik şok 1,2 yanı sıra diğer patolojiler gibi alerjik ve iltihabik reaksiyonlarda katılımı için bilinen bağışıklık hücreleri Kanser 3,4. Buna ek olarak, MH'si allogreft toleransı 5,6 uyaran örneğin, bakteri ve parazitlere karşı konak savunmasında ve bağışıklık tepkilerinin bastırılması hem doğuştan ve edinilmiş bağışıklık önemli rol oynamaktadır.

AN + / CD117 + pluripotent progenitör hücrelerin CD34 7 gelişen, kemik iliğinden köken. Taahhüt kemik iliği MC ataları kana salınan ve bağ doku ve epitel yüzeylere 8 içinde ağırlıklı olarak lokalize periferik dokulara göç vardır. Olgunlaşma ve terminal farklılaşma sonunda etkisi o altında elde edilirÇevredeki ortam 8,9 içinde f sitokinler.

AN olan karşılaşma immunglobulin E (IgE) üretimi sonuçlandı antikorlar yazın bir alerjene (antijen, Ag) tarafından aktive edilebilir. Aynı Ag yeniden maruz kaldıktan sonra IgE bağlı hücre çapraz bağlanması, ardından MC'nin FcεRI reseptörlerine IgE bağlanması, FcεRI birikmesi ve hücre degranülasyonu sonuçlanan bir sinyal akışının başlamasında sonuçları [10,11 gözden] . AN da nöropeptidler 5,12 ile, bağımsız olarak IgE, aktive edilmiş 13, bakteriyel ve viral antijenlerin 14,15, toplu olarak, temel salgı bağışıklık hücreleri ve sitokinler 5,13,12,16 olarak adlandırılır, pozitif yüklü bir dizi peptit toksinlerdir , 17. AN ayrıca inflamatuar yanıtı yükseltmek, kendi serbest aracıların, birçok kişi tarafından aktive edilir.

AN immuno ihtiva salgı granülleri (SGS) ile paketlenirBu tür kimaz ve triptaz, vasküler endotelyal büyüme faktörü ve çeşitli sitokinler ve kemokinlerin 8,9 gibi histamin ve (kemirgenlerde) serotonin vazoaktif aminler, proteoglikanlar, proteazlar da dahil olmak üzere düzenleyici aracılar. Bu aracılar "gitmeye hazır" ve MH'si uygun bir uyaran ile aktive kez, bu arabulucuların dakika 18,19 saniye bir konuda düzenlenen Ekzositoz (degranülasyona) hücrelerden salınır. Bu ilk etkinlik arakidonik asit metabolitlerinin, çoklu sitokinler ve kemokinlerin 20,21,22 de dahil olmak üzere, biyolojik olarak etkili maddeler, geniş bir dizi de novo sentezi ve serbest izlemektedir. Yeni sentezlenen ürünlerin Yayın bağımsız SG sürümü oluşur. Toplu olarak, bu aracılar, erken ve geç faz enflamatuar ve alerjik cevap başlar. Bu nedenle, MC aktivasyonu ve degranülasyonu muhasebe mekanizmalarının anlaşılması teorik ve klinik imp hemortance.

genetik birincil ve kültürlü MCs işlemek için zorluk zayıf çözülmesi kaldı MC degranülasyonu yatan mekanizmaları, aydınlatmak için girişimlerini engellemiştir. Ilgi konusu bir gen ile bu sorunun üstesinden gelmek için, biz eş zamanlı olarak transfekte mukozal mast hücre çizgisi, fare bazofilik lösemi bir raportör göre bir deney geliştirildi (RBL) -2H3 (burada RBL olarak anılacaktır) ya da kemik iliğinden elde edilen AN (BMMC'ler), 30 ve nöropeptid Y (NPY), bir SG muhabir olarak, monomerik RFP (MRFP) erimiş.

NPY önce diğer sistemlerde endojen SG belirteçleri davranışını özetlemek gösterilmiştir. MRFP floresan duyarsız pH ifadesi çünkü Ayrıca, NPY-MRFP 96 oyuklu plakalar bir floresan plaka okuyucu kullanarak asidik SG- görselleştirilmesi gibi ekzositozu kantitatif bir değerlendirmesini sağlamaktadır. O NPY-MRFP RBL hücrelerinde ve BMMC'ler asidik SG- teslim olduğunu göstermiştir ve hücreler salınırendojen SG kargo (yani, β-heksosaminidaz ve serotonin) 30, 32 yanında düzenlenmiş moda. Bu protokol kendi fenotipik ve RBL hücrelerinde 32 SG özellikleri ve degranülasyonunun fonksiyonel etkisi ilgi tarama genleri izin veren bir yüksek-çözünürlüklü görüntüleme bazlı bir metodoloji sağlar. Özellikle, bu protokol gerçek zamanlı MC SG- izleme ve kendi alanında veya hacim büyüklüğü, sayısı, montaj kinetik, hücre hücre iskeletinin boyunca onların hareket ve farklı koşullar altında plazma zarı ile nihai füzyon kantifizasyonunu. Örneğin, DNP spesifik IgE ile hücrelerin duyarlılaştırılması farklı düzensizlikler altında bir çok-Ag (DNP konjuge serum albümini) ile hücrelerin tetiklenmesi (yani, ağırlık veya mutant gen ekspresyonuna ya da farmakolojik manipülasyonlara fazla ilgi genlerinin yok etme) ve kontrol hücreleri ile mukayese etmek.

Protocol

RBL hücre kültür ortamının hazırlanması 1. (Bu durum, örneğin% 1 PEST) yapar (bu% 10 FBS yapar) cenin sığır serumu, 56 ml düşük glikoz Dulbecco modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM), 500 ml karıştırın ve penisilin streptomisin 5.5 mi ekleyin. 4 ° C'de 0.22 mikron gözenek büyüklüğüne ve mağaza ile 500-1000 ml Şişe-Üst Vakum Filtreler kullanarak ortamı Filtre. RBL hücrelerinde 2. Kültür Ya da plakalar veya şişeler i…

Representative Results

Çünkü MCs düşük transfeksiyon verimi, genetik manipülasyonlar endojen SGS arabulucular tarafından ölçülen ortalama salgılanması çıktılan üzerinde bir etki bırakmak için olası değildir. Bununla birlikte, özel olarak ilgi konusu geni ifade eden hücre popülasyonu izlenmesinde raportör gen NPY-MRFP tam eş-ifade ve aynı hücre ko-transfekte edilmiş plazmid NPY-MRFP sonuçlarının izlenmesi kurarak. Bu nedenle, geleneksel yöntemler ile karşılaştırıldığında, bu deneyde avantajı seçici Ge…

Discussion

Biz ekzositoz için bir raportör gen kullanılarak canlı hücrelerde SG- zaman-lapsed üç boyutlu görüntüleme ile MCs Ekzositoz ve dört (x, y, z, t) boyut sayımsal kantifikasyonunu birleştiren yenilikçi bir strateji tarif. Bu teknik olarak erken olgunlaşma yoluyla Golgi kendi çıkış, ekzositoz yetkinlik ve degranülasyonun satın olarak başlayan bu tür izleme SG- MC fonksiyonu üzerindeki etkileri için protein aileleri tarama sağlar. Birlikte SG- morfometrik ve kinetik karakterizasyonu ile ekzositoz ö…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz NPY-MRFP cDNA hediye Dr. U. Ashery teşekkür ederim. Biz Dr teşekkür ederim. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani ve mikroskobu ile paha biçilmez yardım için Y. Zilberstein ve görüntü analizleri. Biz de bu yazının eleştirel okuma Dr Joseph Orly teşekkür ederim. Bu çalışma Bilimler Akademisi İsrail tarafından kurulan İsrail Bilim Vakfı hibe tarafından desteklenmiştir (1139-1112 RS-e için.).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

References

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

Play Video

Cite This Article
Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

View Video