Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose

doi: 10.3791/52505 Published: January 26, 2015

Summary

Het doel van het huidige protocol was om een ​​methode die functioneel genomische analyses van mestcel secretie zal ontwikkelen. Het protocol is gebaseerd op kwantitatieve beoordeling van de release van een tl-reporter-gen cotrasfected met het gen van interesse en real-time analyses van de morfologie van de secretoire korrel's.

Abstract

Mestcellen (MC) zijn secretoire cellen van het immuunsysteem die de fysiologische en pathologische functies vervullen door het vrijgeven van voorgevormde en nieuw gesynthetiseerde allergische, ontstekings- en immuunregulerende mediatoren. MCs 'mediators beïnvloeden meerdere weefsels en organen culminerend in allergische en immuunreacties. De synthese, opslag en afgifte van de MC mediators zijn sterk gereguleerd. De voorgevormde bemiddelaars zijn verpakt in cytoplasmatische secretoire korrels (SG) die fuseren met de plasmamembraan en de inhoud ervan vrij te maken door gereguleerde exocytose. We presenteren een protocol gebaseerd op de co-expressie van een gen van belang met een reportergen dat is gericht op de SG en opgenomen in een reguleerbare wijze naast de endogene SG mediators. Het protocol maakt hoge resolutie vierdimensionale confocale analyses van de MC SG's en het toezicht op hun tijdlijn van biogenese naar aanleiding exocytose. Dus, door dit protocol voor screening van genen interest hun fenotypische en functionele effect maakt ontcijferen moleculaire mechanismen die de biogenese en exocytose MC SG bepalen en identificeren van de betrokken regulatoren. Daarbij moet verder inzicht in de cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor MCs functie in gezondheid en ziekte worden.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mestcellen (MC) zijn immuuncellen die bekend staan ​​om hun betrokkenheid bij allergische en ontstekingsreacties zoals artritis, astma, eosinofiele oesofagitis, chronische dermatitis en anafylactische shock 1,2 en andere aandoeningen zoals coronaire hartziekte 3,5 en kanker 3,4. Daarnaast MCs spelen een belangrijke rol in aangeboren en adaptieve immuniteit, zowel in de afweer tegen bacteriën en parasieten en door onderdrukking van immuunreacties, bijvoorbeeld het induceren allotransplantaat tolerantie 5,6.

MCs afkomstig uit het beenmerg, het ontwikkelen van CD34 + / CD117 + pluripotente voorlopercellen 7. Geëngageerde beenmerg MC voorouders vrijkomen in de bloedbaan en migreren naar de perifere weefsels lokaliseren voornamelijk binnen bindweefsels en epitheeloppervlakken 8. Rijping en terminale differentiatie worden uiteindelijk gerealiseerd onder invloed of cytokines binnen het omringende milieu 8,9.

MC kan worden geactiveerd door een allergeen (antigen, Ag), waarvan de ontmoeting resulteerde in de generatie van immunoglobuline E (IgE) type antilichamen. Binding van dergelijke IgE aan de MC's FcsRI receptoren, gevolgd door verknoping van celgebonden IgE bij hernieuwde blootstelling aan hetzelfde Ag, leidt FceRI aggregatie en initiatie van een signalerende cascade die culmineert in degranulatie [herzien 10,11] . MCs worden ze geactiveerd, onafhankelijk van IgE door neuropeptiden 5,12, toxines 13 bacteriële en virale antigenen 14,15, een aantal positief geladen peptiden gezamenlijk aangeduid als basis- secretagogen, immuuncellen en cytokines 5,13,12,16 17. MCs worden ze geactiveerd door veel van hun bezit mediatoren, die de ontstekingsreactie verder versterken.

MC's zijn verpakt met secretoire korrels (SGS) dat immuno bevattenregulerende mediatoren, zoals vasoactieve aminen, zoals histamine en serotonine (bij knaagdieren), proteoglycanen, proteasen, zoals chymase en tryptase, vasculaire endotheliale groeifactor en verschillende cytokines en chemokines 8,9. Deze mediatoren "klaar voor" en eenmaal MCs worden geactiveerd door een geschikte stimulus, worden deze mediatoren vrijgemaakt uit de cellen door gereguleerde exocytose (degranulatie) in een kwestie van seconden tot minuten 18,19. Deze initiële gebeurtenis wordt gevolgd door de de novo synthese en afgifte van een grote reeks van biologisch potente stoffen, zoals arachidonzuur metabolieten, verschillende cytokinen en chemokinen 20,21,22. Release van nieuw gesynthetiseerde producten gebeurt onafhankelijk van SG release. Tezamen zijn deze bemiddelaars initiëren vroege en late fase inflammatoire en allergische reacties. Daarom is het begrip van de mechanismen verantwoordelijk voor MC activering en degranulatie zijn zowel theoretisch en klinisch importance.

De moeilijkheid om genetisch te manipuleren primaire en gekweekte MCs heeft bemoeilijkt de pogingen om de mechanismen die ten grondslag liggen MC degranulatie, die slecht bleef opgelost te helderen. Om dit probleem ontwikkelden we een reporter gebaseerde test met gelijktijdig transfecteren van de mucosale mast cellijn, rat basofiele leukemie (RBL) -2H3 (hierna RBL) of beenmerg afgeleide MCs (BMMCs) 30 met een gen van interesse en neuropeptide Y (NPY) gefuseerd aan monomere RFP (mRFP), als SG reporter.

NPY is eerder aangetoond dat het gedrag van endogene SG merkers in andere systemen recapituleren. Bovendien, omdat mRFP fluorescentie pH ongevoelig expressie van NPY-mRFP maakt visualisatie van de zure SG en kwantitatieve beoordeling van exocytose door 96-well platen en een fluorescentie plaatlezer. We hebben aangetoond dat NPY-mRFP wordt geleverd aan de zure SG van RBL-cellen en BMMCs en wordt vrijgemaakt uit de cellenop een gereguleerde manier naast de endogene SG lading (dat wil zeggen, β-hexosaminidase en serotonine) 30, 32. Dit protocol voorziet in een hoge-resolutie-imaging gebaseerde methodologie die screening genen van belang zijn voor hun fenotypische en functionele impact op SG kenmerken en degranulatie in RBL cellen 32 toestaat. Specifiek, dit protocol maakt real time tracking van MC SG en kwantificering van de oppervlakte en het volume groot, aantal, kinetiek van assemblage, hun beweging langs de cel cytoskelet en hun uiteindelijke fusie met de plasmamembraan onder verschillende omstandigheden. Bijvoorbeeld, sensibiliserende de cellen met DNP-specifieke IgE en het activeren van de cellen met een meerwaardige Ag (DNP geconjugeerd serumalbumine) onder verschillende verstoringen (dwz, het uitschakelen van genen van belang, meer dan de expressie van wt of gemuteerde genen, of farmacologische manipulaties) en vergeleken met controle cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Voorbereiding van de RBL Cell Culture Media

  1. Meng 500 ml van laag glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 56 ml foetaal runderserum (dit maakt 10% FBS) en voeg 5,5 ml penicilline streptomycine (dit maakt ~ 1% PEST).
  2. Filter de media met behulp van 500-1.000 ml Fles-Top Vacuum filters Met 0,22 pm poriegrootte en bewaar bij 4 ° C.

2. Cultuur van RBL Cellen

  1. Groeien RBL cellen in een vochtige atmosfeer van 5% CO2 bij 37 ° C in ofwel platen of kolven. RBL-cellen die groeien in 10 cm platen worden aangevuld met 10 ml medium en vormen confluente monolaag van ~ 10 7 cellen / plaat.
  2. Wanneer de cellaag nadert confluentie replate de kweek bij een lagere dichtheid.
    1. Verwijder het kweekmedium van de plaat / kolf met behulp van een steriele Pasteur pipet verbonden vacuüm.
    2. Spoel de cel monolaag met voorverwarmd (37° C) 0,25% trypsine / EDTA dat de gehele monolaag (het volume afhankelijk van de grootte van kweekplaat / fles bedekt, 2 ml 10 cm plaat). Dit zal de cellen los.
    3. Als alternatief, spoel de cel monolaag met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), verwijder de PBS en voeg voorverwarmde (37 ° C) trypsine / EDTA. Deze stap los de cellen sneller.
    4. Plaats de plaat / kolf in een incubator bij 37 ° C (niet meer dan 10 min).
    5. Inspecteer de cellen onder de optische microscoop te kijken of ze hebben losgemaakt. Als de cellen niet los na 10 min, tik zachtjes op de plaat / kolf.
    6. Medium In de kweekplaat / kolf aan de cellen schorten (het volume van de drager dient ten minste 2-voudig groter dan het volume van de trypsine-oplossing).
    7. Pellet de cellen door centrifugatie gedurende 3 min bij 200 g bij 25 ° C.
    8. Resuspendeer de cellen in medium. Verdun de cellen door 01:10 en zaad in een nieuwe cultuur schotel. Incubeer de cellen gedurende 48-72 uur, totdat zij reach ongeveer 90% confluentie.
    9. Herhaal dezelfde procedure (paragraaf 2.2.1-2.2.8) tot 3 maanden (30 passages).

3. Bereiding van transfectie media.

  1. Bereid een oplossing van 100 mM K-buizen pH 7, 1 mM oplossing van Ca2 + acetaat en 100 mM oplossing van Mg2 + acetaat.
  2. Verdun de oplossing van 100 mM K-Pipes pH 7 tot 20 mM met DMEM media, voeg 1 mM oplossing van Ca 2+ acetaat tot een eindconcentratie van 10 uM en 100 mM oplossing van Mg2 + acetaat tot een eindconcentratie van 2 mM.
  3. Weeg Kalium glutamaat en aan de oplossing tot een eindconcentratie van 128 mM, meng en bewaar bij 4 ° C tot gebruik. Houd de resterende oplossingen (bijv. K-buizen, Ca2 + acetaat, Mg2 + acetaat) bij -20 ° C.

4. Transfectie van cellen RBL

  1. Verwijder het kweekmedium van de plaat / kolf met eensteriel pasteurpipet verbonden vacuüm.
  2. Spoel de cel monolaag met voorverwarmde (37 ° C) trypsine / EDTA dat de gehele monolaag bestrijkt. Plaats de plaat / kolf in een incubator bij 37 ° C (niet meer dan 10 min). Controleer of de cellen losgemaakt met de optische microscoop.
  3. Medium In de kweekplaat / kolf aan de cellen schorten (het volume van de media moeten minstens 2 groter dan het volume van de trypsine-oplossing).
  4. Tel het aantal cellen met behulp van hemocytometer.
  5. Pellet 1,5 x 10 7 cellen door centrifugatie gedurende 3 min bij 200 xg bij 25 ° C. Verwijder het supernatants en voeg 280 pl transfectiemedium. Breng de reactie mengsel in 4 mm cuvet.
  6. Voeg 20 ug NPY-mRFP plasmide en hetzij 30 ug controle lege plasmide of een geteste plasmide. Het eindvolume van het reactiemengsel moet 300 pi.
  7. Direct te plaatsen op ijs gedurende 10 min. Veeg de cuvette van restwater en proceed elektroporatie bij 300 V 9 msec.
  8. Voor metingen van exocytose, replate de cellen direct in 24 well weefselkweek gerechten die 300 ul medium. Voeg 8 ul van het reactiemengsel (4 x 10 5 cellen) aan elk putje. Voeg 4 x 10 5 niet getransfecteerde cellen extra putjes controle. Bereid voldoende putjes om ten minste in duplo putjes voor elke behandeling voor elke transfectie.
  9. Voor time lapse microscopie, replate de cellen direct in een 8-well kamer borosilicaat coverglass systeem met 80 ul medium. Voeg 1,5 ul van het reactiemengsel (7,5 x 10 4 cellen) aan elke kamer. (Probeer te voorkomen dat het gebruik van de kamers aan de rand van het dekglaasje, de kamers in het centrum van het dekglaasje zijn gemakkelijker te afbeelding).
    OPMERKING: Belangrijk is, niet alle cellen reactie op een trekker en zo nu en dan de time-lapse microscopie wordt ingetrokken als gevolg van het verlies van focus en drift van het 8-well kamer borosikunst op dekglaasje systeem. Daarom bereiden tenminste 8 kamers voor elke behandeling voor elke transfectie.
  10. Voor sensibiliseren de cellen voor FcsRI gemedieerde activering, voeg 1 ug / ml muizen monoklonale DNP IgE aan de media (Incubeer de cellen met IgE gedurende tenminste 2 uur).
  11. Na 18-24 uur gebruik een fluorescentiemicroscoop te bevestigen dat de cellen brengen de plasmiden. De excitatie en emissie golflengtes van mRFP fluorescentie zijn: Aex 584, Aem 607 nm. NPY-mRFP moeten verschijnen in vesiculaire structuren die overeenkomen met de SGS. Als het tweede gen van interesse gefuseerd aan een fluorescerend tag een fluorescentiemicroscoop op de co-expressie van beide plasmiden te bevestigen aan dezelfde cellen. Bijvoorbeeld, wanneer de te testen gen gefuseerd aan GFP, de excitatie en emissie golflengtes van GFP fluorescentie zijn: A ex 488, Aem 507 nm. De GFP-gelabeld eiwit zou moeten verschijnen op dezelfde cellen die NPY-mRFP uiten.
  12. Voor exocytose metingen overgaan to stap 5 en voor time-lapse microscopie, ga verder met stap 6.

5. Het meten van NPY-mRFP Exocytose

  1. Voorbereiding van Tyrode buffer:
    1. Bereid een oplossing van 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl en 8 mM NaH 2PO 4 in DDW. Meng goed en bewaren bij 4 ° C. Deze stap is voor de bereiding van 20x Tyrode buffer.
    2. Bereid een oplossing van 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM glucose en 1 tot 20 verdunning van Tyrode 20x in DDW en meng. Deze stap is voor de voorbereiding van 1x Tyrode buffer.
    3. Aliquot de 1x Tyrode buffer en bewaar bij -20 ° C. Vermijd herhaaldelijk invriezen en ontdooien.
  2. Verwijder het kweekmedium van de 24 well plaat en was 3 maal met Tyrode buffer. Bereid gestimuleerde cellen door toevoeging van 200 pi Tyrode buffer controleputjes.
  3. Bereid 10 pl / putje van 20x geconcentreerde activerend reagens [(bv 1000 ng / ml DNP-BSA of DNP-HSA (Ag), 200 uM Ca2 + ionofoor (A23187 bijvoorbeeld), en een combinatie van 20 uM Ca2 + ionofoor en 1000 nM 12-O- tetradecanoylforbol-13-acetaat (TPA)]. Als reagentia worden bewaard in DMSO verdund reagentia in 20x concentratie Tyrode buffer met 1% DMSO. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min.
  4. Verwijder de supernatanten van elk putje voorzichtig een 96 wells plaat, plaats op ijs en voorkomen tegen licht. (De bovenstaande vloeistoffen bevatten het chimère peptide NPY-mRFP die werd vrijgelaten uit de cellen).
  5. Voeg 200 ul Tyrode buffer die 0,5% Triton X-100 aan elk putje en incubeer bij 37 ° C gedurende 10 min. (Deze stap is belangrijk voor de bereiding van cellysaten die bevatten de rest van NPY-mRFP die niet losgelaten uit de cellen). Verzamel de cellysaten en overbrengen in een 96 wells plaat, plaats op ijs en voorkomen tegen licht.
  6. Meet de fluorescentie van de cel supernatanten en cellysaten met een tllingen plaat lezer, met behulp van een 590-, 20 nm bandbreedte excitatiefilter en 635-, 35 nm bandbreedte emissie filter.
  7. Bereken het percentage van NPY-mRFP uitgebracht:
    OPMERKING: De fluorescentie lezer maatregel arbitraire fluorescentie-eenheden (AFU). AFU zijn afhankelijk van het apparaat en de gevoeligheid en de transfectie-efficiëntie.
    1. Stel de autofluorescentie van niet-getransfecteerde RBL cellen als blanco. Verdeel de AFU van elk supernatant aan de totale fluorescentie (AFU van de bovenstaande vloeistoffen + AFU van de bijbehorende lysaat) en vermenigvuldig met 100.

6. Time-lapse Microscopie van Exocytose

  1. Seed 7.5 × 10 4 van de getransfecteerde cellen / kamer in een 8-well kamer borosilicaat dekglaasje systeem. Na 18-24 uur, verwijder het kweekmedium uit de kamers en was 3 maal met Tyrode buffer
  2. Voeg 72 ul van Tyrode buffer aan elke kamer. Verdun de activerende reagentia Tyrode buffer 10x concentratie.
  3. <li> Gebruik een confocale fluorescentiemicroscoop uitgerust met een verhitte kamer (37 ° C) en CO2 controller (4,8%) en een 40x of 63x objectief. Zet de microscoop systemen: kwiklamp, computer, en lasers. Zorg ervoor dat de verwarmde kamer is op de juiste temperatuur voor het starten van het experiment.
  4. Plaats de kamer in de verwarmde ruimte en zorg ervoor dat de kamer goed en stabiel is geïnstalleerd.
  5. Zet de fluorescentie licht volgens de relevante fluorofoor en visualiseren getransfecteerde cellen. Schakel fluorescentie eens een cel van belang is in het veld in om te bleken en cytotoxiciteit te minimaliseren. Het is belangrijk dat dit veld over 2-3 getransfecteerde cellen bevatten. De getransfecteerde cellen moet goed gespreid maar elkaar niet raken.
  6. Pas het laservermogen (afhankelijk van de microscoop) om ruis en oververzadiging en toxiciteit te minimaliseren, en stel de versterking en offset de signaal-ruisverhouding te passen. Scan snel in ofder de duur van laser expositie (gemiddeld 2) te verminderen.
  7. Pas de pinhole grootte een maximum, dit maakt het verminderen van de laservermogen en afbeeldingen gerichte langere periode te handhaven. Indien gewenst, stelt u de parameters voor de Z-stack om het beeld te reconstrueren in de driedimensionale, pas de pinhole grootte tot 1 luchtig eenheid (AU), die de beste signaal-ruisverhouding geeft en het verwerven van de opeenvolgende scannen van twee-dimensionale confocale optische schijfjes in de z -axes optische plakjes ≤0.7 urn.
  8. Stel het interval tussen elke verkrijging 15-30 sec en de duur van de totale acquisitie tot 15 min, en begint aan afbeeldingen. Na 5 min van verwerving pauzeren de tijdreeks. Voeg 8 ul van de 10x trekker over en onmiddellijk verder met de overname.
  9. Sla de foto's, het uitvoeren deconvolutie met behulp van een deconvolutie software en reconstrueren de stapels tot drie dimensionale beelden en een film met Imaris software.

  1. Importeren de gegevens van de deconvoluted tijdreeksen beelden die werden verkregen door de confocale fluorescentie microscoop Imaris software. Deze software leest meer dan 40 microscopie bestanden. Als de software niet kan lezen van de bestanden; de bestanden converteren naar TIF-bestanden en import.
  2. Om tijd punten toe te voegen aan het einde van een open data set druk op Bewerken -> Add Time Points en de set importeren nieuwe gegevens.
  3. Maak het oppervlak van de mRFP kanaal met behulp van de optie oppervlak wizard. Kies de standaard algoritme. Kies het kanaal van NPY-mRFP. Markeer de optie smoothing om ruis te verminderen. Om verlies te voorkomen van kleine details te verminderen het gebied detailniveau tot 0,05 micrometer.
  4. Stel de intensiteit drempel. Nieuwe grijze oppervlak zal worden weergegeven. Ga naar 'Instellingen' en schakel de stijl van "Middelpunt" tot "Surface".
  5. Ga naar het tabblad statistiek in de eigenschappen van het geselecteerde object, selecteert u de gedetailleerde tabblad en de specifieke waarde such fluorescentie-intensiteit, volume etc.
  6. Bekijk de gegevens en bevestigen dat de waarden zijn compatibel met de beelden. Bijvoorbeeld kunnen twee of meer aangrenzende korrels worden gemeten als een grotere korrel. Voor het kwantificeren van de gemiddelde korrelgrootte verdelen de grootte van de gefuseerde granules het werkelijke aantal korrels.
  7. De gewenste gegevens naar Excel-bestanden te exporteren en analyseren van de gegevens.
f

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vanwege de lage transfectie efficiëntie van MC, genetische manipulaties waarschijnlijk geen invloed op uitlezingen van gemiddeld secretie gemeten door endogene mediators SG verlaten. Niettemin, door het instellen volledige co-expressie van het reportergen NPY-mRFP en de gecotransfecteerde plasmide in dezelfde cellen, controle van NPY-mRFP resultaten bewaken uitsluitend de celpopulatie die het gen van belang tot expressie brengt. Daarom is het voordeel van deze assay ten opzichte van conventionele werkwijzen is het vermogen om genetisch gemanipuleerde cellen (Figuur 1) selectief controleren.

Inderdaad, met behulp van deze test hebben we genen die vesiculaire handel, waaronder oplosbare NSF [N-ethylmaleimide gevoelige fusie] gehechtheid eiwit receptor (kleine) eiwitten en 44 leden van de Rab GTPasen familie reguleren gescreend. We geïdentificeerde genen die SGsize, aantal, lading samenstelling en exocytose 23 reguleren.

We geïdentificeerd 30 Rabs die gewijzigd (bijvoorbeeld remmen of bevorderen) exocytose in RBL-cellen gestimuleerd door hetzij Ag of de combinatie van een Ca2 + ionofoor en de forbolester TPA (Ion / TPA) 23. Confocale beeldvorming onthulde SNAREs en Rabs die dramatische fenotypes veranderen van de morfologie van de cellen of de SG 30,32 veroorzaakt. Confocale beeldvorming van deze eiwitten onthulde 8 SNAREs en Rabs dat dramatische fenotypes op de cellen of de SG morfologie 30,32 veroorzaakt. Met behulp van dit protocol waren we in staat om individuele SGs volgen en metingen van hun grootte, fluorescentie-intensiteit, hun beweging en exocytose voeren. Zo hebben we geïdentificeerd Rab5 als regulator van SG biogenese 30. Rab5 is geïdentificeerd als een meester regulator van endocytose en endosomaal fusion 24. We hebben aangetoond dat co-expressie van constitutief negatieve (CN) GDP vergrendeld mutanten van het endogeen tot expressie isovormen van Rab5 (Rab5A, Rab5B en Rab5C) of eXpression van Rab5A / B / C targeting shRNAs, verminderde de SG's 'grootte met een gelijktijdige toename van hun aantal op 30. Omgekeerd expressie van een GTP vergrendeld, constitutief-actieve (CA) Rab5A mutant (Rab5A Q79L, hierin "CA Rab5A"), waarvan bekend is dat homotypische fusie van vroege endosomen (EE) 24 vergemakkelijken, resulteerde in de vorming van reusachtige -Rab5A ingericht blaasjes, die we geïdentificeerd als SG's op basis van de inhoud van de secretoire lading NPY-mRFP en serotonine, en hun vermogen om exocytose in een gereguleerde manier 30.

Figuur 2 toont morphometrische analyses van de NPY-mRFP bevattende SGS. De gemiddelde SG volume CA-Rab5A expressie brengen tot de waarde van 44 urn 3, die> 20-voudig groter dan het gemiddelde van de SG in de controle-GFP tot expressie brengende cellen, terwijl het aantal was verlaagd met 20-voudig (Figuur 2A). De inverse relatietussen het aantal en de grootte van de SG's (Figuur 2A) suggereerde dat de Rab5 gemedieerde uitbreiding van de SG's impliceert hun homotypische fusie. De reus NPY-mRFP bevattende SG gevormd door CA Rab5A laat confocale microscopie beeldvorming van levende cellen in een hoge-resolutie die maakt het monitoren van de SGS details die anders niet mogelijk zouden zijn. Zo hebben we ontdekt Rab5A in het fuseren van SG's naast kleinere structuren verspreid over de reus SGS, het meest waarschijnlijk overeenkomt met endosomen (Figuur 2B). Daarnaast hebben we aangetoond dat Rab5 tijdelijk en liefst associeert met nieuw gevormde SG suggereert dat de selectieve en tijdelijke associatie van Rab5A met nieuw gevormde SG is compatibel met een fusogenisch inrichting die op nieuw gegenereerde granules het vermogen te fuseren met andere SG 30.

Figuur 3 toont vertegenwoordiger time-lapse beelden van MC gigantische SG's die werden gevormd door expressie van CARab5A en de kinetiek van exocytose in de resolutie van een enkele SG na stimulatie. Tijdens MC exocytose, de SG's te verplaatsen naar en samensmelten met de plasmamembraan. Bijgevolg secretorische lading vrijkomt uit de cellen in de extracellulaire ruimte. In deze experimentele systeem is NPY-mRFP vrijgemaakt uit de cellen en in de cellen supernatanten. De fluorescentie van NPY-mRFP in de cel supernatanten kan worden gemeten met een fluorescentie lezer. Omdat NPY-mRFP in de supernatanten verdund zijn fluorescentiesignaal kan niet worden gedetecteerd of gevisualiseerd door fluorescentie microscopie. De afgifte van NPY-mRFP van de granules gedurende exocytose heeft een snelle en dramatische afname in NPY-mRFP fluorescentie-intensiteit en krimp van de NPY-mRFP bevattende SG en hun disappearance.Therefore, live cell imaging gestimuleerde cellen en metingen van NPY -mRFP fluorescentie-intensiteit of NPY-mRFP met SG grootte nauwkeurige beoordeling van de kinetiek van exocytose vanindividuele korrels. Figuur 3B toont de fluorescentie-intensiteiten van SG na stimuleren van de cellen met Ca2 + ionofoor. De SG exocytose ondergaan op verschillende tijdstippen (bijvoorbeeld 2, 3, 6, en 11 min na stimulatie), terwijl de fluorescentie-intensiteit van een SG die niet fuseren met de plasmamembraan constant bleef.

Figuur 1
Figuur 1:. Illustratie van de belangrijkste stappen van het protocol RBL cellen gecotransfecteerd met NPY-mRFP en een tweede gen van interesse of overeenkomstige controle plasmide en direct gezaaid op dekglaasjes, 8 putjes kamer borosilicaat dekglaasje systeem of 96-well platen. De volgende dag, Beelden van de NPY-mRFP bevattende SGs in rust- en getriggerd cellen worden overgenomen door confocale microscopie (A). Daarnaast exocytose van restinG en veroorzaakt cellsis gekwantificeerd door meting van de afgifte van NPY-mRFP in een plaat met 96 putjes fluorescentielezer (B).

Figuur 2
Figuur 2:. Kwantificering van de SGS grootte RBL-cellen werden gecotransfecteerd met NPY-mRFP en hetzij GFP of GFP-CA Rab5A en gezaaid op 8 putjes kamer borosilicaat dekglaasje systeem. 24 uur later werd de 8 putjes kamer geplaatst laser confocale microscoop uitgerust verhitte kamer (37 ° C). Z-stack beelden van opeenvolgende beelden met optische schijfjes 0,7 micrometer werden gevangen met behulp van een 63X olie / 1.4 numerieke opening doelstelling. De beelden werden gedeconvolueerd en driedimensionale beelden werden geconstrueerd door het Imaris software. Het volume van de SG en hen werden berekend met de Imaris software (A). Een deel van de NPY-mRFP bevattende Granules lijkt te worden ingebed in Rab5A (pijlpunten). Anderen zijn naakt of overbrugd met Rab5A (pijlen). Schaal bar = 5 micrometer (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3:. Het meten van de omvang en de kinetiek van exocytose in de resolutie van een enkele SG in activatedRBL cellen RBL-cellen werden gecotransfecteerd met NPY-mRFP en GFP-CA Rab5A en geënt IN8-goed kamer borosilicaat dekglaasje systeem. 24 uur later werd IN8 putjes kamer in een laser confocale microscoop uitgerust met een verhitte kamer (37 ° C) en de cellen werden geactiveerd met 10 uM Ca2 + ionofoor. Beelden werden elke 15 seconden met een 63x olie / 1,4 numerieke apertuur doelstelling verkregen. Afbeeldingenwerden gedeconvolueerd en vervolgens verwerkt door de Imaris software. Schaal bar = 5 urn (A). De gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de NPY-mRFP bevattende granules werd bepaald door het Imaris software en de gegevens werden genormaliseerd naar tijd 0 (tijdstip van toevoeging van de Ca2 + ionofoor). De pijlen geven de tijdstippen waarop release van SGcargo wasnoted (B). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

We beschrijven een innovatieve strategie die kwantificering van MC exocytose en vier (x, y, z, t) afmeting kwantificering combinatie van tijd vervallen driedimensionale beeldvorming van de SG in levende cellen met behulp van een reportergen voor exocytose. Deze techniek maakt het screenen van families van eiwitten voor hun impact op de MC-functie, zoals monitoring SG's al vanaf hun vertrek uit het Golgi door hun rijping, acquisitie van exocytose competentie en degranulatie. De combinatie van metingen van exocytose met morfometrische en kinetische karakteristieken van de SG verschaft inzichten in de mechanismen die de geteste eiwitten bemiddelen MC functies. Daarom is het gebruik van deze methodiek, genetische manipulatie van gerichte genen kunnen nieuwe moleculaire mechanismen die door de MC SG's winkel en laat hun lading onthullen. Opmerkelijk NPY kan dienen als een reporter voor exocytose andere secretoire cellen zoals MCF-7 cellen, een cellijn afgeleid frOM menselijke borstklier adenocarcinoom 31, chromaffinecellen 34 en pancreatische β-cellen 35.

Genetische manipulaties zijn de meest krachtige tools die momenteel beschikbaar zijn voor het onderzoeken van functionele netwerken. Genetische manipulatie kan de identificatie van essentiële eiwitten in elk netwerk, waarvan verwijdering zal ineenstorting van het systeem te handhaven, in tegenstelling tot andere eiwitten waarvan deletie zal overspraak tussen parallelle netwerken dwingen of geen effect door redundantie. Vanwege de lage transfectie efficiëntie van cassettes, bij het meten van exocytose van endogene mediators slechts een kleine fractie van cellen wordt expressie van de 'manipuleren' test-DNA. Dus, bij het meten exocytose van endogene mediators, de bijdrage van de getransfecteerde cellen om het totale uitlezing gering. Daarom proberen om een ​​dergelijke benadering van de complexe netwerken in verband met gereguleerde exocytose bij MCs verkennen was hampered. Deze techniek overwint het obstakel van de lage transfectie-efficiëntie en biedt een eenvoudige manier om fenotypische afwisselingen van MC SG's veroorzaakt door over-expressie, knock-down en mutagenese van genen van belang te observeren.

Deze techniek kan worden uitgebreid onderzoeken van de hiërarchie en de interactie van functionele netwerken met transiënte drievoudige transfectie. De resultaten worden geanalyseerd om te bepalen welk gen een bepaald fenotype kan redden; leiden tot een meer dramatische fenotype of hebben geen effect. Op basis van dergelijke combinatorische transfecties kan exocytose netwerken worden geconstrueerd. Bijvoorbeeld met drievoudige transfectie konden we de SNARE eiwitten VAMP8 identificeren als een stroomafwaartse mediator in het proces van Rab5 afhankelijke SG fusion 25.

Deze methode maakt visualisatie en kwantificatie van exocytose in de resolutie van enkele SGS. Inderdaad waren we in staat om aan te tonen dat de SG-display differentiële reacties op stimuli. De reden waarom bepaalde SG gefuseerd met de plasmamembraan terwijl anderen niet of de reden voor het verschil kinetiek van MC SG fusie nog worden vastgesteld. Toekomstige studies met behulp van deze experimentele aanpak hebben het potentieel om deze vragen te beantwoorden. Zo moet kwantificering van verschillende SNAREs of Rabs op individuele SGS en correlatie met exocytose competentie en de kinetiek van exocytose in de resolutie van een enkele SG nieuwe regulatoren van exocytose onthullen.

De belangrijkste beperking van deze techniek is de genetische manipulatie vanwege overexpressie van een eiwit celfunctie of morfologie kunnen beïnvloeden. Daarom is het essentieel om de resultaten met complementaire aanpak valideren. Wanneer bijvoorbeeld overexpressie van een constitutief actieve mutant exocytose remt het effect van een constitutieve negatieve mutant of neerslaan van het gen moet ook worden getest.

Met deze techniek, we identifIED nieuwe regulatoren van MC functies, die MC exocytose beïnvloeden of de SG morfologie veranderen. De combinatie van exocytose metingen met SG morfometrische karakterisering geeft dieper inzicht in de functie en werkingsmechanismen van de geteste eiwitten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij danken dr U. Ashery voor de gave van NPY-mRFP cDNA. Wij danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, en Y. Zilberstein voor onschatbare hulp bij microscopie en het beeld analyseert. We danken ook Dr. Joseph Orly voor kritische lezing van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een subsidie ​​van de Israel Science Foundation, opgericht door de Israëlische Academie voor Wetenschappen (1139-1112 naar RS-E.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126, (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40, (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22, (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94, (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77, (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117, (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117, (6), 1214 (2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176, (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3, (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63, (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151, (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68, (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28, (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11, (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189, (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13, (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192, (9), 4043-4053 (2014).
Onderzoekt mestcel secretiegranula; Biosynthese van exocytose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).More

Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter