Summary
Das Ziel des vorliegenden Protokolls war es, eine Methode, die funktionelle Genomanalysen von Mastzellen Sekretion ermöglichen entwickeln wird. Das Protokoll basiert auf einer quantitativen Beurteilung der Freisetzung eines fluoreszierenden Reporter-Gen mit dem Gen von Interesse und den Echtzeit cotrasfected Analysen der sekretorischen Granula Morphologie.
Abstract
Mastzellen (MC) sind sekretorische Zellen des Immunsystems, die den physiologischen und pathologischen Funktionen durch Lösen vorgeformt und neu synthetisierten allergischen, entzündlichen und immunMediaToren erreichen. MCs "Mediatoren beeinflussen mehrere Gewebe und Organe ihren Höhepunkt in Allergien und Immunreaktionen. Die Synthese, Speicherung und Freisetzung der MC Mediatoren sind stark reguliert. Die vorgeformten Mediatoren in zytoplasmatischen sekretorischen Granula (SG), die mit der Plasmamembran verschmelzen und ihr Inhalt durch regulierte Exozytose verpackt. Wir stellen ein Protokoll, bezogen auf die Co-Expression eines Gens von Interesse mit einem Reportergen, das auf das SGs richtet ist und in einer geregelten Art und Weise entlang der endogenen Mediatoren freigesetzt SG. Das Protokoll ermöglicht hochauflösende vierdimensionalen konfokalen Analysen des MC SGs und Überwachung der Zeitleiste aus Biogenese ausgelöst Exozytose. Somit kann unter Verwendung dieses Protokolls zum Screenen Genen interest für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen ermöglicht die Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die Biogenese und Exozytose des MC SGs zu regieren und die Ermittlung der Regulierungsbehörden beteiligt. Dabei sollten weitere Einblicke in die zellulären Mechanismen, die für die MCs Funktion in Gesundheit und Krankheit Konto zur Verfügung gestellt werden.
Introduction
Mastzellen (MC) sind Immunzellen, die am besten für ihre Beteiligung an allergischen und entzündlichen Reaktionen wie Arthritis, Asthma, eosinophile Ösophagitis, chronische Hautentzündung und anaphylaktischer Schock 1,2 sowie andere Erkrankungen, einschließlich koronarer Herzkrankheit 3,5 und bekannt sind, Krebs 3,4. Darüber hinaus spielen MCs eine wichtige Rolle bei angeborenen und erworbenen Immunität, die beide in der Wirtsabwehr gegen Bakterien und Parasiten und durch Unterdrückung von Immunreaktionen, zum Beispiel induziert Transplantattoleranz 5,6.
MCs stammen aus dem Knochenmark, die Entwicklung von CD34 + / CD117 + pluripotenten Vorläuferzellen 7. Engagierte Knochenmarksvorläuferzellen MC sind in die Blutbahn und wandern in den peripheren Geweben zu lokalisieren überwiegend im Bindegewebe und Epithel-Oberflächen 8. Reifung und terminale Differenzierung werden schließlich unter dem Einfluss o erreichtf Zytokine innerhalb der umgebenden Milieu 8,9.
MCs kann durch ein Allergen (Antigen, Ag), deren Zusammentreffen führte zur Erzeugung von Immunglobulin E (IgE) Antikörper vom Typ aktiviert werden. Die Bindung eines solchen IgE an den MC FcsRI Rezeptoren, gefolgt von Vernetzen des zellgebundenen IgE bei erneutem Kontakt zu derselben Ag, Ergebnis in FcsRI Aggregation und Einleitung einer Signalkaskade, die in Mastzelldegranulation gipfelt [in 10,11 Bewertung] . MCs werden ebenfalls aktiviert, unabhängig von IgE durch Neuropeptide 5,12, Toxine 13, bakterielle und virale Antigene, 14,15, eine Reihe von positiv geladenen Peptide kollektiv als Grund Sekretagoga, Immunzellen und Zytokinen 5,13,12,16 bezeichnet , 17. MCs werden auch von vielen ihrer eigenen freigesetzten Mediatoren, die weiter verstärken die entzündliche Reaktion aktiviert.
MCs mit sekretorischen Granula (DMS), die Immun enthalten verpacktRegelungsmediatoren einschließlich vasoaktive Amine, wie Histamin und Serotonin (bei Nagern), Proteoglykane, Proteasen, wie Chymosin und Tryptase, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor und verschiedene Zytokine und Chemokine 8,9. Diese Mediatoren sind "ready to go" und einmal MCs werden durch einen geeigneten Stimulus aktiviert werden diese Mediatoren aus den Zellen durch Exozytose (Degranulation) in einer Angelegenheit von Sekunden bis Minuten 18,19 freigegeben. Diese erste Veranstaltung wird von der De-novo-Synthese und Freisetzung von einer großen Auswahl an biologisch wirksamer Stoffe, einschließlich Arachidonsäure-Metaboliten, mehrere Zytokine und Chemokine 20,21,22 gefolgt. Freisetzung von neu synthetisierten Produkte erfolgt unabhängig von SG-Release. Zusammengenommen sind diese Mediatoren initiieren frühen und späten Phase entzündliche und allergische Reaktionen. Daher Verständnis der Mechanismen Anteil von MC-Aktivierung und Degranulation sind beide von theoretischen und klinischen importance.
Die Schwierigkeit genetisch zu manipulieren primären und kultiviert MCs hat die Versuche, die Mechanismen MC Degranulation zugrunde, die schlecht aufgelöste blieb Aufklärung behindert. Um dieses Problem zu überwinden, haben wir ein Reporter basierten Assay durch Co-Transfizieren des Schleimhaut-Mastzelllinie, Ratte Basophilenleukämie entwickelt (RBL) -2H3 (hierin als RBL bezeichnet) oder Knochenmark-abgeleitete (MCS BMMCs) 30 mit einem Gen von Interesse und Neuropeptid Y (NPY), fusioniert an monomeren RFP (mRFP) als SG Reporter.
NPY wurde zuvor gezeigt, daß das Verhalten des endogenen SG Marker in anderen Systemen zu rekapitulieren. Da außerdem mRFP Fluoreszenz pH unempfindlich Expression von NPY-mRFP ermöglicht die Visualisierung der sauren SGs sowie quantitative Beurteilung der Exozytose durch Verwendung von 96-Well-Platten und einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät. Wir haben gezeigt, dass NPY-mRFP ist mit den sauren SGs von RBL-Zellen und BMMCs geliefert und wird aus den Zellen freigesetztin einer regulierten Weise neben dem endogenen SG Ladung (dh β-Hexosaminidase und Serotonin) 30, 32. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Bildgebung basierende Methodik, die Screening Gene von Interesse für ihre phänotypische und funktionelle Auswirkungen auf SG Eigenschaften und Degranulation in RBL-Zellen 32 erlaubt. Insbesondere ermöglicht dieses Protokoll in Echtzeit-Verfolgung von MC SGs und Quantifizierung von deren Fläche oder Volumen Größe, ihrer Zahl, Kinetik der Montage, ihre Bewegung entlang der Zelle Zytoskeletts und ihre endgültige Fusion mit der Plasmamembran unter verschiedenen Bedingungen. Beispielsweise Sensibilisierung der Zellen mit DNP-spezifische IgE und Triggerung der Zellen mit einer multivalenten Ag (DNP konjugiert Serumalbumin) unter verschiedenen Störungen (dh Knockdown von Genen von Interesse, über die Expression von wt oder mutierten Genen oder pharmakologischen Manipulationen) und im Vergleich zu Kontrollzellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vorbereitung der RBL Zellkulturmedien
- Mischungs 500 ml niedrigen Glucose Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 56 ml fötalem Rinderserum (dies macht 10% FBS), und fügen 5.5 ml Penicillin Streptomycin (dies macht ~ 1% PEST).
- Filtern Sie die Medien mit 500-1000 ml Bottle-Top Vakuumfilter mit 0,22 um Porengröße und bei 4 ° C.
2. Kultur der RBL-Zellen
- Wachsen RBL-Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2 bei 37 ° C entweder in Platten oder Flaschen. RBL-Zellen, die in 10 cm-Platten wachsen, sollte mit 10 ml Medium, ergänzt werden und bilden konfluente Monoschicht von ~ 10 7 Zellen / Platte.
- Wenn die Zellschicht nähert Fluss, Ausstrich der Kultur bei einer geringeren Dichte.
- Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte / Kolben mit einer sterilen Pasteur-Pipette, um Vakuum verbunden.
- Spülen Sie die Zellschicht mit vorgewärmten (37° C) 0,25% Trypsin / EDTA, die die gesamte Monoschicht (das Volumen ist abhängig von der Größe der Kulturplatte / Kolben erstreckt; 2 ml für 10-cm-Platte). Dadurch werden die Zellen abzulösen.
- Alternativ spülen die Zellschicht mit Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), entfernen Sie die PBS und fügen vorgewärmten (37 ° C) Trypsin / EDTA. Dieser Schritt löst die Zellen schneller.
- Legen Sie die Platte / Kolben in einem Brutschrank bei 37 ° C (nicht mehr als 10 min).
- Überprüfen Sie die Zellen unter dem Lichtmikroskop zu überprüfen, ob sie gelöst haben. Wenn die Zellen nicht nach 10 Minuten zu lösen, klopfen Sie leicht auf der Platte / Kolben.
- Hinzufügen Medium zur Kulturplatte / Kolben, um die Zellen zu suspendieren (das Volumen des Mediums sollte mindestens 2-fach größer ist als das Volumen der Trypsinlösung).
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 200 g bei 25 ° C.
- Die Zellen in Medium. Verdünnen Sie die Zellen durch 1.10 und Samen in einem neuen Kulturschale. Inkubieren Sie die Zellen für 48-72 Stunden, bis sie REACh ca. 90% Konfluenz.
- Wiederholen Sie den Vorgang (Abschnitt 2.2.1-2.2.8) für bis zu 3 Monate (30 Stellen).
3. Herstellung der Transfektion Medien.
- Vorbereiten einer 100 mM Lösung von K-Pipes pH 7, 1 mM Lösung von Ca 2+ Acetat und 100 mM Lösung von Mg 2+ Acetat.
- Verdünne das 100 mM Lösung von K-Pipes pH 7 in 20 mM mit DMEM-Medium, fügen die 1 mM Lösung von Ca 2+ Acetat zu einer Endkonzentration von 10 uM und 100 mM Lösung von Mg 2+ Acetat zu einer Endkonzentration von 2 mM.
- Wiegen Kaliumglutamat und zu der Lösung bis zu einer Endkonzentration von 128 mM, gut mischen und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung. Halten Sie die weiteren Lösungswege (dh., K-Rohre, die Ca 2+ Acetat, Mg 2+ Acetat) bei -20 ° C.
4. Transfektion von RBL-Zellen
- Entfernen Sie das Kulturmedium von der Platte / Kolben mit einsterilen Pasteur-Pipette, um Unterdruck verbunden ist.
- Spülen der Zellschicht mit vorgewärmten (37 ° C) Trypsin / EDTA, die die gesamte Monoschicht abdecken sollte. Legen Sie die Platte / Kolben in einem Brutschrank bei 37 ° C (nicht mehr als 10 min). Überprüfen Sie, ob die Zellen gelöst mit dem Lichtmikroskop.
- Hinzufügen Medium zur Kulturplatte / Kolben, um die Zellen zu suspendieren (das Volumen des Mediums sollte mindestens 2 größer mehr als das Volumen der Trypsinlösung sein).
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit Zählkammer.
- Pelle 1,5 × 10 7 Zellen wurden durch Zentrifugation für 3 Minuten bei 200 × g bei 25 ° C. Die Überstände verwerfen und fügen Sie 280 ul von Transfektionsmedium. Übertragen Sie die Reaktionsmischung in 4 mm Küvette.
- In 20 ug NPY-mRFP Plasmid und entweder 30 ug der Steuer leeren Plasmid oder einem Plasmid getestet. Das Endvolumen der Reaktionsmischung sollte 300 & mgr; l sein.
- Unmittelbar danach auf Eis für 10 min. Reinigen Sie die Küvette von Restwasser und p9 ms roceed der Elektroporation bei 300 V.
- Für Messungen der Exozytose, Ausstrich die Zellen sofort in 24-Well-Gewebekulturplatten mit 300 & mgr; l Medium. Hinzufügen 8 ul des Reaktionsgemisches (4 × 10 5 Zellen) in jede Vertiefung. In 4 x 10 5 nicht transfizierten Zellen auf weitere Bohrungen zur Kontrolle. Bereiten Sie genügend Brunnen für den zumindest zwei Vertiefungen für jede Behandlung für jede Transfektion.
- Für Zeitraffer-Mikroskopie, Ausstrich die Zellen sofort in einem 8-Well-Kammerdeckglas Borosilikat-System, das 80 & mgr; l Medium. Hinzufügen von 1,5 ul der Reaktionsmischung (7,5 × 10 4 Zellen) zu jeder Kammer. (Versuchen Sie zu vermeiden, mit den Kammern am Rand des Deckglas, sind die Kammern in der Mitte des Deckglas leichter Bild).
Hinweis: Es ist wichtig, nicht alle Zellen als Reaktion auf ein Trigger- und gelegentlich die Zeitraffermikroskopie wird durch den Verlust der Ausrichtung und Verschiebung der 8-Well-Kammer Boro aufgehobensilicat Deckglas-System. Daher werden mindestens 8 Kammern für jede Behandlung für jede Transfektion. - Zur Sensibilisierung der Zellen für FcsRI vermittelte Aktivierung wird mit 1 ug / ml Maus DNP spezifische monoklonale IgE an die Medien (Inkubieren der Zellen mit IgE für mindestens 2 h).
- Nach 18 bis 24 Stunden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop, um zu bestätigen, dass die Zellen zum Ausdruck bringen, die die Plasmide. Die Anregungs- und Emissionswellenlängen der Fluoreszenz mRFP sind: & lambda; ex 584, & lambda; em 607 nm. NPY-mRFP sollte in vesikuläre Strukturen, die den SGs entsprechen scheinen. Wenn das zweite Gen von Interesse an eine fluoreszierende Markierung fusioniert ist mit einem Fluoreszenzmikroskop, um die Co-Expression von beiden Plasmiden in derselben Zelle zu bestätigen. Wenn beispielsweise der geprüfte Gens mit GFP fusioniert ist, die Anregungs- und Emissionswellenlängen von GFP-Fluoreszenz sind: & lambda; ex 488, & lambda; em 507 nm. Die GFP-markierte Protein sollte an den gleichen Zellen, die NPY-mRFP Ausdruck erscheinen.
- Für Exozytose Messungen gehen to Schritt 5 und für Zeitraffer-Mikroskopie, fahren Sie mit Schritt 6 fort.
5. Mess NPY-mRFP Exocytosis
- Vorbereitung der Tyrode-Puffer:
- Es wird eine Lösung von 54 mM KCl, 20 mM MgCl 2, 2,74 M NaCl und 8 mM NaH 2 PO 4 in DDW. Gut mischen und bei 4 ° C. Dieser Schritt ist für die Herstellung der 20x Tyrode Puffer.
- Eine Lösung aus 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml BSA, 5,6 mM Glucose und 1 bis 20 Verdünnung Tyrode 20x in DDW und gut mischen. Dieser Schritt ist für die Herstellung von 1x Tyrode Puffer.
- Aliquot der 1x Tyrode Puffer und bei -20 ° C. Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen.
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus der 24-Well-Platte und 3 x waschen mit Tyrode-Puffer. Bereiten unstimulierten Zellen durch Zugabe von 200 ul Tyrode Puffer in Vertiefungen zu steuern.
- Herstellung von 10 & mgr; l / Vertiefung 20X konzentriert Aktivierungsreagenz [(zB 1.000 ng / ml DNP-BSA oder DNP-HSA (Ag), 200 & mgr; M Ca 2+ Ionophor (zB 23187), und eine Kombination von 20 & mgr; M Ca 2+ Ionophor und 1.000 nM 12-O- Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA)]. Wenn die Reagenzien in DMSO aufbewahrt, verdünnt den Reagenzien in 20x Konzentration in Tyrode-Puffer, der 1% DMSO. Bei 37 ° C für 30 min.
- Entfernen Sie die Überstände der Vertiefungen sorgfältig auf eine Platte mit 96 Vertiefungen, setzen auf Eis und vor Licht zu vermeiden. (Die Überstände enthalten, die das chimäre Peptid NPY-mRFP, die von den Zellen freigesetzt wurde).
- Gib 200 ul Tyrode-Puffer, der 0,5% Triton X-100 in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 10 min. (Dieser Schritt ist wichtig für die Herstellung von Zelllysaten, die die restlichen von NPY-mRFP, die nicht aus den Zellen freigesetzt wurde, enthalten). Sammeln Sie die Zelllysate und Transfer zu einer Platte mit 96 Vertiefungen, setzen auf Eis und vor Licht zu vermeiden.
- Messen der Fluoreszenz der Zellüberstände und Zelllysate unter Verwendung eines fluoreszierrenzPlattenLeseGerät, mit einem 590-, 20 nm Bandbreite Anregungsfilter und 635-, 35 nm Bandbreite Emissionsfilter.
- Der prozentuale Anteil von NPY-mRFP Freigabe:
HINWEIS: Der Fluoreszenzreader Maßnahme willkürlichen Fluoreszenzeinheiten (AFU). AFU Werte hängen von der Maschine und ihrer Empfindlichkeit und der Transfektionseffizienz.- Stellen Sie die Autofluoreszenz der nichttransfizierten RBL-Zellen als leer. Teilen Sie die AFU jedes Überstands auf die Gesamtfluoreszenz (AFU der Überstände + AFU des entsprechenden Lysat) und mit 100 multipliziert.
6. Zeitraffer-Mikroskopie der Exozytose
- Saatgut, 7,5 × 10 4 der transfizierten Zellen / Kammer in einem 8-Well-Kammerdeckgläser Borosilikat Systems. Nach 18 bis 24 Stunden, entfernen Sie das Kulturmedium aus den Kammern und wäscht 3 mal mit Tyrode-Puffer
- In 72 ul Tyrode Puffer zu jeder Kammer. Verdünnen Sie die Aktivierungsreagenzien in Tyrode-Puffer zu 10x Konzentration. <li> Verwenden Sie einen konfokalen Fluoreszenzmikroskop mit einer beheizten Kammer (37 ° C) und CO 2-Controller (4,8%) und einem 40X oder 63X Ziel ausgestattet. Schalten Sie den Mikroskopsysteme: Quecksilberlampe, Computer und Laser. Stellen Sie sicher, dass die beheizte Kammer ist mit der richtigen Temperatur vor Beginn des Experiments.
- Legen Sie die Kammer in der beheizten Kammer und stellen Sie sicher, dass die Kammer richtig und stabil installiert ist.
- Schalten Sie das Fluoreszenzlicht nach dem jeweiligen Fluorophor und visualisieren transfizierten Zellen. Schalten Fluoreszenz sobald eine Zelle von Interesse ist auf dem Gebiet, um das Bleichen und Zytotoxizität zu minimieren. Es ist wichtig, dass dieser Bereich ungefähr 2-3 transfizierte Zellen enthalten. Die transfizierten Zellen sollten gut verteilt werden, jedoch nicht gegenseitig berühren.
- Stellen Sie die Laserleistung (abhängig von dem Mikroskop), um Rauschen und Übersättigung sowie Toxizität zu minimieren, und stellen Sie die Verstärkung und Offset, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu ändern. Schnell einscannen oderder die Dauer der Laserexposition (Durchschnitt 2) zu minimieren.
- Stellen Sie die Lochblendengröße zu einem Maximum, dies ermöglicht die Verringerung der Laserleistung und die Bilder für einen langen Zeitraum ausgerichtet zu halten. Wenn gewünscht, stellen Sie die Parameter für die Z-Stack, um das Bild im dreidimensionalen, stellen Sie die Lochgröße auf 1 luftigen Einheit (AU), die das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erwerben gibt und sukzessive Abtasten der zweidimensionalen konfokalen optischen Scheiben in die Rekonstruktion die z-Achse mit optischen Scheiben ≤0.7 um.
- Stellen Sie das Zeitintervall zwischen jedem Erwerb nach 15-30 sec und die Dauer der gesamten Anschaffungs bis 15 Minuten und starten Sie die Erfassung von Bildern. Nach 5 Minuten des Erwerbs halten Sie den Zeitreihen. In 8 ul der 10-fach Trigger und weiter die Übernahme sofort.
- Speichern Sie die Bilder, führen Entfaltung mit einem Entfaltungs Software und rekonstruieren die Stapel, um dreidimensionale Bilder und zu einem Film mit Imaris Software.
- Importieren Sie die Daten aus den entfalteten Zeitreihe Bilder, die von der konfokalen Fluoreszenzmikroskop zu Imaris Software erhalten. Diese Software liest über 40 Mikroskopie-Dateien. Wenn die Software die Dateien nicht lesen; die Dateien zu konvertieren, um TIF-Dateien und Import.
- Zur Zeit zeigt auf das Ende eines offenen Datensatzes drücken bearbeiten hinzufügen -> Add Zeitpunkte und importieren Sie die neuen Datensatzes.
- Erstelle Oberfläche des mRFP Kanal mit Option Oberfläche Assistenten. Wählen Sie den Standard-Algorithmus. Wählen Sie den Kanal von NPY-mRFP. Markieren Sie die Option Glätten um Lärm zu reduzieren. Um einen Datenverlust zu vermeiden, von kleinen Details reduzieren den Bereich Detailebene bis 0,05 um.
- Stellen Sie die Intensitätsschwelle. New graue Fläche angezeigt. Gehen Sie auf "Einstellungen" und schalten Sie den Stil von "Mittelpunkt" auf "Surface".
- Gehen Sie zur Registerkarte Statistik in den Eigenschaften des ausgewählten Objekts, wählen Sie die Registerkarte Detail und den spezifischen Wert such als Fluoreszenz-Intensität, Volumen usw.
- Überprüfen Sie die Daten und bestätigen Sie, dass die Werte mit den Bildern kompatibel sind. Beispielsweise könnten zwei oder mehr benachbarten Körnchen als eine größere Granulat gemessen werden. Zur Quantifizierung der durchschnittlichen Korngröße zu teilen, die Größe der zusammengeführten Granulate auf die tatsächliche Anzahl der Körnchen.
- Exportieren Sie die gewünschten Datensätze in Excel-Dateien und die Daten analysieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wegen der geringen Transfektionseffizienz von MCs sind genetische Manipulationen kaum einen Einfluss auf die Messwerte von durchschnittlich Sekretion von endogenen Mediatoren gemessen SGs verlassen. Dennoch indem vollständige Co-Expression des Reportergens NPY-mRFP und der co-transfizierten Plasmid in die gleichen Zellen, die Überwachung der NPY-mRFP Ergebnisse der Überwachung ausschließlich der Zellpopulation, die das Gen von Interesse exprimiert. Daher ist der Vorteil dieses Assays im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren die Möglichkeit, die genetisch manipulierten Zellen (Figur 1) selektiv zu überwachen.
In der Tat, in diesem Test haben wir Gene, Vesikeltransport einschließlich löslicher NSF [N-Ethylmaleimid empfindlich Fusion] Attachment-Protein-Rezeptor (SNARE) Proteine und 44 Mitglieder der Rab GTPasen der Familie regeln abgeschirmt. Wir identifizierten Gene, SGsize, Anzahl, Fracht Zusammensetzung und Exozytose 23 zu regulieren.
We identifizierte 30 Rabs die verändert (dh hemmen oder stimulieren) Exocytose in RBL-Zellen entweder Ag oder durch die Kombination eines Ca 2+ Ionophor und der Phorbolester TPA (Ion / TPA) 23 stimuliert. Konfokale Bildgebung zeigte SNAREs und Rabs, das dramatische Phänotypen Änderung der Morphologie der Zellen oder der SGs 30,32 verursacht. Konfokale Abbildung dieser Proteine ergab 8 SNAREs und Rabs, das dramatische Phänotypen auf den Zellen oder dem SG Morphologie 30,32 verursacht. Mit diesem Protokoll konnten wir einzelne SGs verfolgen und Messungen durchzuführen ihrer Größe, Fluoreszenzintensität, ihre Bewegung und Exozytose. Zum Beispiel haben wir Rab5 identifiziert als Regulator der SG Biogenese 30. Rab5 wurde als Hauptregulator der Endozytose und endosomalen Fusion 24 identifiziert. Wir haben gezeigt, dass die Co-Expression von konstitutiv negativen (CN) BIP-Locked-Mutanten der endogen exprimierten Isoformen Rab5 (RAB5A, Rab5B und Rab5C) oder e gezeigtxpression von RAB5A / B / C-Targeting shRNAs, deutlich reduziert die SGs "Größe mit einem gleichzeitigen Anstieg der ihre Zahl 30. Umgekehrt kann die Expression eines GTP-gesperrt ist, konstitutiv aktiv (CA) RAB5A Mutante (RAB5A Q79L, hierin: "CA RAB5A"), die bekannt ist, um homotypische Verschmelzung frühe Endosomen (EBS) 24 zu ermöglichen, in Folge der Bildung von Riesen RAB5A eingerichtete Vesikel, die wir als SGs anhand des Inhalts des sekretorischen Fracht NPY-mRFP und Serotonin, und ihre Fähigkeit, in einem geregelten Art und Weise 30 exocytosis identifiziert.
Abbildung 2 zeigt, morphometrische Analysen des NPY-mRFP haltigen SGs. Die mittlere SGs Volumen in CA RAB5A exprimierenden Zellen erreicht den Wert von 44 & mgr; m 3, der> 20-fach größer als die mittlere Volumen der SGs im Steuer GFP-exprimierenden Zellen, während ihre Zahl wurde durch 20-fache vermindert (Abb war 2A). Die inverse Beziehungzwischen der Anzahl und Größe der SGs (2A) vorgeschlagen, dass die Rab5 vermittelte Erweiterung der SGs beinhaltet ihre homotypischen Fusion. Der Riese NPY-mRFP enthält SGs von CA RAB5A gebildet ermöglicht die konfokale Mikroskopie lebender Zellen in einer hochauflösenden, die ermöglicht die Überwachung der SGs in Details, die nicht möglich sein könnte, anders. Beispielsweise beobachteten wir RAB5A in Verschmelzen SGs neben kleineren Strukturen zerstreut unter der riesigen SGs, wahrscheinlich entsprechend Endosomen (2B). Zusätzlich haben wir gezeigt, dass Rab5 transient und vorzugsweise assoziiert mit neu gebildeten DMS darauf hindeutet, dass der selektive und vorübergehende Vereinigung von RAB5A mit neu gebildeten DMS ist mit einer fusogenen Vorrichtung, in welcher nur neu erzeugten Granulate haben die Fähigkeit, mit anderen SGs 30 Sicherung kompatibel.
Abbildung 3 zeigt repräsentative Zeitrafferbilder von MC Riesen SGs, die durch die Expression von CA gebildet wurdenRAB5A und die Kinetik der Exozytose bei der Lösung von einem einzigen SG nach der Stimulation. Während MC Exozytose Richtung bewegen sich die SGs und verschmelzen mit der Plasmamembran. Infolge der sekretorischen Ladung wird aus den Zellen in den Extrazellularraum freigesetzt. In diesem experimentellen System wird NPY-mRFP aus den Zellen freigesetzt und in die Zellen Überständen gefunden. Die Fluoreszenz von NPY-mRFP in den Zellüberständen durch ein Fluoreszenzlesegerät gemessen werden. Da jedoch NPY-mRFP wird in den Überständen verdünnt, dessen Fluoreszenz-Signal nicht erkannt wird oder durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Die Freisetzung von NPY-mRFP aus den Granulaten während der Exozytose führt zu einem schnellen und dramatischen Abnahme der NPY-mRFP Fluoreszenzintensität und die Schrumpfung des NPY-mRFP enthaltenden DMS und deren disappearance.Therefore, lebenden Zellen der stimulierten Zellen und die Messungen der NPY -mRFP Fluoreszenzintensität oder NPY-mRFP enthält SG Größe bieten eine genaue Beurteilung der Kinetik der Exozytoseeinzelnen Körner. 3B zeigt die Fluoreszenzintensitäten der SGs nach Stimulation der Zellen mit einem Ca 2+ Ionophore. Die SGs laufen Exozytose zu verschiedenen Zeitpunkten (dh 2, 3, 6, und 11 min nach Stimulation), während die Fluoreszenzintensität einer einzigen SG, die nicht mit der Plasmamembran verschmelzen war konstant.
Abb. 1: Darstellung der wichtigsten Schritte des Protokolls RBL-Zellen werden mit NPY-mRFP und eines zweiten Gens von Interesse oder entsprechende Steuer Plasmid cotransfiziert und unmittelbar auf Deckgläsern, 8-Well-Kammerdeckgläser Borosilikat-System oder 96-Well-Platten ausgesät. Am nächsten Tag werden die Bilder des NPY-mRFP haltigen SGs in ruhenden und ausgelöst Zellen durch konfokale Mikroskopie (A) erfasst. Zusätzlich Exozytose resting und ausgelöst cellsis durch Messen der Freisetzung von NPY-mRFP in einer 96-Well-Platte Fluoreszenzreader (B) quantifiziert.
Abb. 2: Die Quantifizierung der SGS 'Größe RBL-Zellen wurden mit NPY-mRFP und entweder GFP oder GFP-CA RAB5A kotransfiziert und auf 8-Well-Kammer-Borosilikat-Deckglas System ausgesät. 24 Stunden später wurde das 8-Well-Kammer im konfokalen Lasermikroskop ausgestattet beheizten Kammer (37 ° C) platziert. Z-Stapel-Bildern von aufeinanderfolgenden Bildern mit optischen Scheiben 0,7 um wurden mit einem 63X Öl / 1.4 numerische Apertur Ziel eingefangen. Die Bilder wurden zerlegt und dreidimensionale Bilder wurden von den Imaris Software aufgebaut. Das Volumen der SGs und ihre Anzahl wurde unter Verwendung des Imaris Software (A) berechnet. Teil des NPY-mRFP haltigen granules scheint innerhalb RAB5A (Pfeilspitzen) eingebettet werden. Andere sind nackt oder mit RAB5A (Pfeile) überbrückt. Balken = 5 um (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abb. 3: Messung von Ausmaß und Kinetik der Exozytose bei der Lösung von einem einzigen SG in activatedRBL Zellen RBL-Zellen wurden mit NPY-mRFP und GFP-CA RAB5A und ausgesät in8-Well-Kammerdeckglas Borosilikat System kotransfiziert. 24 Stunden später IN8-well Kammer wurde in einem konfokalen Lasermikroskop mit einer beheizten Kammer (37 ° C) ausgestattet ist, und die Zellen wurden mit 10 & mgr; M Ca 2+ Ionophore ausgelöst. Die Bilder wurden alle 15 s unter Verwendung eines 63X Öl / 1.4 numerische Apertur Ziel erworben. Bilderwurden zerlegt und dann durch die Imaris Software verarbeitet. Balken = 5 & mgr; m (A). Die mittlere Fluoreszenzintensität der NPY-mRFP enthaltenden Körnchen wurde durch den Imaris Software bestimmt und die Daten wurden nach der Zeit 0 (Zeitpunkt der Zugabe von Ca2 + Ionophor) normalisiert. Die Pfeile zeigen die Zeitpunkte, an denen Freisetzung von SGcargo wasnoted (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wir beschreiben eine innovative Strategie, die Quantifizierung von MCs Exozytose und vier (x, y, z, t) Dimension Quantifizierungen kombiniert mit zeitversetzt dreidimensionale Abbildung der SGs in lebenden Zellen mit einem Reportergen zur Exozytose. Diese Technik ermöglicht Screening von Proteinfamilien auf ihre Auswirkungen auf MC-Funktion wie die Überwachung SGs bereits ab ihrem Austritt aus dem Golgi durch ihre Reifung, Erwerb von Exozytose Kompetenz und Degranulation. Die Kombination von Messungen der Exozytose mit morphometrischen und kinetische Charakterisierung der SGs gibt Einblicke in die Mechanismen, mit denen die untersuchten Proteine vermitteln MC-Funktionen. Daher ist die Verwendung dieser Methodik genetischen Manipulation gezielt Gene neuen molekularen Mechanismen, durch die die MC SGs Shop und geben ihre Ladung zu enthüllen. Bemerkenswert ist, NPY kann als Reporter für die Exocytose in anderen sekretorischen Zellen wie MCF-7-Zellen, einer Zelllinie abgeleitet fr dienenom eine menschliche Brustdrüse Adenokarzinom 31. Chromaffinzellen 34 und Pankreas-β-Zellen 35.
Genetische Manipulationen sind die mächtigsten Werkzeuge zur Zeit für die Erforschung funktioneller Netzwerke zur Verfügung. Genetische Manipulationen ermöglichen die Identifizierung von Proteinen in jedem Netzwerk, dessen Löschung Zusammenbruch des Systems zu erzwingen, im Gegensatz zu anderen Proteinen, deren Löschung Sprechen zwischen parallelen Netzen zusetzen oder keinen Effekt durch Redundanz. Doch wegen der geringen Transfektionseffizienz von MCs, bei der Messung Exozytose von endogenen Mediatoren nur ein kleiner Teil der Zellen die "Manipulation" Test-DNA exprimieren. Daher wird, wenn die Messung der Exozytose von endogenen Mediatoren, ist der Beitrag der transfizierten Zellen zur Gesamtauslese Moll. Daher versuchen, wie vorzugehen, um die komplexen Netzwerken mit regulierten Exozytose in MCs verbunden erkunden war hampered. Diese Technik überwindet das Hindernis der geringen Transfektionseffizienz und bietet einen einfachen Weg, um phänotypischen Wechsel von MC SGs durch Überexpression, Zuschlags und Mutagenese von Genen von Interesse verursacht beobachten.
Diese Technik kann für die Untersuchung der Hierarchie und Art der Wechselwirkung funktioneller Netzwerke mittels transienter Transfektion dreifach verlängert. Die Ergebnisse werden analysiert, um zu bestimmen, welches Gen einen bestimmten Phänotyp zu retten kann; verursacht eine dramatischere Phänotyp oder haben keine Wirkung. Basierend auf einer solchen kombi Transfektionen können Exozytose Netzwerke aufgebaut werden. Zum Beispiel mit Dreifach-Transfektion konnten wir die SNARE-Protein VAMP8 als nachgeschalteter Vermittler im Prozess der Rab5 abhängige SG Fusion 25 zu identifizieren.
Diese Methode erlaubt die Visualisierung und Quantifizierung der Exozytose bei der Lösung von Einzel SGs. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass SGs Display unterschiedlichen Reaktionen zu stimuli. Der Grund, warum bestimmte SGs mit der Plasmamembran fusioniert, während andere nicht oder der Grund für die Differenz Kinetik der MC SG Fusion sind noch festzulegen. Zukünftige Studien mit dieser experimentelle Ansatz das Potenzial haben, diese Fragen zu beantworten. Zum Beispiel sollte die Quantifizierung der verschiedenen SNAREs oder Rabs zu einzelnen SGs und Korrelation mit Exozytose Kompetenz und die Kinetik der Exozytose bei der Lösung von einem einzigen SG neuer Regulatoren der Exozytose zu offenbaren.
Die Hauptbeschränkung dieses Verfahrens ist die genetische Manipulation, da die Überexpression eines Proteins könnte Zellfunktion oder Morphologie beeinflussen. Daher ist es wichtig, die Ergebnisse mit komplementären Ansätzen zu validieren. Zum Beispiel sollte, wenn die Überexpression eines konstitutiv aktiven Mutante hemmt Exozytose, die Wirkung eines konstitutiven negative Mutante oder knock down des Gens als auch getestet werden.
Unter Verwendung dieser Technik haben wir identified neuartigen Regulatoren der MC-Funktionen, die MC Exozytose beeinflussen oder ändern Sie die SG-Morphologie. Die Kombination von Exozytose Messungen mit DMS morphometrischen Charakterisierung bietet einen tieferen Einblick in die Funktion und Wirkungsmechanismen der untersuchten Proteine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wir danken Dr. U. Ashery für das Geschenk des NPY-mRFP cDNA. Wir danken Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y. Zilberstein für wertvolle Unterstützung mit Mikroskopie und Bildanalyse. Wir danken auch Dr. Joseph Orly für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Israel Science Foundation, durch die Israel Akademie der Wissenschaften gegründet, unterstützt (1139-1112 zu RS-E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
- Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
- Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
- Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
- Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
- Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
- Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
- Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
- Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
- Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
- Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
- Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
- Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
- Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
- Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
- Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
- Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
- Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
- Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
- Metz, M., Maurer, M. Mast cells--key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
- Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
- Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
- Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
- Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
