Målet med den foreliggende protokollen var å utvikle en metode som gjør at funksjonelle genomiske analyser av mast celle sekresjon. Protokollen er basert på kvantitativ vurdering av frigivelsen av et fluorescerende reportergen cotrasfected med genet av interesse og sanntids analyse av den sekretoriske granuler sin morfologi.
Mastceller (MC) er sekretoriske celler i immunsystemet som oppnår deres fysiologiske og patologiske funksjoner ved å slippe pre-dannet og nylig syntetiserte allergiske, inflammatoriske og immunmediatorer. MCS 'meklere påvirker flere vev og organer som kulminerte i allergiske og immunresponser. Syntese, lagring og frigjøring av MC meklere er sterkt regulert. De forhånds dannet meklere er pakket i cytoplasmatiske sekresjonsgranuler (SG) som blandes med plasmamembranen og slipper sitt innhold av regulerte eksocytose. Vi presenterer en protokoll, basert på co-uttrykket av et gen av interesse med en reporter gen som er målrettet mot SGS og er utgitt i et regulert mote sammen med de endogene SG meklere. Protokollen gir høy oppløsning fire dimensjonale konfokal analyser av MC SGS og overvåke deres tidslinje fra biogenese til utløst eksocytose. Dermed bruker denne protokollen for screening gener av interest for deres fenotypiske og funksjonell innvirkning lar forklaring på de molekylære mekanismene som styrer biogenese og eksocytose av MC SGS og identifisere regulatorer involvert. Dermed bør ytterligere innsikt i de cellulære mekanismene som står for MCs funksjon i helse og sykdom gis.
Mastceller (MC) er immunceller som er best kjent for sitt engasjement i allergiske og betennelsesreaksjoner som leddgikt, astma, eosinofil øsofagitt, kronisk eksem og anafylaktisk sjokk 1,2 samt andre patologier inkludert koronarsykdom 3,5 og kreft 3,4. I tillegg MCs spiller viktige roller i medfødt og adaptiv immunitet, både i verts forsvar mot bakterier og parasitter og ved undertrykkelse av immunresponser, for eksempel indusere allograft toleranse 5,6.
MCs stammer fra benmargen, utvikling fra CD34 + / CD117 + pluripotente stamceller 7. Forpliktet benmargs MC stamfedre er sluppet ut i blodet og migrere inn i de perifere vev lokalisering hovedsakelig innen bindevev og epiteliale overflater 8. Modning og terminal differensiering blir til slutt oppnådd under påvirkning of cytokiner innenfor det omkringliggende miljø 8,9.
MCS kan aktiveres ved et allergen (antigen, Ag), som støter resultert i generering av immunoglobulin E (IgE) type antistoffer. Binding av et slikt IgE til FceRI MC s reseptorer, fulgt av tverrbinding av cellebundet IgE ved re-eksponering av det samme Ag, resulterer i FceRI aggregering og initiering av en signalkaskade som kulminerer i cellen degranulering [gjennomgått i 10,11] . MCS er også aktiveres uavhengig av IgE, av neuropeptider 5,12, toksiner 13, bakterielle og virale antigener 14,15, et antall positivt ladede peptider kollektivt referert til som basis sekretagoger, immunceller og cytokiner 5,13,12,16 , 17. MCS blir også aktivert ved mange av sine egne frigitte mediatorer, noe som ytterligere forsterker den inflammatoriske respons.
MCs er fullpakket med sekresjonsgranuler (SGS) som inneholder immunregulatoriske mediatorer, inkludert vasoaktive aminer, slik som histamin og serotonin (i gnagere), proteoglykaner, proteaser, slik som chymase og tryptase, vaskulær endotelial vekstfaktor og flere cytokiner og kjemokiner 8,9. Disse meklere er "klar til å gå" og når MCs aktiveres av en passende stimulus, er disse meklere frigjøres fra celler ved regulert eksocytose (degranulation) i løpet av noen sekunder til minutter 18,19. Denne første hendelse blir fulgt av de novo syntesen og frigivelse av en stor mengde biologisk potente substanser, inkludert arachidonsyremetabolitter, flere cytokiner og kjemokiner 20,21,22. Utgivelsen av nye syntetiserte produkter oppstår uavhengig av SG release. Sammen er disse meklere starte tidlig og sen fase inflammatoriske og allergiske reaksjoner. Derfor forstå mekanismene regnskap for MC-aktivering og degranulation er både av teoretisk og klinisk importance.
Vanskelig til genetisk manipulere primære og kultiverte MCs har hemmet forsøkene på å belyse mekanismene bak MC degranulation, som forble dårlig løst. For å overvinne dette problemet vi utviklet en reporter baserte analysen av co-trans slimhinnene mastcellelinje, Rottebasofile leukemi (RBL) -2H3 (heretter omtalt som RBL) eller benmarg avledet MCs (BMMCs) 30 med et gen av interesse og neuropeptid Y (NPY) fusjonert til monomert RFP (mRFP), som en SG reporter.
NPY ble tidligere vist å rekapitulere oppførselen av endogene SG markører i andre systemer. Videre, på grunn mRFP fluorescens er pH-ufølsomt, ekspresjon av NPY-mRFP tillater visualisering av de sure SG samt kvantitativ vurdering av exocytose ved bruk av 96-brønners plater og en fluorescens plateleser. Vi har vist at NPY-mRFP leveres til de sure SGS RBL celler og BMMCs og frigjøres fra cellenei et regulert mote langs den endogene SG last (dvs. β-heksosaminidase og serotonin) 30, 32. Denne protokollen gir en høy oppløsning bildebasert metodikk som gjør at screening gener av interesse for deres fenotypiske og funksjonell innvirkning på SG egenskaper og degranulation i RBL celler 32. Spesielt, tillater denne protokollen sanntid sporing av MC SG og kvantifisering av sitt område eller volum størrelse, deres antall, kinetikken for montering, deres bevegelse langs cellens cytoskjelett og deres endelige fusjon med plasmamembranen under forskjellige forhold. For eksempel sensibiliserende cellene med DNP-spesifikk IgE og utløser cellene med et flerverdig Ag (DNP konjugert serumalbumin) under forskjellige forstyrrelser (dvs. knockdown av gener som er av interesse, i forhold til ekspresjon av WT eller muterte gener, eller farmakologiske manipulasjoner) og sammenligne å styre celler.
Vi beskriver en innovativ strategi som kombinerer kvantifisering av MCS exocytose og fire (x, y, z, t) dimensjons kvantifisering av tidsforskjøvede tredimensjonal avbildning av SGS i levende celler ved hjelp av et reporter-gen for exocytose. Denne teknikken gjør at screening av familier av proteiner for deres innvirkning på MC-funksjon som overvåkings SGS begynner så tidlig som sin exit fra Golgi gjennom sin modning, oppkjøp av eksocytose kompetanse og degranulation. Kombinasjonen av målinger av eksocytose sammen…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. U. Ashery for gaven av NPY-mRFP cDNA. Vi takker legene. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, og Y. Zilberstein for uvurderlig hjelp med mikroskopi og bildeanalyser. Vi takker også Dr. Joseph Orly for kritisk lesing av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Israel Science Foundation, grunnlagt av Israel Academy for Sciences (1139-1112 til RS-E.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Confocal fluorescent microscope: | |||
Zeiss LSM 510 | |||
Leica | SP5 | ||
Nikon A1 inverted | |||
Imaris software | BITLANE | ||
Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
Other reagent: | |||
Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
Sodium chloride | MERK | 6404 | |
Calcium chloride | MERK | 2382 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
Sterile water |