Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

باستخدام الماوس الخلايا السرطانية الثديية لتعليم المفاهيم الأساسية الأحياء: وحدة مختبر بسيط

doi: 10.3791/52528 Published: June 18, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في كثير من الأحيان في دورات الأحياء الجامعية العامة، وتطرق موضوعات تنظيم دورة الخلية والسرطان ولكن ليس على دراسة مفصلة لأن اتساع نطاق المحتوى في هذه الدورات يترك القليل من الوقت للعمق. وبالإضافة إلى ذلك، لا يتم عادة يتعرض الطلاب الأحياء الجامعية للتقنيات المتقدمة المرتبطة بالثقافة الخلية الحيوانية. لمساعدة الطلاب على تطوير فهم أعمق لهذه المفاهيم، في حين أن تطبيق وتحليل ما تعلموه، تم تطوير النشاط مختبر بمثابة تعديل للمعهد والتر ريد للأبحاث (WRAIR) بمد النشاط المختبر 1. تستخدم وحدة المختبر لذلك، استراتيجية تدريجية التجريبية التي تشمل النمو وتميز نموذج الخلايا السرطانية وتطوير وتنفيذ أساليب عد الخلايا، وإقامة دورة الوقت الأمثل وجرعات لعلاج الخلايا مع عوامل مضادة للالتكاثري، وتحديد ممرات إشارة الخلية الشاذة . التجربة يسمح أيضا للفتحالتحقيق -ended.

معظم التقنيات اللازمة لهذا النشاط يمكن أن يتحقق في مختبر البيولوجيا تعليم نموذجي. يبدأ النشاط مع الطلاب تميز سعر الصرف ونمو الورم الماوس الثدي (MMT) خط الخلية، وهذا نموذج لسرطان الثدي البشري 2. وقد تم اختيار سرطان الثدي السرطان نموذج بسبب انتشاره في عدد السكان والألفة لطلاب كلية العمر، والبيانات واسعة النطاق المتاحة. تم اختيار خط الخلية MMT على وجه التحديد لأنه يمكن الحصول عليها بسهولة، وتتميز بشكل جيد، لديه الوقت تضاعف قصيرة وسهلة في النمو. بالإضافة إلى ذلك، خلايا MMT هي التي تتفق مع معظم سرطانات الثدي الإناث تعتمد على هرمون الاستروجين. الطلاب ثم تحديد مسارات إشارة الخلية الشاذة في الخلايا MMT عن طريق علاج الخلايا مع أدوية العلاج الكيميائي الذي آلية عمل شيء على ما يرام established.The تركيز الأدوية وطول العلاج وتتنوع السماح للطلابلتقييم تأثير هذه المتغيرات على معدل انقسام الخلايا. مقايسة الرئيسي لهذا النشاط هو تحديد بقاء الخلية، الأمر الذي يتطلب ببساطة عد الخلايا، وذلك باستخدام واحدة من طريقتين. يعتمد كل أسلوب على مهارات الفحص المجهري قوية. الطلاب تحديد بقاء الخلية باستخدام معيار أو أسلوب عدادة الكريات وطريقة تصوير مجهري رواية واقتراح. وبناء على النتائج التي توصلوا إليها، فإنها يمكن أن تقترح واختبار تعديلات على النشاط. الطلاب ثم تمثل البيانات وتفسير النتائج إلى صقل فرضيتهم ووضع استراتيجيات تجريبية جديدة.

يناسب هذا النشاط مختبر للطالبة أو مستوى السنة الثانية طلاب تخصص في العلوم البيولوجية. ويتم تكثيف قبل أن تتحول إلى وحدة المختبر مدة أسبوع واحد يمكن أن تكتمل في السنة الأولى، البيولوجيا العام أو السنة الثانية الخلوية / الجزيئية علم الأحياء. المهارات اللازمة لاستكمال السليم للنشاط وتشمل العمليات الحسابية الأساسية والجبر، والألفة مع مجموعة من جالمهارات المختبرية خام (على سبيل المثال، pipetting ل، وصنع الحل، تقنية معقمة)، وتحليل البيانات، المجهر الضوئي وإدارة الوقت الأساسية، جنبا إلى جنب مع المعرفة مدرب الثقافة الخلية وبرنامج جداول البيانات. وتشمل الكواشف اللازمة نموذج خط الخلية الحيوانية لسرطان (مثل خلايا فأر الثدي السرطانية، MMT 2)، وكلاء العلاج الكيميائي (على سبيل المثال، تاموكسيفين، الكركمين، الميتفورمين، والأسبرين)، التريبان وسائل الإعلام ثقافة الزرقاء وخلية (على سبيل المثال، النسر الأساسية الدنيا والمتوسطة ؛ EMEM) مع المكملات الغذائية المناسبة (على سبيل المثال، الحصان المانحة والمصل البقري الجنين). وتشمل الأدوات اللازمة ضوء المجهر المقلوب مع المرفقات كاميرا رقمية، كمبيوتر، و 100 ملم و 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة، CO 2 حاضنة (أو ما يعادلها)، ومجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (BSC، من الدرجة الثانية)، عدادة الكريات، والبرمجيات المجهر الرقمي.

هناك أمثلة جيدة للأنشطة المختبر المحددة التي تعتمد على زراعة الخلايا الحيوانية لTEACالطلاب ح الجامعية حول المفاهيم في بيولوجيا الخلية 3. ومع ذلك تتطلب العديد من الإمدادات أو التقنيات التي لا يمكن الوصول إليها بسهولة (مثل النظائر المشعة، الأنسجة الحيوانية الحية، ومعدات التصوير المتقدمة 1،4،5)، يصف البروتوكولات التي هي متقدمة جدا (على سبيل المثال، ومناسبة لدورة مستوى 400 6)، أو يتطلب عدة أسابيع أو فصل دراسي مشاريع طويلة 6،7. النشاط المختبر الموصوفة هنا واضح وصريح ويمكن أن تتم في غضون أسبوع واحد مع معدات المختبرات المشتركة.

باختصار، هذه الوحدة مختبر يقدم بشكل فعال أو تعزز مفاهيم دورة الخلية، مسارات الإشارات الخلوية والسرطان في حين تدريس المهارات المعملية الأساسية والمتقدمة، وتحليل البيانات التجريبية، وطريقة زراعة الخلايا الحيوانية والعملية العلمية. وحدة المختبر هي بسيطة وسهلة اقتصاديا ويوفر المرونة وفرصة لتحقيق مفتوح. يشجع النشاط الإبداع طالبمن خلال توفير استراتيجية التجريبية القالب الذي يعمل كدليل لكنها ليست وصفة. الأهم من ذلك، يرضي النشاط كافة المجالات تعلم من الزهور تصنيف 8 كما يتطلب التذكر، الفهم، التطبيق، التحليل وتقييم وخلق من خلال إشراك الطلاب في عملية تسحب منهم من الكتب المدرسية وإلى عالم البحث العلمي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظات: السلوك عن العمل مع الخلايا والكواشف ثقافة خلية في مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية (BSC) 9. تصنف الخلايا MMT كما السلامة الأحيائية المستوى الأول، لأنها تشكل منخفض إلى متوسط ​​المخاطر البيولوجية. تطبيق إجراءات التنظيف والتطهير المناسبة لBSC بين الاستخدامات (على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية، و 70٪ من الإيثانول مسح أسفل).

1. تنمو الخلايا MMT

  1. زراعة خلايا في 10 سم أطباق زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام المغذيات الغنية التي تتكون من النسور الحد الأدنى الضروري المتوسطة (EMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، 2 ملي الجلوتامين، و 1٪ فطري / المضادات الحيوية (البنسلين 10 وحدة ، 100 ميكروغرام الستربتومايسين، 0.25 ميكروغرام الأمفوتريسين B). زراعة خلايا في ترطيب 5٪ CO 2 غرفة، عند 37 درجة مئوية. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3.6 × 10 6 خلية / سم 2 (انظر عد الخلايا في الخطوة 2).
  2. استبدال نصف وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع وسائل الاعلام جديدة كل 48 ساعة نتحدث عنه اليوموفاق سطيف يذكر خلاف ذلك. تحقق بقاء الخلية ومورفولوجيا عن طريق الفحص مع المرحلة مقلوب المجهر ضوء التباين.
    1. لاحظ وتميز الخلايا للحجم وهيكل والشكل والتنظيم والعدد المقدر تحت 100 - 200X التكبير. في هذه الكثافة، يجب أن تظهر الخلايا في طائرة واحدة، وليس تجمعت فوق بعضها البعض وعلى مقربة. تتكون كل خلية من خلايا سميكة، وجوهر كروية مع رقيقة، طويلة، ملحقات مثل فرع توسيع منه أن يأتي إلى نقطة (انظر الشكل 1).
  3. تقسيم الخلايا عندما تصل إلى كثافة الخلايا 7.2 × 10 6 خلية / سم 2. خلايا يحمل نسبة مضاعفة من 1.8 × 10 6 خلية / سم 2 لكل 24 ساعة. تعيين الخلايا مرور X (مقصف) للدلالة على عدد المرات التي تم تقسيمها.
    1. في الجيل 3 (أي بعد ثلاثة مقاطع، P3)، والحصاد، العد، ولوحة الخلايا على لوحة الثقافة 24 الأنسجة بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 3.6 × 10 6 2.
  4. عرض الخلايا كل يوم وphotomicrographs الرقمية القياسية. ملاحظة ووصف مورفولوجيا الخلايا (أي الحجم والشكل والخصائص الانعكاسية الخفيفة). تحديد الخلية مضاعفة الوقت عن طريق عد الخلايا بشكل منتظم والمتعلقة الوقت المنقضي لعدد الخلايا.

2. عدد الخلايا MMT

ملاحظة: عد الخلايا لتحديد ما إذا كان هناك حاجة الخلايا المراد subcultured، لإعداد لتجربة أو لتحديد بقاء الخلية. هناك نوعان من الأساليب المقدمة هنا.

  1. استخدام عدادة الكريات، وهي تقنية القياسية لحساب الخلايا.
    1. الحصول على عدادة الكريات خط مشرق، حل 0.2٪ من صبغة التريبان الأزرق، المجهر ضوء مركب، وأنابيب الاختبار العقيمة، الماصات وعداد خلية اليدوية.
    2. تحت BSC، واستخدام ماصة 10 مل لإزالة الخلايا من صحن 10 سم زراعة الأنسجة. إذا نمت الخلايا على 24 لوحة جيدا استخدام ماصة 1 مل أو 1000 micropipette ميكرولتر لإزالة وسائل الإعلام.
    3. ضع تعليق الخلية مما أدى إلى 15 مل أنبوب معقم (أو 1 مل الطرد المركزي الجزئي أو غيرها من أنبوب حجم صغير). خلاف ذلك، وترك الخلايا في الأصلية لوحة زراعة الأنسجة / جيد.
    4. تحت BSC، والجمع بين 10 ميكرولتر من تعليق زنزانة مع 10 ميكرولتر من محلول أزرق التريبان (نسبة 1: 1) في أجهزة الطرد المركزي الصغيرة غير معقمة أو غيرها من أنبوب حجم صغير.
      ملاحظة: أزرق التريبان وصمة الحيوية التي لم يتم استيعابها من قبل خلايا قابلة للحياة صحية. عندما تلف الخلايا أو ميت، الأزرق التريبان يمكن أن تدخل الخلية مما يسمح للخلايا الميتة ليتم احتساب (ويعرف أيضا باسم صبغ طريقة الاستبعاد). لذا تحت المجهر والخلايا الميتة تظهر الأرجواني الداكن بينما خلايا قابلة للحياة هي لامع وخفيف في اللون.
    5. احتضانفي RT لمدة 5 دقائق.
    6. ضع زلة تغطية على عدادة الكريات. تطبيق 10 ميكرولتر من التريبان الخلية الزرقاء تعليق الخليط في الأخدود. عرض عدادة الكريات في 100 - 200X التكبير. A شبكة أربع الزاوية هو واضح (انظر الشكل 2).
    7. حساب عدد خلايا قابلة للحياة (غير ملوثين) مقابل مجموع الخلايا في كل منطقة الشبكية. متوسط ​​الشبكات الأربع وتتضاعف بحلول 1 × 10 4 للحصول على خلايا / مل.
      1. استقراء العدد الكلي للخلايا في طبق (أو خلية / سم 2). استخدام هذا الرقم إما تحديد حجم الصحيح لتعليق الخلية لاستخدام البذور لوحة زراعة الأنسجة الجديدة في الكثافة المطلوبة من 3.6 × 10 6 خلية / سم 2 أو تحديد العدد الكلي للخلايا قابلة للحياة على لوحة أو في البئر.
        ملاحظة: للحصول على إرشادات إضافية بشأن استخدام عدادة الكريات، انظر 10.
  2. استخدام البرمجيات وكاميرا رقمية لحساب خلايا قابلة للحياة.
    1. الحصول على ديكاميرا gital والبرامج المصاحبة لها، وإيجاد حل 0.4٪ من صبغة التريبان الأزرق، المجهر ضوء مركب، وأنابيب الاختبار العقيمة، الماصات وجهاز كمبيوتر.
      ملاحظة: كاميرا رقمية Moticam 2000 مع المرافق Motic البرمجيات يعمل هنا. وينبغي أن يكون أي كاميرا قابلة للمقارنة والبرمجيات كافية. تأكد من أن برنامج الكاميرا الرقمية تم معايرة مقدما (وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة).
    2. تحت BSC، استخدم 1 مل الماصة أو 1000 ميكرولتر micropipette لإزالة وسائل الإعلام من الخلايا MMT المتزايد في 24 طبق جيدا زراعة الأنسجة. غسل الخلايا الملتصقة من خلال تطبيق بلطف كمية صغيرة (حوالي 500 ميكرولتر) من تستكمل الامم المتحدة (أي EMEM دون أي إضافات) وسائل الإعلام الجديدة على لوحة ثم إزالته. تطبيق 10 ميكرولتر من 0.2٪ التريبان الأزرق (الذي أدلى به تمييع 1: 1 مع الامم المتحدة وتستكمل EMEM) مباشرة إلى البئر.
    3. احتضان لوحة في RT لمدة 5 دقائق.
    4. عرض لوحة تحت المجهر في 100 - 200X التكبير ثإيث تعلق كاميرا رقمية. يمكن غسلها لوحة مع وسائل الإعلام unsupplemented إذا تلطيخ مع 2٪ أزرق التريبان مظلمة جدا.
    5. فتح البرنامج على الكمبيوتر والثانية التحقق من أن البرنامج يتم معايرة للهدف المستخدمة من خلال علامة التبويب إعدادات. يجب أن تظهر صورة لفوف.
    6. حدد الشبكة من علامة التبويب قياس. شبكة من المربعات تقريبا سوف 0.005 سم في العرض تظهر. حدد شبكة معلومات لتأكيد مساحة كل مربع.
    7. اختيار منطقة معينة من الشبكة لعدد الخلايا (أي 5 مربعات × 9 مربعات). حدد مستطيل من علامة التبويب قياس. انقر فوق الزاوية من الساحة واسحب المؤشر ليشمل الساحات في الاختيار.
      ملاحظة: سوف الظل الأخضر تغطي الساحات الاختيار ومربع أبيض سيظهر في الزاوية التي توفر العرض والطول، المنطقة، ومحيط قسم من الشبكة المختارة (انظر الشكل 3).
    8. حساب عدد viabخلايا جنيه داخل منطقة محددة. نفعل نفس الشيء بالنسبة موقعين آخرين في نفس البئر أو لوحة بتحريك لوحة تحت المجهر.
    9. مما لا شك فيه أن منطقة قياس هو نفسه ولم يتغير التكبير. حساب متوسط ​​عدد خلايا قابلة للحياة في المنطقة. باستخدام مجال البئر (لمدة 24 لوحة جيدا، وأيضا واحدة تبلغ مساحتها 2 سم على 100 ​​ملي طبق المنطقة هي 78.6 سم 2)، استقراء عدد من خلايا قابلة للحياة من المنطقة المحددة في الشبكة ل العدد الكلي للخلايا داخل البئر (خلية / سم 2).

3. علاج الخلايا MMT مع وكلاء مكافحة التكاثري

  1. إعداد الحلول للعملاء اختيار مكافحة التكاثري العلاجي (تاموكسيفين، الكركمين والميتفورمين) والمخدرات اختياري، والأسبرين تحت BSC.
    1. حل الكركمين وتاموكسيفين في الإيثانول بنسبة 100٪ لتوليد تركيز الأسهم من 27 ملي. حل الميتفورمين والأسبرين في unsupplementإد EMEM لتوليد تركيز الأسهم من 500 ملي و 15 ملي، على التوالي.
  2. إنشاء الاستجابة للجرعة.
    1. علاج الخلايا MMT مع وكلاء ثلاثة مكافحة التكاثري العلاجي (تاموكسيفين، الكركمين والميتفورمين) والاختيارية المخدرات (الأسبرين) بتركيزات متفاوتة لمدة 96 ساعة لتوليد منحنى الاستجابة للجرعة. في البداية إدارة جميع الأدوية في مجموعة من تركيزات استنادا إلى تقارير نشرت 1،11-16 ثم بتركيزات أكبر أو أصغر من تلك التي نشرت.
      ملاحظة: يحدد الاستجابة للجرعة الحد الأدنى للتركيز الدواء اللازمة لتحقيق النتائج المرجوة. هنا النتيجة المرجوة هي انخفاض في تكاثر الخلايا بالمقارنة مع السيطرة.
      1. لتاموكسيفين والكركمين، استخدام تركيزات (وحدات التخزين المقابلة) من 0.054 ملم (1 ميكرولتر)، 0،108 ملم (2 ميكرولتر)، 0،162 ملم (3 ميكرولتر) و0.216 مم (4 ميكرولتر).
      2. للميتفورمين، واستخدام تركيزات (وحدات التخزين المقابلة) 2 مم (2 ميكرولتر)، 4 مم (4 ميكرولتر)، 6 ملم (6 ميكرولتر)، 8 ملم (8 ميكرولتر) و 10 مم (10 ميكرولتر).
      3. لالأسبرين، استخدام تركيزات (وحدات التخزين المقابلة) من 0.030 ملم (1 ميكرولتر)، 0.060 ملم (2 ميكرولتر)، 0،099 ملم (3.3 ميكرولتر)، 0،150 ملم (5 ميكرولتر)، و0.216 ملم (6.7 ميكرولتر).
    2. تقسيم الخلايا MMT من صحن 10 سم على 24 لوحة جيدا بتركيز 3.6 × 10 6 خلية / سم 2. تحديد تركيز الخلية الأولي من جانب كل وسائل خلية العد (الخطوة 2). دعوة جديدة هذا وحة 24 بئر خلايا "يوم سبليت".
    3. 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، وعلاج الخلايا MMT مع كل من العوامل العلاجية لمكافحة التكاثري، تاموكسيفين، الكركمين، الميتفورمين والأسبرين، في تركيزات هو موضح في الخطوة 3.2.1. أشير إلى هذا النحو "يوم 0".
      1. كما كل بئر يمكن أن تعقد بحد أقصى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام، بال micropipettes استخدام مع نصائح micropipette معقمة ومعلومات جديدة في كل مرة يتم التعامل بئر جديدة لتجنب كرتلوث برمجيات المصدر المفتوح. استخدام اثنين من الآبار والضوابط: الخلايا المزروعة في غياب أي علاج المخدرات (المراقبة السلبية) والخلايا المزروعة في وجود الإيثانول بنسبة 100٪ (مراقبة المذيبات).
    4. تنمو الخلايا وإعادة إدارة المخدرات في تركيزات صفها عندما يتم تغذية الخلايا كل يوم (انظر الخطوة 1.2) لمدة 96 ساعة (حتى يوم 4) في أيام 1 - 4 من العلاج، ومراقبة الخلايا تحت المجهر والعد باستخدام الأسلوب في الخطوة 2.2 (انظر الشكل 4).
    5. تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.
    6. تحديد تركيز الأمثل لكل المخدرات عن طريق الرسوم البيانية العلاقة بين بقاء الخلية وجرعة المخدرات على طول التجربة (انظر الشكل 5).
  3. إقامة دورة الوقت.
    1. علاج الخلايا MMT مع العوامل العلاجية لمكافحة التكاثري الثلاثة (تاموكسيفين، الكركمين والميتفورمين) في تركيز ثابتة لفترات زمنية متفاوتة. استخدام identif تركيز الأمثلالعبوات الناسفة خلال التجارب الاستجابة للجرعة (انظر الخطوة 3.2).
      1. استخدام تركيزات التالية: 0.216 مم تاموكسيفين، 0،216 ملم الكركمين و 10 ملي الميتفورمين.
        ملاحظة: يحدد دورة الوقت مقدار الوقت اللازم للدواء لإنتاج الأمثل نتيجة المرجوة. هنا، والنتيجة المرجوة هي انخفاض في تكاثر الخلايا بالمقارنة مع السيطرة.
    2. تقسيم الخلايا MMT من صحن 10 سم على 24 لوحة جيدا بتركيز 3.6 × 10 6 خلية / سم 2. تحديد تركيز الخلية الأولي من جانب كل وسائل خلية العد (الخطوة 2). دعوة جديدة هذا وحة 24 بئر خلايا "يوم سبليت".
    3. 24 ساعة بعد طلاء الخلايا، وعلاج الخلايا MMT مع كل من العوامل العلاجية لمكافحة التكاثري، تاموكسيفين، الكركمين، الميتفورمين والأسبرين، في تركيزات المثلى التي تم تحديدها في الخطوة 3.2. أشير إلى هذا النحو "يوم 0".
      1. حيث أن كل جانب يمكن أن تعقد بحد أقصى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام، لنابال micropipettes ه مع نصائح micropipette معقمة ومعلومات جديدة في كل مرة يتم التعامل بئر جديدة لتجنب التلوث المتبادل.
      2. استخدام اثنين من الآبار والضوابط: الخلايا المزروعة في غياب أي علاج المخدرات (المراقبة السلبية) والخلايا المزروعة في وجود الإيثانول بنسبة 100٪ (مراقبة المذيبات).
  4. تنمو الخلايا وإعادة إدارة المخدرات في تركيز المحددة عند ويتم تغذية الخلايا كل يوم (انظر الخطوة 1.2) لمدة 96 ساعة (حتى يوم 4). في الأيام 1-4 من العلاج، ومراقبة الخلايا تحت المجهر والعد باستخدام الأسلوب في الخطوة 2.2 (انظر الشكل 4).
  5. تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.
  6. تحديد الوقت الأمثل التعرض للخلايا MMT إلى كل المخدرات عن طريق الرسوم البيانية العلاقة بين بقاء الخلية وطول (الوقت) من العلاج من تعاطي المخدرات في تركيز المحدد (انظر الشكل 6).

4. مختبر وحدة

ملاحظة: فيما يلي ليوم 5جدول مختبر لمختبر وحدة. الشكل 7 هو مخطط تدفق ما الجدول الزمني يستتبع خلال 5 أيام. لهذا النشاط أن تكتمل في غضون خمسة أيام يتم إنشاء أي دورة زمنية أو منحنى الاستجابة للجرعة. ليس هناك وقت كاف لتوليد كل من المنحنيات. ووصف تجربة الاستجابة للجرعة أدناه. تجربة بالطبع الوقت يمكن أن يكون متبادل بسهولة

  1. تقسيم الصف إلى مجموعات: لدينا مجموعة واحدة تؤسس الاستجابة للجرعة وغيرها من مجرى وقت اختيار تركيز في منتصف تركيزات الاستجابة للجرعة المقترحة.
    1. الحفاظ على الثقافات كافية والمخزونات المخدرات بتركيزات مناسبة. ما لم يذكر خلاف ذلك، أداء كل الأعمال تحت BSC.
  2. اليوم 1
    1. الطلاب مباشرة لجعل وسائل الإعلام وتنمو الخلايا (كما في الخطوة 1).
    2. كما طالب الحصول على مخزون من خلايا MMT على 10 سم لوحة، وتوجيه الطلاب لإعداد وسائل الاعلام زراعة الخلايا وإعطاء دروس في استخدام hemocytomeثالثا، المجهر الرقمي والرقمية برنامج الكاميرا المجهر (كما في الخطوة 2).
    3. معايرة البرنامج لأهداف المستخدمة في المجهر (على سبيل المثال، 4X، 10X، 20X) الآن باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة.
  3. يوم 2
    1. اطلب من الطلاب تأكيد مجموع عدد الخلايا وبقاء الخلية (كما في الخطوة 2).
    2. اطلب من الطلاب عد الخلايا على طبق 100 ملم باستخدام كل برنامج الفحص المجهري والأساليب عدادة الكريات، لتأكيد ويتم الحصول على نتائج مماثلة.
    3. الطلاب مباشرة للحصول على 24 لوحة وانقسام الخلايا بشكل جيد من 100 مم طبق على 24 لوحات جيدة للالمطلوبة بدءا كثافة الطلاء خلية (كما في الخطوة 1). ويعتبر هذا اليوم سبليت. وضع لوحة 24 جيدا في حاضنة الثقافة خلية لمدة 24 ساعة.
  4. اليوم 3
    1. زراعة خلايا MMT لمدة 24 ساعة على 24 لوحة جيدا. اطلب من الطلاب مراقبة الخلايا تحت المجهر والعد باستخدام برنامج المجهر (كما في الخطوة 2).
    2. إعطاء الطالب / الشركة المصرية للاتصالاتأنا عينات من مخزون الدواء لعلاج السرطان. يتسنى لهم التحضير وتمييع الحل المخزون الأصلي (كما في الخطوة 3). إضافة تركيزات مختلفة من المخدرات إلى زنازينهم لإنشاء منحنى الاستجابة للجرعة. وهذا ما يسمى اليوم 0.
    3. احتضان الخلايا (الخطوة 1.2) مع الأدوية لأقصى 48 ساعة.
  5. اليوم 4
    1. اطلب من الطلاب مراقبة الخلايا المعالجة بعد 24 ساعة. هذا هو يوم 1.
    2. عد كل بئر باستخدام برنامج المجهر. ويمكن إجراء الصور سجل كل بئر بحيث عد خارج المختبر (كما في الخطوة 2).
    3. احتضان الخلايا (الخطوة 1.2) مع الأدوية لمدة 24 ساعة أخرى.
      ملاحظة: يوفر مدرس الدروس والاستعراضات لتحليل البيانات وعرض رسومية إضافية. يتعلم الطلاب لخلق شخصيات والمؤامرات، والتحليل الإحصائي لليوم التالي لجمع البيانات.
  6. اليوم 5
    1. اطلب من الطلاب معاملة الخلايا بعد 48 ساعة، يوم 2.
    2. عد كلجيدا باستخدام برنامج المجهر. ويمكن إجراء الصور سجل كل بئر بحيث عد خارج المختبر (كما في الخطوة 2).
    3. الحصاد وجمع الخلايا لحساب من طريقة عدادة الكريات التقليدي كوسيلة للتحقق من قدرة الطالب على الاستخدام الفعال لطريقة البرنامج المجهري (كما في الخطوة 2).
      ملاحظة: جمع البيانات واستخلاص استنتاجات أو مراجعة الفرضيات، وفقا لذلك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تزايد الخلايا MMT ومقارنة أساليب العد.

كانت تزرع بنجاح الماوس الخلايا السرطانية الثديية وتتميز (الشكل 1)، ورواية أسلوب العد الخلية تطويرها باستخدام Motic البرامج، برنامج حاسوبي المرتبطة كاميرا رقمية للالمجهر. وتمت مقارنة هذه الطريقة الجديدة العد الخلية إلى طريقة العد التقليدي توظيف عدادة الكريات (الشكل 2)، وتبين أن تكون دقيقة على قدم المساواة في تحديد عدد الخلايا (الجدول 1). للسيطرة على أي آثار على عدد الخلايا بسبب ظروف النمو المختلفة أو نوع من الخلايا، وأجريت مقارنة بين طريقتين عد الخلايا في وجود وغياب العوامل المضادة للالتكاثري ومع خط مختلفة من الخلايا، ونموذج PC12 الخلايا العصبية (17).

ويبين الشكل 3 ترسيم المنطقة لعد الخلايا مع هذا الأسلوب باستخدام شبكة فرضه من definأبعاد إد. وضعت الشبكة أكثر من مجال الرؤية (فوف) ومن ثم يتم تطبيق إطار أخضر على طول المعينة وعرض الشبكة (أي مربعات 9x5). يتم عد الخلايا ضمن الإطار الأخضر ويتم استقراء عدد من الخلايا، كما نوقش في البروتوكول.

علاج الخلايا MMT: تحديد الاستجابة للجرعة الخلايا MMT إلى العوامل المضادة للالتكاثري.

أجريت دراسات الاستجابة للجرعة (الشكل 4) لكل عامل مضاد للالتكاثري. طوال وجمعت هذه البيانات التجارب باستمرار ومراجعتها وتحليلها لمعرفة ما إذا كان هناك ما يبرر إمكانية إدخال تنقيحات على بروتوكول. وقد أجريت التجربة ثلاث مرات، مع كل دراسة تحقيق نتائج مماثلة. واستمرت التجارب لحين استيفاء جميع الخلايا الميتة أو قد آثار المخدرات استقر. وتعرض photomicrographs الرقمية النتائج في الشكل (4)، وقدمت تحليلا رسومية من تلك النتائجفي الشكل (5). وذكرت يتراوح تركيز الفعالة في أسطورة الشكل 4، على X-محور الشكل 5 و في قسم البروتوكول.

عند أدنى تركيز تاموكسيفين، و0.054 مم، كان هناك تثبيط قوية من نمو الخلايا، ما يقرب من 83٪ مقارنة مع الخلايا غير المعالجة (الشكل 4A). واصلت بقاء الخلية إلى الانخفاض مع زيادة تركيزات تاموكسيفين (الشكل 5A). تم تحديد الجرعة المثلى من عقار تاموكسيفين ليكون 0.216 ملي بسبب بعد وقوع 48 ساعة موت الخلايا كاملة في ذلك التركيز (الشكل 4A). ومن المثير للاهتمام أن هذه الانخفاضات في انتشار الخلايا تكشف أن هناك إشارة للمقاومة الخلوية لعقار تاموكسيفين، كما هو متوقع على أساس الأدب 18،19 مشددا على أن في المختبر نظم نموذج ولكن لا دائما تمثل تماما في أحداث الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، عندما يتناقض مع أدنى عطرتركيزات atment من الكركمين (الشكل 4B و 5A) والميتفورمين (الشكل 4C و5B)، وكان أقل تركيز تاموكسيفين ل9٪ و 50٪ أكثر فعالية في وقف انقسام الخلايا، على التوالي.

الكركمين أظهرت تأثير تعتمد التركيز على تثبيط انقسام الخلايا كذلك. مع زيادة تركيزات، كان هناك انخفاض ملحوظ في الخلية الجدوى (الشكل 4D و 5A). تم تحديد الجرعة المثلى من الكركمين أن يكون 0،216 ملم لأنه بعد 48 ساعة، مثل تاموكسيفين، كان هناك موت الخلايا الكامل في ذلك التركيز.

أسفرت علاج الميتفورمين أقل انخفاضا كبيرا في بقاء الخلية MMT، مما أدى إلى تخفيض 33٪ في أقل تركيز. ولوحظ وجود انخفاض يصاحب ذلك في بقاء الخلية مع زيادة تركيز الميتفورمين (الشكل 4C و5B). تم تحديد الجرعة المثلى من الميتفورمين إلى أن أعلى تركيز اختبار (10 مم). مقارنة مع عقار تاموكسيفين والكركمين، كلاهما يستخدم بشكل روتيني وكلاء العلاج الكيميائي، وكان الميتفورمين 30-40٪ أقل فعالية في تثبيط دورة الخلية. ومن المثير للاهتمام، وكانت آثار الميتفورمين على انقسام الخلايا مطابقة لتلك التي حصلت عليها الإدارة من الأسبرين (الشكل 4D و 5A)، وهو دواء الصفصاف مع عدم وجود آلية واضحة المعالم لتثبيط نمو الخلايا.

علاج الخلايا MMT: تحديد مسار الوقت للاستجابة MMT الخلوية لمضادات التكاثري.

وقد أجريت الدراسة دوام أيضا لكل عامل مضاد للالتكاثري لأن الجرعة الفعالة للدواء تدار قد تتأثر وقت التعرض. لأن هذا وحدة فحوصات لبقاء الخلية، فمن المهم أولا تحديد مدى سرعة انقسام الخلايا (مضاعفة الوقت) حتى نافذة منطقي لطول الفترة الزمنية تتعرض الخلايا لويمكن اختيار الأدوية. ومن الضروري، بالتالي، أن MMT الوقت تضاعف الخلية تكونتأكدت عندما تميز في البداية الخلايا. طوال هذه التجارب، تم جمع البيانات باستمرار ومراجعتها وتحليلها لمعرفة ما إذا كان هناك ما يبرر إمكانية إدخال تنقيحات على بروتوكول. وقد أجريت التجربة ثلاث مرات، مع كل دراسة تحقيق نتائج مماثلة. واستمرت التجارب لحين استيفاء جميع الخلايا الميتة أو قد آثار استقر.

كشفت دراسات دوام ان علاج الخلايا MMT مع تركيزات الأمثل لكل عقار مضاد للالتكاثري (عقار تاموكسيفين 0.216 مم، الكركمين 0.216 مم، الميتفورمين 10 ملم) لمدة 96 ساعة أدى إلى موت الخلايا كامل أو التسوية الخروج من آثار المخدرات ( الشكل 6). على الرغم من أن الأسبرين، عقار "اختيارية"، لم تؤثر على بقاء الخلية في الدراسات الاستجابة للجرعة لدينا، كان تأثير طفيف، وبالتالي لم تدرج في الدراسات بالطبع الوقت.

الشكل 1
الشكل 1. الخلايا MMT. مجهرية رقمية من "سليم"، والماوس غير المعالجة الثدي السرطانية (MMT) الخلايا المزروعة بنسبة 3.6 × 10 6 خلية / سم 2 في تعديل النسور الحد الأدنى الضروري المتوسطة (EMEM) .100X، على نطاق و= 0.2 ملم، أشار من قبل شريط أبيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2

الرقم 2. شبكة عدادة الكريات. صورة مجهرية من شبكة عدادة الكريات، 100X. قسم شبكة بأكمله هو مبين في الدائرة (فوف). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

ديزيل / ftp_upload / 52528 / 52528fig3.jpg "/>

الرقم 3. تسمية منطقة العد مع برنامج Motic.   صورة من شبكة تراكب على مجال الرؤية ومنطقة محددة لعد الخلايا MMT أنشئت مع برنامج Motic كما يتضح من خلال المجهر. 100X، وحجم = 0.2 ملم، وأشار شريط أبيض. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. استجابة جرعة من الخلايا MMT إلى العوامل المضادة للالتكاثري. photomicrographs الرقمية الخلايا MMT تزرع في وجود عوامل مضادة للالتكاثري بتركيزات متفاوتة لمدة 96 ساعة. تاموكسيفين: (A1) 0.054 مم (A2) 0.108 مم (A3) 0.162 مم (A4) 0.216 ملم. الكركمين: (B1) 0.054 مم (B2) 0.108 مم (B3) 0.162 مم (B4) 0.216 مم؛ الميتفورمين: (C1) 2 مم (C2) 4 ملم (C3) 6 ملم (C4) 8 مم (C5) 10 مم؛ الأسبرين: (D1) 0.030 مم (D2) 0.060 مم (D3) 0.099 مم (D4) 0.150 مم (D5) 0.216 ملم. الإيثانول (100٪) وغير المعالجة على حد سواء الضوابط. 100X، وحجم = 0.1 ملم، وأشار الخطوط الزرقاء التي تشكل كل مربع داخل الشبكة. انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5 A

الرقم 5 B

الرقم 5. تمثيل رسومي من التجارب الاستجابة للجرعة الخلايا MMT إلى العوامل المضادة للالتكاثري. آثار زيادة تركيزات الأدوية المضادة للالتكاثري (A) تاموكسيفين، الكركمين، والأسبرين، و (B) ميتفورمين على بقاء الخلية MMT. النتائجإعادة كنسبة مئوية من السيطرة عليها بعد 48 ساعة من العلاج، على الرغم من أن العلاج بالخلايا استمرت لمدة 96 ساعة. ن = 3، يشار STD.

الشكل (6)
الرقم 6. التمثيل البياني التحليل مدار الساعة من MMT استجابة الخلايا للمضادات التكاثري. الوقت دراسة مسار آثار تاموكسيفين (0.216mM)، الكركمين (0.216mM)، والميتفورمين (10 ملم) على بقاء الخلية MMT أكثر من 96 ساعة. يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من السيطرة عليها بعد 48 ساعة من العلاج. المعروضة هنا هي نتائج التجربة التمثيلية، ن = 1.

الرقم 7
الرقم 7. مخطط تدفق حدة المختبر لمدة 5 أيام.

نوع من الخلايا المخدرات Administereد يوم للتجربة تركيز الدواء عدد الخلايا مع Motic عدد الخلايا مع عدادة الكريات
MMT دون علاج يوم 2 - 7.8x10 4 خلية / سم 2 8.0x10 4 خلية / سم 2
MMT الإيثانول يوم 2 10 ملي 7.1x10 4 خلية / سم 2 7.2x10 4 خلية / سم 2
MMT تاموكسيفين يوم 2 0.216 MM 0 خلية / سم 2 0 خلية / سم 2
MMT تاموكسيفين يوم 2 0.054 مم 1.3x10 4 خلية / سم 2 1.5x10 4 خلية / سم 2
MMT الكركمين يوم 2 0.054 مم 1.9x10 4 جملتعلمي اللغة اإلنكليزية / سم 2 2.0x10 4 خلية / سم 2
MMT الكركمين يوم 2 0.216 مم 0 خلية / سم 2 0 خلية / سم 2
MMT الميتفورمين يوم 2 2 مم 5.1x10 4 خلية / سم 2 5.2x10 4 خلية / سم 2
MMT الميتفورمين يوم 2 6 مم 3.4x10 4 خلية / سم 2 3.5x10 4 خلية / سم 2
MMT الأسبرين يوم 2 0.099 مم 2.8x10 4 خلية / سم 2 3.0x10 4 خلية / سم 2
PC12 دون علاج الانقسام - 2.5x10 4 خلية / سم 2 2.1x10 4 خلية / سم 2

الجدول 1. مقارنة عدادة الكريات والبرمجيات Motic طرق العد نتائج العد خلية من خلايا MMT، باستخدام البرمجيات Motic أو الأساليب عدادة الكريات. كلا احصي الخلايا غير المعالجة والمعالجة، فضلا عن خط الخلية مختلفة، PC12، كمجموعة تحكم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويرد وحدة المختبر الذي يهدف إلى تعليم مجموعة متنوعة من المواضيع في بيولوجيا الخلايا عن طريق تقنيات متقدمة للثقافة الخلية الحيوانية. وحدة تحقق ذلك من خلال تحليل الآثار المترتبة على عدد من المواد الكيميائية المضادة للالتكاثري على تكرار الخلايا التي نموذج سرطان الثدي البشري. ويعتمد الفحص بشكل أساسي على تقنية الأساسية العد الخلية ويقدم طريقة جديدة لحساب الخلايا باستخدام برنامج المجهر. ويمكن إجراء الأنشطة التي تضم وحدة من الأجهزة والمعدات المتاحة في معظم برامج علم الأحياء. يمكن تنفيذها على حدة في الجدول 5 أيام مع اللوازم التي هي غير مكلفة ويمكن الحصول عليها بسهولة. على الرغم من أن يستخدم علامة تجارية معينة من الكاميرا المجهر والمجهر الرقمي البرامج هنا (Motic البرمجيات)، وينبغي أن أي كاميرا قابلة للمقارنة والبرمجيات تكفي.

هذه الوحدة مختبر تستخدم الخلايا MMT كنموذج لسرطان الثدي البشري. يتم تدريس الطلاب لأول مرة على النمو وتميز هذهالخلايا في الثقافة. من المهم التأكيد على أن النجاح في إنجاز هذه الوحدة المختبر يتطلب المحققين (ويعرف أيضا باسم الطلاب) أن معرفة جيدة مع مظهر وسلوك الخلايا MMT صحية، خاصة وأن خلايا MMT غير المعالجة بمثابة الضوابط. توصيف دقيق لذلك من أنماط نمو الخلايا، مضاعفة الوقت والتشكل العام للخلايا MMT ضروري إذا كانت الاستجابة للجرعة المناسبة والوقت بيانات بالطبع إلى أن ولدت.

مرة واحدة تتميز، ثم تم اختبار الخلايا MMT لاستجابتها لمختلف العوامل المضادة للالتكاثري كوسيلة لتدريس موضوعات انقسام الخلايا، وتنظيم دورة الخلية، الإشارات الخلوية والسرطان. يستخدم بقاء الخلية لفهم تأثير هذه الأدوية على الخلايا. طريقة جديدة لعد الخلايا، وذلك باستخدام البرمجيات المرتبطة كاميرا رقمية محمولة المجهر، ويجري ويتم مقارنته مع الإجراء التقليدي القائم على عدادة الكريات عد للتحقق من دقتها. ثييوفر طريقة رواية اثنين من المزايا، والتي هي جديرة بالملاحظة بشكل خاص لأنه يستخدم في المختبرات التعليمية الجامعية. أولا، لأن الخلايا لا تحتاج إلى إزالتها من لوحة زراعة الأنسجة لالعد، هناك حاجة إلى وقت أقل لأداء الاختبار التجريبي الرئيسي. وهذا يسمح لعدد كبير من المتغيرات التجريبية لفحصها في وقت واحد وفي فترة زمنية محدودة. ثانيا، يوفر طريقة سجل رقمي للاستجابة الخلايا للعلاج تجريبي السماح للطلاب لتقييم النتائج وصقل استراتيجيتهم التجريبية خارج المختبر.

هناك العديد من القضايا أن نلاحظ عند تنفيذ كل من هذه الأساليب العد. أولا، وقبل عد الخلايا مع أي من الطريقتين، يتم تحضين الخلايا مع الأزرق التريبان للتمييز بين خلية قابلة للحياة وخلية ميتة. واخترقت الخلايا الميتة من صبغ وتظهر زرقاء داكنة، في حين أن خلايا قابلة للحياة مشرقة بيضاء. ومع ذلك، إذا يتم تحضين الخلايا مع دىه بعد فترة حضانة الموصى بها، وأنها ستكون أكثر ملطخة والصعب التمييز. ثانيا، قد خلايا MMT تتجمع على عدادة الكريات أو لوحة زراعة الأنسجة ويكون من الصعب التعويل على حدة. لذلك، وصفناه بأنه "أجمة" لتحتوي على عدد معين من الخلايا (على سبيل المثال، 10 خلية / أجمة) وكل أجمة موجودة على الشبكة ثم يتم ضرب من قبل هذا العدد خلال العد. أخيرا، خلايا MMT التمسك السطح من الأطباق التي تزرع فيها. ولذا فمن الضروري أن تلمس طرف الماصة مباشرة إلى اللوحة عند إزالة الخلايا واستخدام القوة لتفريق كتل الخلايا وإزالة العديد من الخلايا من لوحة ممكن. ونتيجة لذلك بلدي يأخذ عدة محاولات للحصول على إجراء إحصاء دقيق عند استخدام الأسلوب التقليدي عدادة الكريات.

مع الخلايا تتميز بشكل جيد وأساليب عد التحقق، تجري تجربتين مختلفة؛ دراسة الاستجابة للجرعة من آثار تركيزات مختلفةالعقاقير المضادة للالتكاثري على انقسام الخلايا MMT والتجربة بالطبع الوقت لإلقاء الضوء على الوقت الأمثل التعرض لهذه الأدوية. هذه هي تجارب مفيدة للغاية حيث التجربة والخطأ أمر ضروري ومطلوب تطبيق علومه الابتدائية لإجراء تجربة ناجحة. على سبيل المثال، كشفت المحاولات الأولية لتوضيح استجابة جرعة من الخلايا MMT لهذه العوامل المضادة للالتكاثري أن التركيزات المختبرة كانت مرتفعة جدا، كما كان هناك موت الخلايا 100٪ في غضون 24 ساعة من تناول الدواء. أدى مراجعة موسعة من الأدب إلى مجموعة منقحة من تركيزات العلاج. هذا يعلم على نحو فعال الطلاب كيفية استخدام قواعد البيانات الأدب، وقراءة وتحليل ونقد مواد الأدب الابتدائية ويؤكد كيف أن هذه المهارات ضرورية للعملية العلمية.

وأظهرت نتائج الدراسات أن الاستجابة للجرعة عقار تاموكسيفين يسلك أقوى تأثير مضاد للالتكاثري في جميع التركيزات التي تم اختبارها. تاموكسيفين، مضاد للmitotiج المخدرات، ويستخدم على وجه التحديد باعتبارها العلاج المضاد للاستروجين لأمراض السرطان الحساسة هرمون الاستروجين، وعادة في سن اليأس، المرضى الذين يعانون حساسية هرمون 18-20. ويستخدم حاليا الدواء كعلاج للسرطان الثدي. تاموكسيفين تتنافس مع هرمون الاستروجين لمستقبلات هرمون الاستروجين داخل الخلايا، وعندما ملزمة، وينظم أسفل التعبير عن الحلقيات D و B، وهما منظمات هامة من مراحل دورة الخلية. النتائج التي تم الحصول عليها في النشاط تشير إلى أن عقار تاموكسيفين الرهينة بنجاح إلى مستقبلات هرمون الاستروجين وتحول دون تطور الخلية من خلال دورة الخلية، مما أدى إلى تكاثر الخلايا انخفضت الملاحظة. ومن المثير للاهتمام، وانخفاض في معدلات انتشار الخلايا MMT في جميع تركيزات من عقار تاموكسيفين تدار تكشف أي إشارة للمقاومة الخلوية لعقار تاموكسيفين، كما هو متوقع على أساس الأدب (انظر على سبيل المثال 19). هذا بمثابة تذكير جيد أن في المختبر الظروف التي أجريت التجربة أقوم يست نموذجا كاملان فيفو الظروف.

أدى العلاج الكركمين من خلايا MMT أيضا في الحد من بقاء الخلية. الكركمين هو مركب مشتق من جذر الكركم وبمثابة مثبط نمو الخلايا 12،16. وهو يعمل عن طريق المسار NF-B كابا وكربوكسيل الأورنيثين (شركة التنمية النفطية) النشاط التنظيم إلى أسفل. NF-B كابا هو مجمع البروتين الذي يتحكم النسخ من الجينات المضادة للأفكارك مثل TRAF1 وTRAF2، الذي رمز لالبروتينات التي تمنع موت الخلايا المبرمج. شركة التنمية النفطية هو الإنزيم الذي يحفز إنتاج الأمينات والبروتينات التي توفر الخلايا السرطانية مع تزايد مصادر التغذية مما يؤدي إلى نمو الخلايا المحسنة. المخدرات هي في الاستخدام الحالي لعلاج سرطان الثدي. وتأثيرات مضادة للالتكاثري من الكركمين يظهر بوضوح تأثير ذلك بانخفاض تنظيم مسار الإشارات الخلوية التي تنطوي NF-B كابا وكربوكسيل الأورنيثين تمت على انقسام الخلايا.

وقد لوحظ بقاء الخلية انخفاض مماثل مع الميتفورمين محطات الصرف الصحيالإقليم الشمالي. الميتفورمين، وهو دواء تدار عادة لمرضى السكري من النوع الثاني، تم اختياره بسبب التقارير المنشورة تشير إلى وجود علاقة بين المرضى الذين يأخذون ميتفورمين وانخفاض الإصابة بسرطان الثدي 15. ويعتقد أن وكيل يترنم ج-MYC الجين وبالتالي ينظم أسفل نشاط السيكلين D. يصل تنظيم الحلقيات، والجزيئات التي تكون بمثابة نقطة تفتيش في دورة الخلية والخلايا يسمح لتقدم من خلال دورة بمعدل أسرع مما أدى إلى زيادة انقسام الخلايا والنمو. آثار العلاج الميتفورمين على الخلايا MMT تظهر كيف يؤدي التحوير من الجينات ج-MYC أيضا إلى أسفل التنظيم من السيكلين D والحد من انقسام الخلايا. يجسد البيانات الميتفورمين كذلك كيف يمكن لدواء صمم لعلى شرط واحد في هذه الحالة Diabetes- قد يكون لها آلية عمل مناسبة لغيرها من الأحداث الفسيولوجية الشاذة. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المهم أن نؤكد أنه على الرغم من عقار تاموكسيفين، الكركمين، والميتفورمين كل تؤخر prolif الخلوي غير طبيعيeration من خلال آليات مختلفة، كل منها انخفض بنجاح سكان الخلية، وتدخلوا في انقسام الخلايا في المختبر.

هذه الوحدة يسمح أيضا للتحقيق مفتوح في أن دواء آخر، العلاج بالاعشاب، أو وكيل ويمكن اختبار. وقد تم اختيار الأسبرين، والإفراط في مكافحة مسكن، خافض للحرارة، والأدوية المضادة للالتهاب يستخدم لتخفيف ألم خفيف وخفض درجة الحرارة في هذه الوحدة. قدرة الأسبرين لتخفيف الالتهاب قد تمنع نمو الورم عن طريق إبطاء تطور الأوعية الدموية الجديدة التي تغذي عليها والتدخل في الخلايا الجذعية التي تغذي 11،13،14 نموها. ومن المثير للاهتمام، وإدارة الأسبرين إلى مليون طن الخلايا لم تسفر عن بعض الانخفاض في بقاء الخلية. ولا يعرف سوى القليل عن دور الأسبرين في الوقاية من السرطان والعلاج على الرغم من أن يتم الإبلاغ عن العديد من الدراسات المترابطة 13،14، وتوفير مثالا ممتازا على متلازم مقابل علاقات سببية.

الوقتكشفت دراسات بطبيعة الحال، عندما تدار في جرعات الأمثل، والعقاقير المضادة للالتكاثري هي فعالة للغاية في التداخل مع انقسام الخلايا في غضون 4 أيام من التعرض لها. كما توفر هذه الدراسات فرصة للطلاب لاستخدام ما تعلموه عن MMT خصائص نمو الخلايا عند وضع استراتيجية تجريبية لإجراء هذه التجارب. في الواقع، واصفا بدقة أنماط نمو الخلايا، ومضاعفة الوقت ومورفولوجيا الخلايا العام للخلايا MMT من الضروري لكل من البيانات الاستجابة للجرعة وبالطبع الوقت دقيقة.

كلا الاستجابة للجرعة والوقت: الدراسات التي تحدد العلاقة بين تركيز الدواء ووقت التعرض، على التوالي، وتأثير دواء لها في النظام البيولوجي. هذا هو وسيلة ممتازة للحصول على الطلاب التفكير في التفاعلات بين الجزيئات والمفاهيم الأساسية الأخرى في الكيمياء الحيوية أثناء إجراء التحقيق مدفوعة، الأنشطة البحثية. ومن الجدير بالذكر أنه منذ العديد من ثنائيةالتخصصات ology تخطط للذهاب إلى المدرسة الطبية، وهذه الوحدة مختبر متماشيا مع التغيرات وضعت حديثا في متطلبات كلية الطب 21.

ويمكن تنفيذ هذه الوحدة مختبر بالضبط كما هو موضح أو يمكن أن تستخدم بسهولة كقالب. ويمكن تضمين مجموعة من الاختلافات في هذا النشاط، مثل اختيار عامل مضاد للالتكاثري، نوع من الخلايا أو تعديل المغذيات في وسائل الإعلام النمو. طالما وضعت فرضية ان الاختبارات المفاهيم الأساسية والمتقدمة في الخلية أو البيولوجيا العام، والتباديل هذه الوحدة هي عديدة. بغض النظر عن التقليب، وتنفيذ هذا النشاط بشكل طبيعي يوجه الطالب لتعلم مجموعة كبيرة من التقنيات المخبرية وتصبح مألوفة مع مجموعة متنوعة من المعدات والأجهزة.

وباختصار، فإن وحدة المختبر الموصوفة هنا تسمح للطلاب للمشاركة الكاملة في عملية العلوم وتنمية قدراتهم على اكتساب وتحليل وبيانيا reprESENT البيانات، وصقل إدارة وقتهم ومهارات التعاونية. تم تصميم وحدة لتسهيل تحقيق مفتوح وقابل للتكيف بسهولة إلى العديد من الجداول الدراسية ومستويات المهارة. تجدر الإشارة إلى أن واضعي الأولين من هذه الورقة هي التخصصات الجامعية علم الأحياء، مما يدل بوضوح على أن هذه الوحدة مختبر مناسبة لهؤلاء السكان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تلقت الكتاب أي دعم مالي أو قابلة للمقارنة من Motic.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture Hood ESCO Labculture Reliant Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator CEDCO Model 1510
Bright-line Hemocytometer American Optical with two separate grids
Motic Images Plus Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman Rainin instrument co. inc P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope Olympus 4 objective inverted light microscope with camera
200 μl Pipet tips MidSci 40200C
1,000 μl Pipet tips MidSci AVR4
10 ml Seriological Pipets TPP TP94010
24 well plates CoStar- Tissue Culture Cluster 3524 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma T8154 100 ml, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz Sigma Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells ATCC CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) ATCC 30-2003 500 ml
Fetal Bovine Serum Sigma F0926 500 ml
Metformin Hydrochloride Sigma PHR1084 500 mg
Tamoxifen Sigma T5648 white or white-yellow powder
Curmumin Sigma C1386 yellow-orange powder
Aspirin Sigma A2093 meets USP testing specifications

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4, (3), 221-234 (2005).
  2. Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41, (6), 1315-1327 (1968).
  3. Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
  4. Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1, (3), 76-86 (2002).
  5. Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
  6. Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
  7. Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. usanD. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32, (5), 319-322 (2004).
  8. Anderson, L. W., et al. A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom's Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). Longman, London, England. (2001).
  9. Centers for Disease Contol and Prevention. Appendix A - Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. (2014).
  10. Davis, J. M. Basic Cell Culture: A Practical Approach. 2nd edn, Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  11. Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13, (5), 518-527 (2012).
  12. Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an 'old-age' disease with an 'age-old' solution. Cancer Lett. 267, (1), 133-164 (2008).
  13. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16, (1), 180 (2011).
  14. Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28, (4), 1308-1310 (2011).
  15. Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
  16. Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269, (2), 199-225 (2008).
  17. Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247, (1), 115-119 (1982).
  18. Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
  19. Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72, (21), 5625-5634 (2012).
  20. Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
  21. Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician--the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366, (14), 1265-1268 (2012).
باستخدام الماوس الخلايا السرطانية الثديية لتعليم المفاهيم الأساسية الأحياء: وحدة مختبر بسيط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).More

McIlrath, V., Trye, A., Aguanno, A. Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module. J. Vis. Exp. (100), e52528, doi:10.3791/52528 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter