Introduction
Spesso in corsi di biologia generale, di laurea, i temi della regolazione del ciclo cellulare e cancro sono toccati, ma non approfondite in particolare perché l'ampiezza del contenuto di questi corsi lascia poco tempo per la profondità. Inoltre, gli studenti di biologia universitari in genere non sono esposti alle tecniche avanzate associate a colture cellulari animali. Per aiutare gli studenti a sviluppare una più profonda comprensione di questi concetti, durante l'applicazione e l'analisi di ciò che hanno imparato, una attività di laboratorio è stato sviluppato come una modifica del Walter Reed Army Institute di Ricerca (WRAIR) ha esteso l'attività di laboratorio 1. Il modulo laboratorio utilizza una strategia di sperimentazione graduale che include crescere e caratterizzare un modello di cellula tumorale, lo sviluppo e l'esecuzione di metodi di conteggio delle cellule, che stabilisce decorso ottimale e dosaggi per il trattamento di cellule con agenti anti-proliferativi, e individuando percorsi di segnalazione cellulare aberranti . L'esperimento consente inoltre apertoRichiesta -ended.
La maggior parte delle tecniche necessarie per questa attività può essere realizzato in un tipico laboratorio di biologia insegnamento. L'attività inizia con gli studenti che caratterizzano il tasso di morfologia e di crescita della linea di cellule tumorali del mouse mammaria (MMT), un modello per il cancro al seno umano 2. Il cancro al seno è stato scelto come modello di cancro a causa della sua prevalenza nella popolazione, la conoscenza di studenti universitari età, ed i dati diffusi disponibili. La linea cellulare MMT è stato appositamente selezionato perché è facilmente ottenibile, ben caratterizzato, ha un tempo di raddoppio breve ed è facile da coltivare. Inoltre, le cellule MMT sono estrogeno-dipendente, che è in linea con la maggior parte dei tumori al seno femminile. Gli studenti poi identificare i percorsi di segnalazione cellulare aberrante nelle cellule MMT trattando le cellule con farmaci chemioterapici cui meccanismo d'azione è ben established.The concentrazione dei farmaci e la lunghezza dei trattamenti sono variati consentendo agli studentiper valutare l'effetto di queste variabili sul tasso di divisione cellulare. Il test chiave per questa attività è la determinazione della vitalità cellulare, che richiede semplicemente il conteggio delle cellule, utilizzando uno dei due metodi. Ogni metodo dipende forti competenze microscopia. Gli studenti di determinare la vitalità cellulare, utilizzando un normale metodo emocitometro e un metodo photomicroscopy romanzo e propongono. Sulla base dei loro risultati, che possono proporre e testare le modifiche all'attività. Gli studenti poi rappresentano i loro dati e interpretare i risultati per perfezionare la loro ipotesi e mettere a punto nuove strategie sperimentali.
Questa attività di laboratorio è adatto per matricole o livello sophomore studenti, la specializzazione in scienze biologiche. Si è condensato in un modulo di laboratorio di una settimana che può essere completato in un primo anno, biologia generale e secondo anno, cellulare / molecolare corso di biologia. Competenze necessarie per il corretto completamento dell'attività includono aritmetica di base e algebra, la familiarità con una serie di ccompetenze di laboratorio minerale (per esempio, pipettaggio, fabbricazione soluzione tecnica sterile), l'analisi dei dati, la microscopia ottica e la gestione del tempo di base, insieme con la conoscenza istruttore di coltura cellulare e software del foglio elettronico. Reagenti richiesti comprendono un modello linea di cellule animali per il cancro (ad esempio, il mouse mammari cellule tumorali, MMT 2), agenti chemioterapici (ad esempio, il tamoxifene, la curcumina, la metformina, e aspirina), trypan blu cultura e di cellule di supporto (ad esempio, Minimum Essential Medium dell'Aquila ; EMEM) con i supplementi adeguati (per esempio, a cavallo dei donatori e siero fetale bovino). Gli strumenti necessari sono un microscopio invertito luce con attacco fotocamera digitale, computer, 100 mm e 24 piastre di coltura dei tessuti e, di CO 2 incubatore (o equivalente), armadio biosicurezza (BSC; classe II), emocitometro, e il software di microscopia digitale.
Ci sono buoni esempi di specifiche attività di laboratorio che si basano su colture cellulari animali a Teacstudenti universitari h sui concetti di biologia cellulare 3. Tuttavia molti richiedono forniture o tecniche che non sono facilmente accessibili (ad esempio, gli isotopi radioattivi, tessuti di animali vivi, attrezzature avanzate di imaging 1,4,5), descrivono i protocolli che sono abbastanza avanzati (ad esempio, adatto per un corso di 400 livello 6), o richiedere più settimane o semestre progetti lunghi 6,7. L'attività di laboratorio qui descritto è semplice e può essere effettuata in una sola settimana, con apparecchiature di laboratorio comune.
In sintesi, questo modulo laboratorio introduce efficacemente o rafforza i concetti di ciclo cellulare, vie di segnalazione cellulare e cancro, mentre l'insegnamento delle competenze di laboratorio di base e avanzate, analisi dei dati sperimentali, il metodo di coltura delle cellule animali e il processo scientifico. Il modulo di laboratorio è semplice ed economicamente accessibile e offre sia la flessibilità e opportunità per l'inchiesta a tempo indeterminato. L'attività incoraggia la creatività degli studentifornendo una strategia sperimentale modello che funge da guida, ma non una ricetta. Ancora più importante, l'attività soddisfa tutti i domini di apprendimento di Blooms Tassonomia 8 come si richiede a ricordare, la comprensione, l'applicazione, l'analisi, la valutazione e la creazione coinvolgendo gli studenti in un processo che li tira fuori del libro di testo e nel mondo della ricerca scientifica.
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Protocol
Note: Comportamento tutto il lavoro con le cellule e reagenti colture cellulari in un armadio biosicurezza di classe II (BSC) 9. Cellule MMT sono classificati come livello di biosicurezza io, in quanto rappresentano basso a moderato rischio biologico. Applicare le procedure di pulizia e decontaminazione propri del BSC tra usi (ad esempio, la luce ultravioletta, il 70% di etanolo pulire giù).
1. Crescere le cellule MMT
- Crescere cellule in 10 centimetri piastre di coltura tissutale contenente 10 ml di mezzi ricchi di nutrienti che si compone di Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), glutammina 2 mm e 1% contro funghi / antibiotici (10 unità di penicillina , 100 mg di streptomicina, 0,25 mg amfotericina B). Coltivare cellule in un umidificata al 5% camera di CO 2, a 37 ° C. Cellule piastra a una densità di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2 (vedere il conteggio delle cellule al punto 2).
- Sostituire la metà dei mezzi di coltura cellulare con mezzi freschi ogni 48 ore Unless altrimenti indicato. Verificare la vitalità cellulare e la morfologia di un esame con un microscopio ottico a contrasto di fase invertito.
- Nota e caratterizzare le cellule per le dimensioni, la struttura, la forma, l'organizzazione e il numero stimato sotto a 100 - 200 ingrandimenti. A questa densità, le cellule devono apparire in un piano, non ragruppato uno sopra l'altro e nelle immediate vicinanze. Ogni cella è costituita da una spessa, nucleo sferico con estensioni, sottili, lunghe ramo-come espansione da essa che vengono a un punto (vedi figura 1).
- Suddividere cellule quando raggiungono una densità cellulare di 7,2 x 10 6 cellule / cm 2. Le cellule mostrano un tasso di raddoppio di 1,8 x 10 6 cellule / cm 2 per 24 ore. Designare cellule Passage X (Px) per indicare il numero di volte in cui sono state suddivise.
- Alla generazione 3 (ossia, dopo tre passaggi, P3), il raccolto, Numero, e piastra le cellule su una piastra di coltura tissutale 24 bene ad una densità di 3,6 x 10 6 2.
- Vedi cellule ogni giorno e microfotografie digitali registrare. Nota e descrivere la morfologia delle cellule (ad esempio, dimensione, forma, luce proprietà riflettenti). Determinare cella raddoppio tempo contando le cellule regolarmente e relativo tempo trascorso al numero di cellulare.
2. Conta Cellule MMT
Nota: Contare le celle per determinare se le cellule hanno bisogno di essere subcoltura, a creare per un esperimento o per determinare la vitalità cellulare. Ci sono due metodi qui presentati.
- Uso di un emocitometro, una tecnica standard per contare le cellule.
- Ottenere un emocitometro luminoso-line, una soluzione allo 0,2% del trypan colorante blu, un microscopio ottico composto, provette sterili, pipette e un contatore di cellule manuale.
- Sotto il BSC, utilizzare una pipetta 10 ml per rimuovere le cellule da un 10 centimetri piatto di coltura di tessuti. Se le cellule sono coltivate su una piastra ben 24 usare una pipetta 1 ml o 1.000 micropipetta microlitri per rimuovere il supporto.
- Posizionare la sospensione cellulare risultante in una provetta sterile da 15 ml (1 ml o micro centrifuga o altro tubo piccolo volume). In caso contrario, lasciare le cellule nella piastra di coltura tissutale originale / bene.
- Sotto il BSC, unire 10 ml di sospensione cellulare con 10 ml di soluzione di blu di trypan (rapporto 1: 1) in una microcentrifuga non-sterile o altro tubo piccolo volume.
Nota: blu Trypan è una colorazione vitale che non viene assorbito dalle cellule vitali sane. Quando le cellule sono danneggiate o morti, blu trypan possono entrare nella cellula permettendo cellule morte da contare (aka tingere metodo di esclusione). Pertanto al microscopio, le cellule morte appaiono viola scuro, mentre le cellule vitali sono un luminoso e di colore chiaro. - Covarea temperatura ambiente per 5 min.
- Posizionare il vetrino sul emocitometro. Applicare 10 ml di miscela di sospensione di cellule blu trypan nella scanalatura. Visualizza il emocitometro a 100 - 200 ingrandimenti. Una griglia di quattro angolo è evidente (vedi figura 2).
- Contare il numero di cellule vitali (senza macchia) contro cellule totali in ogni area grigliata. Calcolare la media dei quattro griglie e moltiplicare per 1 x 10 4 per ottenere cellule / ml.
- Estrapolare il numero totale di cellule per piatto (o cellule / cm 2). Utilizzare questo numero per determinare sia il corretto volume della sospensione cellulare da utilizzare per inizializzare una nuova piastra di coltura tissutale alla densità desiderata di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2 o determinare il numero totale di cellule vitali sul piatto o nel pozzo.
Nota: Per ulteriori indicazioni sull'impiego di un emocitometro, vedere 10.
- Estrapolare il numero totale di cellule per piatto (o cellule / cm 2). Utilizzare questo numero per determinare sia il corretto volume della sospensione cellulare da utilizzare per inizializzare una nuova piastra di coltura tissutale alla densità desiderata di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2 o determinare il numero totale di cellule vitali sul piatto o nel pozzo.
- Utilizzare il software e una fotocamera digitale per contare le cellule vitali.
- Ottenere una difotocamera gital, il suo software di accompagnamento, una soluzione 0,4% del trypan colorante blu, un microscopio ottico composto, provette sterili, pipette e un computer.
Nota: Una fotocamera digitale Moticam 2.000 con accompagnamento Motic software è impiegato qui. Ogni fotocamera e del software comparabili dovrebbero essere sufficienti. Verificare che il software della fotocamera digitale è stato calibrato in anticipo (secondo il protocollo del produttore). - Sotto il BSC, utilizzare una pipetta 1 ml o 1.000 microlitri micropipetta di rimuovere il supporto da parte delle cellule MMT che crescono in un 24 ben piatto di coltura di tessuti. Lavare le cellule aderenti applicando delicatamente una piccola quantità (circa 500 ml) di un-integrato (ovvero, EMEM senza supplementi) mezzi freschi al piatto poi rimuoverlo. Applicare 10 ml di 0,2% trypan blu (fatta diluendo 1: 1 con un-integrato EMEM) direttamente al pozzo.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Osservando la lastra sotto il microscopio a 100 - 200 ingrandimenti won una fotocamera digitale collegata. Piatto può essere lavato con i media non integrate se colorazione con 2% trypan blu è troppo scura.
- Aprire il software sul computer un ND verificare che il software è calibrato per l'obiettivo utilizzato tramite la scheda Impostazioni. Dovrebbe apparire Un'immagine del FOV.
- Selezionare la griglia dalla scheda Misura. Circa apparirà 0,005 centimetri di larghezza Una griglia di quadrati. Selezionare Griglia Info per confermare l'area di ogni quadrato.
- Scegli una determinata area di griglia per contare le celle (cioè, 5 piazze x 9 quadrati). Selezionare Rettangolo dalla scheda Misura. Fare clic sull'angolo di un quadrato e trascinate il cursore per comprendere le piazze di scelta.
Nota: Una tonalità di verde coprirà piazze di scelta e apparirà in un angolo che fornisce la larghezza, l'altezza, zona una scatola bianca, e il perimetro della sezione della griglia scelta (vedere Figura 3). - Contare il numero di viabLe cellule all'interno dell'area determinata. Fare lo stesso per altre due località dello stesso bene o piatto spostando il piatto sotto il microscopio.
- Assicurarsi che l'area misurata è la stessa e l'ingrandimento non è cambiata. Calcolare il numero medio di cellule vitali all'interno dell'area. Utilizzando la zona del pozzo (per una piastra ben 24, un pozzetto ha una superficie di 2 cm 2, per un 100 mM piatto zona è 78,6 centimetri 2), estrapolare il numero di cellule vitali dalla zona delimitata nella griglia per il numero totale di cellule all'interno del pozzo (cellule / cm 2).
- Ottenere una difotocamera gital, il suo software di accompagnamento, una soluzione 0,4% del trypan colorante blu, un microscopio ottico composto, provette sterili, pipette e un computer.
3. il trattamento di cellule MMT con agenti anti-proliferativi
- Preparare le soluzioni degli agenti selezionati anti-proliferative terapeutici (tamoxifene, la curcumina e metformina) e droga opzionale, aspirina sotto il BSC.
- Sciogliere curcumina e tamoxifene in 100% di etanolo per generare una concentrazione scorta di 27 mm. Sciogliere metformina e aspirina in unsupplemented EMEM per generare una concentrazione magazzino di 500 mm e 15 mm rispettivamente.
- Stabilire una risposta alla dose.
- Trattare cellule MMT con i tre agenti anti-proliferativi terapeutici (tamoxifene, la curcumina e metformina) e droga opzionale (aspirina) a diverse concentrazioni per 96 ore per generare una curva dose-risposta. Inizialmente amministrare tutti i farmaci in un intervallo di concentrazioni basati su rapporti pubblicati 1,11-16 e poi a concentrazioni maggiori o minori di quelli pubblicati.
Nota: una dose risposta determina la concentrazione minima di un farmaco necessaria per produrre i risultati desiderati. Qui il risultato desiderato è una riduzione della proliferazione cellulare rispetto al controllo.- Per tamoxifene e curcumina, utilizzare concentrazioni (e volumi corrispondenti) di 0,054 mm (1 ml), 0.108 mm (2 ml), 0.162 mm (3 ml) e 0.216 mm (4 pl).
- Per la metformina, utilizzare concentrazioni (e volumi corrispondenti) di 2 mm (2 microlitri), 4 mm (4 pl), 6 mm (6 pl), 8 mm (8 ml) e 10 mm (10 ml).
- Per l'aspirina, utilizzare concentrazioni (e volumi corrispondenti) di 0,030 mm (1 ml), 0,060 mm (2 ml), 0.099 mm (3,3 ml), 0.150 mm (5 ml), e 0.216 mm (6,7 ml).
- Split cellule MMT dal piatto 10 centimetri su una piastra 24 pozzetti ad una concentrazione di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2. Calcolare la concentrazione cellulare iniziale con entrambi i metodi di conteggio cellulare (Fase 2). Chiamare questo nuovo piatto 24 bene di cellule "Giornata Split".
- 24 ore dopo la placcatura delle cellule, trattare le cellule MMT con ciascuno dei agenti terapeutici anti-proliferativa, tamoxifene, la curcumina, metformina e aspirina, alle concentrazioni descritti nel passaggio 3.2.1. Fare riferimento a questo come "giorno 0".
- Come ogni bene può contenere un massimo di 500 ml di mezzi di comunicazione, l'uso Micropipette con punte micropipetta sterile e una nuova punta ogni volta che un nuovo pozzo è trattato per evitare crcontaminazione oss. Utilizzare due pozzi come controlli: cellule coltivate in assenza di qualsiasi trattamento farmacologico (controllo negativo) e le cellule cresciute in presenza di 100% di etanolo (controllo solvente).
- Crescere le cellule e ri-somministrare farmaci alle concentrazioni descritte quando le cellule vengono alimentati a giorni alterni (vedere il punto 1.2) per 96 ore (fino al 4 ° giorno) nei giorni di 1 -. 4 di trattamento, osservare le cellule al microscopio e contare utilizzo il metodo nel passaggio 2.2 (vedi figura 4).
- Ripetere l'esperimento almeno tre volte.
- Determinare la concentrazione ottimale di ciascun farmaco rappresentando graficamente la relazione tra la vitalità cellulare e dosaggio del farmaco sulla durata dell'esperimento (vedere Figura 5).
- Trattare cellule MMT con i tre agenti anti-proliferativi terapeutici (tamoxifene, la curcumina e metformina) e droga opzionale (aspirina) a diverse concentrazioni per 96 ore per generare una curva dose-risposta. Inizialmente amministrare tutti i farmaci in un intervallo di concentrazioni basati su rapporti pubblicati 1,11-16 e poi a concentrazioni maggiori o minori di quelli pubblicati.
- Stabilire un corso a tempo.
- Trattare cellule MMT con i tre agenti terapeutici anti-proliferative (tamoxifene, la curcumina e metformina) ad una concentrazione fisso per vari periodi di tempo. Utilizzare il identif concentrazione ottimaleied attraverso esperimenti Dose Response (vedi punto 3.2).
- Utilizzare i seguenti concentrazioni: 0,216 tamoxifene mM, la curcumina 0.216 mM e metformina 10 mm.
Nota: Un corso tempo determina la quantità di tempo necessario per un farmaco per produrre il risultato desiderato ottimale. Qui, il risultato desiderato è una riduzione della proliferazione cellulare rispetto al controllo.
- Utilizzare i seguenti concentrazioni: 0,216 tamoxifene mM, la curcumina 0.216 mM e metformina 10 mm.
- Split cellule MMT dal piatto 10 centimetri su una piastra 24 pozzetti ad una concentrazione di 3,6 x 10 6 cellule / cm 2. Calcolare la concentrazione cellulare iniziale con entrambi i metodi di conteggio cellulare (Fase 2). Chiamare questo nuovo piatto 24 bene di cellule "Giornata Split".
- 24 ore dopo la placcatura delle cellule, trattare le cellule MMT con ciascuno dei agenti terapeutici anti-proliferativa, tamoxifene, la curcumina, metformina e aspirina, alle concentrazioni ottimali individuate nella Fase 3.2. Fare riferimento a questo come "giorno 0".
- Come ogni bene può contenere un massimo di 500 ml di media, noie Micropipette con punte micropipetta sterile e una nuova punta ogni volta che un nuovo pozzo è trattato per evitare la contaminazione incrociata.
- Utilizzare due pozzi come controlli: cellule coltivate in assenza di qualsiasi trattamento farmacologico (controllo negativo) e le cellule cresciute in presenza di 100% di etanolo (controllo solvente).
- Trattare cellule MMT con i tre agenti terapeutici anti-proliferative (tamoxifene, la curcumina e metformina) ad una concentrazione fisso per vari periodi di tempo. Utilizzare il identif concentrazione ottimaleied attraverso esperimenti Dose Response (vedi punto 3.2).
- Crescere le cellule e ri-somministrare farmaci alla concentrazione desiderata, quando le cellule vengono alimentati a giorni alterni (vedere il punto 1.2) per 96 ore (fino al 4 ° giorno). Nei giorni 1 - 4 di trattamento, osservare le cellule al microscopio e contare con il metodo nel passaggio 2.2 (vedere Figura 4).
- Ripetere l'esperimento almeno tre volte.
- Determinare il tempo di esposizione ottimale delle cellule MMT per ciascun farmaco rappresentando graficamente la relazione tra la vitalità cellulare e la lunghezza (tempo) di trattamento farmacologico alla concentrazione desiderata (vedere Figura 6).
4. Il modulo Lab
Nota: Il seguente è un giorno 5pianificazione laboratorio per il modulo laboratorio. figura 7 è un diagramma di flusso di ciò che il programma comporterebbe nei 5 giorni. Per questa attività da completare in cinque giorni è generato un ciclo di tempo o una curva dose-risposta. Non c'è il tempo sufficiente per generare entrambe le curve. Un esperimento risposta alla dose è descritto di seguito. Un esperimento decorso è facilmente intercambiabile
- Dividere la classe in gruppi: un gruppo ha stabilire una dose risposta e l'altro corso una volta scelta una concentrazione nel mezzo delle concentrazioni dose-risposta proposti.
- Mantenere le culture e le scorte di farmaci sufficienti a concentrazioni appropriate. Se non diversamente specificato, eseguire tutti i lavori sotto il BSC.
- Giorno 1
- Studenti diretti a rendere i media e crescere le cellule (come al punto 1).
- Come studenti ottengono uno stock di cellule MMT su una piastra 10 cm dirigere gli studenti di prepararsi terreni di coltura cellulare e dare un tutorial nell'uso del hemocytometer, microscopia digitale e il software microscopio fotocamera digitale (come al punto 2).
- Calibrare il software agli obiettivi utilizzati sul microscopio (ad esempio, 4X, 10X, 20X) ora utilizzando il protocollo del produttore.
- Day 2
- Invita gli studenti confermano numero totale delle cellule e la vitalità cellulare (come al punto 2).
- Gli studenti a contare le cellule sul piatto 100 millimetri utilizzando sia il software microscopia e metodi emocitometro, per confermare si ottengono risultati simili.
- Studenti diretti a ottenere un 24 piatto e split e cellule dal piatto 100 millimetri ai 24 pozzetti per l'avvio densità di placcatura cellulare desiderato (come al punto 1). Questo è considerato giorno Spalato. Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore di coltura cellulare per 24 ore.
- 3 ° giorno
- Crescere cellule MMT per 24 ore su una piastra ben 24. Chiedere agli studenti di osservare le cellule sotto il microscopio e contano utilizzando il software microscopio (come al punto 2).
- Dare allo studente / teSono esempi di scorte di farmaci di trattamento del cancro. Avere a prepararsi e diluire la soluzione madre originale (come al punto 3). Aggiungere le varie concentrazioni dei farmaci nelle loro celle per stabilire una curva dose-risposta. Questo si chiama Giorno 0.
- Incubare le cellule (passo 1,2) con i farmaci per massimo di 48 ore.
- Giorno 4
- Chiedere agli studenti di osservare cellule trattate dopo 24 ore. Questo è il giorno 1.
- Contare ciascun pozzetto utilizzando il software microscopia. Fotografie record di ogni bene in modo che il conteggio possono essere condotte al di fuori del laboratorio (come al punto 2).
- Incubare le cellule (passo 1,2) con i farmaci per altre 24 ore.
Nota: Istruttore fornisce esercitazioni supplementari e le opinioni di analisi dei dati e presentazione grafica. Gli studenti imparano a creare figure, grafici e analisi statistiche per il giorno successivo della raccolta dei dati.
- 5 ° giorno
- Hanno studenti cellule trattate dopo 48 ore, Giorno 2.
- Contare ognibene con il software microscopia. Fotografie record di ogni bene in modo che il conteggio possono essere condotte al di fuori del laboratorio (come al punto 2).
- Harvest e raccogliere le cellule per il conteggio con il metodo emocitometro tradizionale come mezzo per verificare la capacità studente utilizzare efficacemente il metodo software microscopia (step 2).
Nota: Raccogliere i dati e trarre conclusioni o rivedere le ipotesi, di conseguenza.
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Representative Results
Crescere cellule MMT e confrontando metodi di conteggio.
Cellule tumorali mammarie di topo furono cresciuti e caratterizzati con successo (Figura 1) e un metodo di conteggio cellulare romanzo sviluppato utilizzando Motic Software, un programma software della fotocamera associata digitale per microscopio. Questo nuovo metodo di conteggio delle cellule è stato confrontato con un metodo di conteggio tradizionale utilizzando un emocitometro (Figura 2) e ha dimostrato di essere altrettanto preciso nella determinazione del numero di cellule (Tabella 1). Per controllare eventuali effetti sul numero di cellule a causa di diverse condizioni di crescita o di tipo cellulare, il confronto tra i due metodi di conteggio delle cellule è stata condotta in presenza ed in assenza di agenti anti-proliferativi e con una linea cellulare diverso, il modello neuronale PC12 17.
La Figura 3 mostra la delimitazione della zona per il conteggio delle cellule con questo metodo utilizzando una griglia sovrapposta di definIngombri Ed. La griglia viene sovrapposta sul campo di vista (FOV) ed un telaio verde viene quindi applicato a una lunghezza designata e larghezza della griglia (cioè, piazze 9x5). Le cellule vengono contati nel quadro verde ed il numero di cellule viene estrapolato, come discusso nel protocollo.
Curare le cellule MMT: Determinazione della risposta alla dose di cellule MMT di agenti anti-proliferativi.
Sono stati condotti studi dose-risposta (Figura 4) per ogni agente anti-proliferativa. Nel corso di questi esperimenti era continuamente dati raccolti, rivisto e analizzato per vedere se erano giustificati possibili revisioni al protocollo. L'esperimento è stato condotto per tre volte, con ogni studio produrre risultati simili. Gli esperimenti sono stati continuati fino a quando tutte le celle sono morte o gli effetti dei farmaci avevano stabilizzato. Microfotografie digitali dei risultati sono presentati nella Figura 4, e una analisi grafica di tali considerazioni è presentatoin figura 5. intervalli di concentrazione efficaci sono riportati nella legenda della figura 4, sul l'asse X di figura 5 e nella sezione Protocollo.
Alla concentrazione minima di tamoxifene, 0.054 mM, c'era l'inibizione robusta della crescita cellulare, circa il 83% rispetto alle cellule non trattate (Figura 4A). La vitalità cellulare ha continuato a diminuire con concentrazioni crescenti di tamoxifene (Figura 5A). Il dosaggio ottimale di tamoxifene è stato determinato in 0.216 mM perché dopo 48 ore la morte cellulare completo che si è verificato a concentrazione (figura 4A). È interessante notare che queste riduzioni di propagazione delle cellule rivelano alcuna indicazione di una resistenza cellulare al tamoxifene, come ci si aspetterebbe in base alla letteratura 18,19 sottolineando che i sistemi in vitro modello, ma non sempre rappresentano pienamente eventi vivo. Inoltre, se confrontato con il tre più bassoconcentrazioni atment di curcumina (Figura 4B e 5A) e metformina (Figura 4C e 5B), concentrazione minima di tamoxifene era del 9% e il 50% più efficace nel bloccare la divisione cellulare, rispettivamente.
La curcumina mostrato un effetto dipendente dalla concentrazione sulla inibizione di divisione cellulare pure. Con concentrazioni crescenti, c'è stata una significativa diminuzione della vitalità cellulare (Figura 4D e 5A). Il dosaggio ottimale della curcumina è stato determinato in 0.216 mM perché dopo 48 ore, come il tamoxifene, ci fu la morte cellulare completo, a tale concentrazione.
Trattamento Metformina ha prodotto la diminuzione almeno drammatica vitalità cellulare MMT, che porta ad una riduzione del 33% a più bassa concentrazione. Una diminuzione concomitante vitalità cellulare con l'aumento della concentrazione di metformina è stato osservato (Figura 4C e 5B). Il dosaggio ottimale di metformina è stato determinato da la più alta concentrazione testata (10 mM). Rispetto al tamoxifene e curcumina, sia comunemente impiegati come agenti chemioterapici, metformina è stata del 30-40% meno efficace nell'inibire ciclo cellulare. È interessante notare che gli effetti della metformina sulla divisione cellulare erano coerenti con quelli ottenuti con la somministrazione di aspirina (Figura 4D e 5A), un farmaco salicilico con alcun meccanismo chiaramente identificata di inibizione della crescita cellulare.
Curare le cellule MMT: Determinazione del decorso temporale della risposta cellulare MMT di agenti anti-proliferativi.
Uno studio andamento temporale è stato condotto anche per ogni agente anti-proliferativa, perché la dose efficace di un farmaco somministrato può essere influenzato dal tempo di esposizione. Come questo modulo test per la vitalità cellulare, è importante identificare prima quanto velocemente le cellule si dividono (tempo di raddoppio) così una finestra logico per il periodo di tempo le cellule sono esposte ai farmaci possono essere scelti. E 'essenziale, quindi, che MMT tempo di raddoppio delle cellule siaaccertato nella caratterizzazione inizialmente le cellule. Durante questi esperimenti, i dati sono stati raccolti continuamente, recensione e analizzato per vedere se erano giustificati possibili revisioni al protocollo. L'esperimento è stato condotto per tre volte, con ogni studio produrre risultati simili. Gli esperimenti sono stati proseguiti fino a quando tutte le cellule erano morti o gli effetti avevano stabilizzato.
Studi decorso rivelato che il trattamento delle cellule con concentrazioni MMT ottimizzata di ciascun farmaco anti-proliferativo (tamoxifene 0,216 mM, curcumina 0,216 mM, metformina 10 mM) per 96 hr provocato morte cellulare completa o un livellamento degli effetti del farmaco ( Figura 6). Anche se l'aspirina, il farmaco "optional", ha influenzato la vitalità delle cellule nei nostri studi dose-risposta, l'impatto è stato minore e, pertanto, non è stato incluso negli studi del corso di tempo.
Figura 1. cellule MMT. Microfotografia digitale di "sana", il mouse non trattati tumore mammario (MMT), le cellule cresciute a 3,6 x 10 6 cellule / cm 2 a modificata Eagles Minimum Essential Medium (EMEM) .100X, scale = 0,2 mm, indicati da barra bianca. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Griglia emocitometro. Microfotografia di griglia emocitometro, 100x. Sezione griglia Tutto mostrato in cerchio (FOV). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3. Designazione nell'area di conteggio con il software Motic. Immagine di sovrapposizione griglia FOV e zona definita per il conteggio delle cellule MMT stabiliti con il software Motic come visto attraverso il microscopio. 100X, scale = 0,2 mm, indicato dalla barra bianca. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. risposta dose di cellule MMT agli agenti anti-proliferativi. Microfotografie digitali di cellule MMT cresciute in presenza di agenti anti-proliferativi a diverse concentrazioni per 96 ore. Tamoxifen: (A1) 0,054 mm (A2) 0,108 mm (A3) 0,162 mm (A4) 0,216 mM; La curcumina: (B1) 0,054 mm (B2) 0,108 mm (B3) 0,162 mm (B4) .216 mm; Metformina: (C1) 2 mm (C2) 4 mm (C3) 6 mm (C4) 8 mm (C5) 10 mm; Aspirina: (D1) .030 mM (D2) .060 mM (D3) 0,099 mM (D4) .150 mM (D5) .216 mM; Etanolo (100%) e non trattate sono entrambi i controlli. 100X, scale = 0,1 millimetri, indicato dalle linee blu che compongono ciascun quadrato all'interno della griglia. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Rappresentazione grafica di esperimenti dose-risposta di cellule MMT di agenti anti-proliferativi. Effetti di concentrazioni crescenti di agenti anti-proliferativi (A) tamoxifene, la curcumina, aspirina, e (B) metformina sulla vitalità cellulare MMT. Risultati unre espressa come percentuale di controllo dopo 48 ore di trattamento, anche se il trattamento con cellule continuato per 96 ore. n = 3, STD è indicato.
Figura 6. Rappresentazione grafica di analisi andamento temporale MMT risposta cellulare agli agenti anti-proliferativi. Ora studio corso degli effetti di tamoxifene (0.216mM), la curcumina (0.216mM), e metformina (10 mm) sulla vitalità cellulare MMT oltre 96 ore. I risultati sono espressi come percentuale di controllo dopo 48 ore di trattamento. Visualizzati sono risultati di un esperimento rappresentativo, n = 1.
Figura 7. Schema di flusso del modulo laboratorio di 5 giorni.
| Tipo di cella | Drug Administered | Giorno di Experiment | Concentrazione di farmaco | Cell Count con Motic | Cell Count con emocitometro |
| MMT | Non trattata | Day 2 | - | 7.8x10 4 cellule / cm 2 | 8.0x10 4 cellule / cm 2 |
| MMT | Etanolo | Day 2 | 10 mM | 7.1x10 4 cellule / cm 2 | 7.2x10 4 cellule / cm 2 |
| MMT | Tamoxifen | Day 2 | 0,216 MM | 0 cellule / cm 2 | 0 cellule / cm 2 |
| MMT | Tamoxifen | Day 2 | 0,054 mM | 1.3x10 4 cellule / cm 2 | 1,5x10 4 cellule / cm 2 |
| MMT | La curcumina | Day 2 | 0,054 mM | 1.9x10 4 cells / cm 2 | 2.0x10 4 cellule / cm 2 |
| MMT | La curcumina | Day 2 | 0,216 mM | 0 cellule / cm 2 | 0 cellule / cm 2 |
| MMT | Metformina | Day 2 | 2 mm | 5.1x10 4 cellule / cm 2 | 5.2x10 4 cellule / cm 2 |
| MMT | Metformina | Day 2 | 6 mm | 3.4x10 4 cellule / cm 2 | 3.5x10 4 cellule / cm 2 |
| MMT | Aspirina | Day 2 | 0,099 mM | 2.8x10 4 cellule / cm 2 | 3.0x10 4 cellule / cm 2 |
| PC12 | Non trattata | Diviso | - | 2.5x10 4 cellule / cm 2 | 2.1x10 4 cellule / cm 2 |
Tabella 1. Confronto tra emocitometro e software Motic contare metodi. I risultati della conta cellulare delle cellule MMT, utilizzando il software Motic o metodi emocitometro. Sia cellule non trattate e trattate sono state contate, così come una linea cellulare diverso, PC12, come controllo.
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Discussion
Un modulo laboratorio è presentato che si propone di insegnare una varietà di argomenti in biologia cellulare attraverso le tecniche avanzate di coltura delle cellule animali. Il modulo realizza questo analizzando gli effetti di una serie di sostanze chimiche antiproliferativi sulla replicazione di cellule che modello di cancro al seno umano. Il saggio primario si basa sulla tecnica fondamentale del conteggio delle cellule e introduce un nuovo modo per contare le cellule usando il software microscopia. Le attività che compongono il modulo possono essere condotti con gli strumenti e le attrezzature a disposizione nella maggior parte dei programmi di biologia. Il modulo può essere implementato in un programma di 5 giorni con forniture che sono poco costosi e facilmente reperibili. Anche se una particolare marca di macchina fotografica del microscopio e la microscopia software digitale è qui utilizzato (Motic Software), qualsiasi fotocamera e il software comparabile dovrebbero bastare.
Questo modulo laboratorio si usano cellule MMT come modello per il cancro al seno umano. Gli studenti vengono prima insegnato a crescere e caratterizzare questecellule in coltura. E 'importante sottolineare che il successo completamento di questo modulo di laboratorio richiede gli investigatori (aka studenti) essere ben conoscono l'aspetto e il comportamento delle cellule sane MMT, tanto più che le cellule non trattate MMT servono come controllo. Pertanto caratterizzazione approfondita dei modelli di crescita delle cellule, tempo di raddoppio e la morfologia generale di cellule MMT è essenziale se dose-risposta corretta e ora i dati del corso sono da generare.
Una volta caratterizzato, le cellule sono state poi MMT testati per la loro risposta a vari agenti anti-proliferativi come mezzo per insegnare i temi della divisione cellulare, regolazione del ciclo cellulare, segnalazione cellulare e il cancro. È usato vitalità cellulare per comprendere l'effetto di questi farmaci sulle cellule. Un nuovo metodo di conteggio delle cellule, utilizzando il software associato con una fotocamera digitale montata microscopio, è condotto e confrontata con una procedura basata emocitometro conteggio tradizionale per verificarne l'esattezza. Thimetodo s romanzo offre due vantaggi, che sono particolarmente degno di nota perché è usato nei laboratori didattici universitari. In primo luogo, poiché le cellule non devono essere rimossi dalla piastra di coltura tissutale per il conteggio, è necessario meno tempo per eseguire il test principale sperimentale. Questo permette un gran numero di variabili sperimentali da testare in una volta e in un periodo di tempo limitato. In secondo luogo, il metodo fornisce una registrazione digitale della risposta cellulare al trattamento sperimentale consentendo agli studenti di valutare i risultati e perfezionare la loro strategia sperimentale di fuori del laboratorio.
Ci sono diverse questioni da notare in sede di attuazione entrambi i metodi di conteggio. Innanzitutto, prima di contare le cellule con entrambi i metodi, le cellule vengono incubate con trypan blu per distinguere tra una cellula vitale e una cellula morta. Le cellule morte vengono attraversate dal colorante e appaiono blu scuro, mentre le cellule vitali sono bianco brillante. Tuttavia, se le cellule vengono incubate con dye al di là del periodo di incubazione raccomandato, che è eccessivamente macchiato e difficili da distinguere. In secondo luogo, le cellule possono MMT ciuffo sulla emocitometro o la piastra di coltura dei tessuti e di essere difficili da contare individualmente. Pertanto, un "grumo" è designato a contenere un certo numero di cellule (ad esempio, 10 cellule / ciuffo) ed ogni macchia presenti sulla griglia viene quindi moltiplicata per il numero durante il conteggio. Infine, le cellule MMT aderiscono alla superficie dei piatti in cui vengono coltivate. È pertanto necessario toccare la punta della pipetta direttamente sulla lastra durante la rimozione delle cellule e applicare forza per rompere grumi di cellule e rimuovere quante cellule dalla piastra possibile. Di conseguenza il mio necessari diversi tentativi di ottenere un conteggio preciso quando si utilizza il metodo di emocitometro tradizionale.
Con le cellule ben caratterizzati e metodi di conteggio verificati, due esperimenti diversi sono condotti; uno studio dose-risposta degli effetti di concentrazioni variabilidi farmaci anti-proliferativi sulle divisione cellulare MMT e un esperimento corso tempo di chiarire il tempo ottimale di esposizione a questi farmaci. Questi esperimenti sono altamente istruttivi come è necessario per tentativi ed è richiesta l'applicazione della letteratura primaria per un esperimento riuscito. Ad esempio, i tentativi iniziali chiarire la risposta alla dose di cellule MMT a questi agenti anti-proliferativi rivelato che le concentrazioni testate erano troppo alti, perché non c'era la morte delle cellule del 100% entro 24 ore di somministrazione del farmaco. Una revisione estesa della letteratura ha portato ad una gamma rinnovata di concentrazioni di trattamento. Questo insegna efficacemente agli studenti come utilizzare banche dati di letteratura, leggere, analizzare e criticare articoli letteratura primaria e sottolinea come tali competenze sono essenziali per il processo scientifico.
I risultati degli studi dose-risposta hanno dimostrato che il tamoxifene presenta il più forte effetto anti-proliferativo a tutte le concentrazioni testate. Tamoxifene, un anti-mitotic droga, viene utilizzato in particolare come terapia anti-estrogeno per i tumori estrogeno sensibili, tipicamente in postmenopausa, pazienti ormono-sensibile 18-20. Il farmaco è attualmente utilizzato come trattamento del cancro al seno. Tamoxifen compete con gli estrogeni per il recettore degli estrogeni intracellulare e quando legato, regola giù espressione di cicline D e B, due importanti regolatori del ciclo cellulare. I risultati ottenuti nell'attività suggeriscono che il tamoxifene legati con successo al recettore degli estrogeni e inibito la progressione delle cellule attraverso il ciclo cellulare, con conseguente diminuzione della proliferazione cellulare osservata. È interessante notare che la riduzione MMT tassi di propagazione delle cellule attraverso tutte le concentrazioni di tamoxifene somministrati rivelano alcuna indicazione di resistenza cellulare tamoxifene, come ci si aspetterebbe sulla base della letteratura (si veda ad esempio 19). Questo serve come un buon promemoria che le condizioni in vitro in cui è stato condotto l'esperimento fanno non pienamente modello in VIVO circostanze.
Trattamento curcumina delle cellule MMT anche comportato una riduzione della vitalità cellulare. Curcumina è un composto derivato dalla radice di curcuma e agisce come un inibitore della crescita cellulare 12,16. Funziona down-regolazione del pathway NF-kappa B e ornitina decarbossilasi (ODC) attività. NF-kappa B è un complesso proteina che controlla la trascrizione dei geni anti-apoptotici quali TRAF1 e TRAF2, che codificano per proteine che inibiscono l'apoptosi. ODC è un enzima che catalizza la produzione di poliammine, proteine che forniscono le cellule tumorali con fonti accresciute di alimentazione che portano alla crescita cellulare maggiore. Il farmaco è attualmente in uso come trattamento del cancro al seno. Gli effetti anti-proliferativi della curcumina mostra chiaramente l'effetto che verso il basso regolazione della via di segnalazione cellulare che coinvolge NF-kappa B e ornitina decarbossilasi è sulla divisione cellulare.
Vitalità cellulare ridotta era ugualmente osservata con metformina lavornt. La metformina, un farmaco normalmente somministrato a diabetici di tipo II, è stato scelto perché i rapporti pubblicati suggeriscono una correlazione tra i pazienti che assumono metformina e una minore incidenza di cancro al seno 15. Si ritiene che l'agente modula la c-MYC gene e quindi down-regola l'attività di ciclina D. Up-regolazione di cicline, molecole che fungono da punto di controllo all'interno del ciclo cellulare, permette alle cellule di progredire attraverso il ciclo a una velocità maggiore con conseguente aumento della divisione cellulare e la crescita. Gli effetti del trattamento metformina sulle cellule MMT mostra come la modulazione del gene c-MYC porta anche a down-regulation di ciclina D e una riduzione della divisione cellulare. I dati metformina esemplifica ulteriormente come un farmaco progettato per una CONDIZIONATA in questo caso Diabete può avere un meccanismo d'azione adatto per altri eventi fisiologici aberranti. Inoltre, è importante sottolineare che, sebbene il tamoxifene, curcumina, e metformina tutte ritardano prolif cellulare anormaleperazione attraverso meccanismi diversi, ogni diminuzione con successo popolazioni cellulari e interferito con la divisione cellulare in vitro.
Questo modulo permette anche per l'inchiesta aperta in che un altro farmaco, rimedio a base di erbe, o l'agente può essere testato. L'aspirina, un analgesico over-the-counter, antipiretici e farmaci anti-infiammazione usati per alleviare il dolore lieve e ridurre la febbre è stata scelta in questo modulo. La capacità di Aspirina per ridurre l'infiammazione può inibire la crescita tumorale rallentando lo sviluppo di nuovi vasi sanguigni che li nutrono e interferendo con le cellule staminali che alimentano il loro 11,13,14 crescita. È interessante notare che la somministrazione di aspirina per MMT cellule ha comportato una certa riduzione della vitalità cellulare. Poco si sa circa il ruolo dell'aspirina nella prevenzione e nel trattamento del cancro, anche se molti studi correlative sono riportati 13,14, fornendo un ottimo esempio di correlativo contro relazioni causali.
Il tempostudi del corso hanno rivelato che, se somministrato a dosi ottimizzate, i farmaci anti-proliferativi sono altamente efficaci a interferire con la divisione cellulare entro 4 giorni di esposizione iniziale. Questi studi forniscono anche un'opportunità per gli studenti di utilizzare quello che hanno imparato a conoscere le caratteristiche di crescita cellulare MMT al momento di elaborare una strategia sperimentale per lo svolgimento di questi esperimenti. In realtà, a fondo che caratterizza i modelli di crescita delle cellule, il tempo e la morfologia delle cellule generale di cellule MMT raddoppio è essenziale sia per i dati dose-risposta e corsi di tempo precisi.
Entrambi gli studi dose-risposta corso e tempo determinano il rapporto tra concentrazione del farmaco e il tempo di esposizione, rispettivamente, e l'effetto di un farmaco è in un sistema biologico. Questo è un ottimo modo per ottenere gli studenti che pensano interazioni intermolecolari e altri concetti fondamentali in biochimica mentre conduceva un'indagine guidato, le attività di ricerca. Vale la pena notare che, poiché molti bimajor ology in programma di frequentare la scuola di medicina, questo modulo laboratorio si allinea bene con i cambiamenti di nuova istituzione nei requisiti scuola medica 21.
Questo modulo laboratorio può essere implementato esattamente come descritto o può facilmente servire come modello. Una serie di variazioni può essere incorporato in questa attività, come ad esempio la scelta di un agente anti-proliferativo, tipo cellulare o modifica di nutrienti in terreno di crescita. Finché ipotesi è sviluppato che verifica concetti fondamentali e avanzate cellula o biologia generale, le permutazioni di questo modulo sono numerosi. Indipendentemente dalla permutazione, l'attuazione di questa attività dirige naturalmente studente imparare una vasta gamma di tecniche di laboratorio e acquisire familiarità con una varietà di attrezzature e strumentazione.
In sintesi, il modulo laboratorio qui descritto consente agli studenti di partecipare pienamente al processo della scienza, sviluppare le proprie capacità di acquisire, analizzare e graficamente reprESENT dati, e affinare le loro gestione del tempo e capacità collaborative. Il modulo è progettato per facilitare l'inchiesta a tempo indeterminato ed è facilmente adattabile a diversi orari dei corsi e livelli di abilità. Va notato che i primi due autori di questo articolo sono major biologia laurea, dimostrando chiaramente che questo modulo laboratorio è adatto per quella popolazione.
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Disclosures
Gli autori hanno ricevuto alcun sostegno finanziario o comparabili da Motic.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 μl Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1,000 μl Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 ml Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24 well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 ml, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 ml |
| Metformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
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