Summary
De zebravis is een populaire tool voor het modelleren chronische nierziekte (CKD). Echter, hun kleine formaat maakt het onmogelijk om de nierfunctie te evalueren met behulp van traditionele methoden. We beschrijven een fluorescerende kleurstof nier speling assay 1 dat kwantitatieve analyse van de zebravis nierfunctie bij CKD maakt.
Abstract
De zebravis embryo biedt een soepel model in organogenese bestuderen en modelleren van de menselijke genetische ziekte. Ondanks zijn relatieve eenvoud, de zebravis nier ontwikkelt en functioneert nagenoeg dezelfde wijze als mensen. Een belangrijk verschil in de constructie van de menselijke nier is de aanwezigheid van miljoenen nefronen opzichte van de zebravis dat slechts twee heeft. Echter, het vereenvoudigen van een dergelijk complex systeem in de elementaire functionele eenheden heeft ons begrip van hoe de nier ontwikkelt en exploiteert geholpen. In de zebravis, de middellijn gelegen glomerulus is verantwoordelijk voor de initiële bloedfiltratie in twee pronephric tubuli die afwijken bilateraal run down de embryonale as vóór het fuseren met elkaar op de cloaca. De pronephric tubuli zijn sterk bevolkt door bewegende cilia dat de beweging van filtraat vergemakkelijken langs de gesegmenteerde tubulus, waardoor de uitwisseling van verschillende opgeloste stoffen voordat ze uiteindelijk verlaten via de cloaca 2-4. Vele genen die verantwoordelijk zijn voor CKD, incLuding die verband houden ciliogenese, zijn onderzocht in zebravis 5. Echter, een belangrijk nadeel moeilijk in cijfers zebravis nierfunctie na genetische manipulatie is. Traditionele assays tot nierstoornissen meten bij mensen niet translationeel te zebravis hebben bewezen, met name als gevolg van hun aquatisch milieu en kleine omvang. Zo is het fysiek onmogelijk om bloed onttrekken embryonale opgevoerd vis voor analyse van ureum en creatinine gehalte, omdat ze te klein. Bovendien sluiten zebravis genoeg produceren urine te testen op een eenvoudige proteïnurie "dipstick", die vaak wordt uitgevoerd tijdens de eerste patiënt onderzoeken. We beschrijven een fluorescentie dat de optische transparantie van de zebravis gebruikt om kwantitatief monitoren de goedkeuring van een fluorescente kleurstof, in de tijd, van de vasculatuur en via de nieren, een read geven nierfunctie 1,6-9.
Introduction
De menselijke nier speelt een cruciale rol in het filteren van metabole afvalstoffen uit het bloed en herstellende nodig opgeloste stoffen om cellulaire homeostase in stand te houden. Er zijn verschillende humane genetische ziekten die nierstoornissen veroorzaken. De meest voorkomende erfelijke nierziekte autosomaal dominante polycystische nierziekte (ADPKD) gekenmerkt door de ontwikkeling van vloeistof gevulde blaasjes in pochechnykh tubuli; schade door cystogenesis schaadt nierfunctie 10. ADPKD heeft een voorkomen van 1: 800-1: 1000 en vertegenwoordigt 8-10% van de patiënten in het eindstadium nierfalen (ESRF) 11. Verschillende genen zijn betrokken bij ADPKD veroorzaken waaronder polycystine-1 (PKD1) en -2 (PKD2), goed voor ongeveer 85% en 15% van de gevallen respectievelijk 12,13. Bovendien is de genproducten voor PKD1 en -2 lokaliseren aan de cilium en zijn fundamenteel voor ciliogenese 14,15. Er is nu erkend familie van menselijke genetische afwijkingen, bekend alsde ciliopathieën, die trilharen functie beïnvloeden en resulteren in CKD 16.
Het groeiend aantal menselijke genetische ziekten van ciliaire ontwikkeling en functie is het tekenen van de wereldwijde belangstelling voor deze ooit beschouwd als rudimentair organel. De cilium, een haar-achtige cellulaire uitsteeksel, is verrijkt met receptoren en ionkanalen die noodzakelijk zijn voor de transductie van belangrijke cel signalering evenementen. De cilium bestaat uit een microtubulus gebaseerde axoneme, gewoonlijk gestructureerd in negen radiaal microtubuli doubletten met of zonder centrale paar singlet microtubuli. De axonemal structuur bepaalt het type en de wijze van ciliaire actie. De 9 + 2 microtubule regeling verleent motiliteit het cilium waar het wordt gebruikt bij de beweging van vloeistoffen in epitheliale oppervlakken. De 9 + 0 configuratie is niet beweeglijk maar wordt dat voornamelijk functie in cellulaire signaleringsgebeurtenissen 17. Afgezien van CKD, de gevolgen van ciliaire dysfunctie zijn een set van karakteristiekeciliopathie functies, waaronder, obesitas, retinale degeneratie, polydactylie, en cognitieve stoornissen 16. Echter, CKD is een van de meest schadelijk voor de kwaliteit van leven van de patiënt en dus een belangrijke drijvende kracht achter de ontwikkeling van geschikte in vivo modellen voor ciliaire gerelateerde CKD.
De zebravis is een uitstekend model om de etiologie van de menselijke genetische ziekte te begrijpen. De snelle ontwikkeling, productie van grote aantal eieren, transparante weefsel en ex utero groei laat zebravis ontwikkelingsprocessen worden gevisualiseerd en biologische gebeurtenissen gemanipuleerd met veel gemak. Genen kunnen genetisch worden veranderd met behulp van het recente succes van genoom bewerkingsgereedschappen (CRISPR 18 en TALENS 19), neergeslagen met morfolino antisense technologie 20 of farmacologisch gereguleerd door de toevoeging van verbindingen aan hun aquatisch milieu. Inderdaad, zebravis een platform bieden om te ondernemen experiments die niet tolerant andere diermodellen. Terwijl zebravissen relatief eenvoudig vertebraten (vergeleken mens) zij hebben veel functioneel geconserveerde organen, genen en signaalprocessen gemeen met de mens. Bijvoorbeeld, de zebravis nier opmerkelijk vergelijkbaar in structuur en functie vergeleken mens 21,22. In tegenstelling tot de zoogdieren nier die ontstaat door een opeenvolging van fasen, elk gekenmerkt door een verder ontwikkelde nier (pronephros, mesonephros en metanefros), de embryonale zebravis ontwikkelt slechts pronephros, de onrijpe vorm van een nier. Terwijl miljoen nefronen te vinden die de bouwstenen van het zoogdier nier, alleen de zebravis embryo bezitten twee. De glomeruli, waardoor de oorspronkelijke bloed filtraat, gefuseerd aan de middellijn alleen ventraal van de aorta. Bloedfilters door de glomeruli in de pronephric buisjes die caudaal lopen langs de as, fusing voorafgaand aan te sluiten via de cloaca. De pronephric tubules zijn zwaar trilharen met beweeglijke trilharen die tolerante om de stroom van het filtraat aan de staartzijde afslag 3,4 zijn. Deze eenvoudige pronephric structuur handhaaft zebravis homeostase door verscheidene weken van larvale groei waar ze uiteindelijk ontwikkelen tot een meer complexe mesonephros structuur 21. De zebravis ontwikkelt nooit metanefros 21. Ondanks de zebravis eigenaardigheden, wordt de zebravis nefron gesegmenteerd met gen-expressie profielen gelijk aan die waargenomen bij zoogdieren en biedt daarmee een ongeëvenaarde in vivo model voor nefrogenese 3,22.
Routinematig patiënten worden getest op nierfunctie door een reeks van bloed en urine testen. Gewoonlijk wordt het bloed geanalyseerd op opgeloste zouten, ureum en creatinine. Hoge ureum, creatinine en abnormale zoutconcentraties zijn indicatief voor problemen nierfunctie. Urineonderzoek met behulp van een colorimetrische peilstok abnormale niveaus van eiwit, Bloo detecteertd, pus, bacteriën en suiker aanwezig in urinemonsters. Dergelijke tests normaliter ongeveer 30 ml urine of 5-10 ml bloed. Het is moeilijk om dit soort assays vertalen naar kleine in vivo modelorganismen, zoals de zebravis, vooral vanwege de onmogelijke aard verzamelen voldoende bloed of urine verrichten van de bepaling. Hier richten we ons op het ontbreken van passende zebravis nierfunctie tests en beschrijven een innovatieve techniek voor zijn studie. Door het injecteren van een fluorescente kleurstof in de bloedstroom we kunnen controleren en afzonderlijk kwantificeren tijd filtratie en uitscheiding van fluorescente activiteit van het bloed via de nieren. Deze methode kan worden gebruikt voor nierbeschadiging gevolge van ziekte, waarvoor wij een voorbeeld bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethiek Verklaring: Animal onderhoud, houderij en procedures worden vastgelegd en gecontroleerd door de Dieren (wetenschappelijke procedures) Act 1986. Alle dierproeven is op grond van certificaten door de minister van Binnenlandse Zaken (PIL No. 70/7892) verleende vergunning in overeenstemming met de biologische uitgevoerd Services Management Group en het Ethisch Comité Biological Services, SGUL, Londen, UK. Alle inspanningen werden gedaan om het aantal gebruikte dieren te verminderen en om beide procedures en veeteelt te verfijnen om het lijden welzijn te minimaliseren en te verbeteren.
1. Voorbereiding van de instrumenten, verdoving, en fluorescerende kleurstof
- Met behulp van een micropipet trekker en borosilicate standaard wand haarvaten (zonder draad) trekken naalden van de juiste lengte voor micro-injectie (Figuur 1A).
- Maak een agarose mal voor oriëntatie van embryo's voor een eenvoudige injectie in het hartzakje (Figuur 1B). Lijm ongeveer tien glazen microscoop slides samen om een 'trap' van offset dia's te vormen. Voor het beste resultaat, gebruik dan een druppel snelle set epoxyhars lijm in het midden van elke dia.
- Snijd er een opening van ongeveer 78 mm lengte halverwege twee 10 ml plastic pipetten met een bunsenbrander verwarmd scalpel, verwijder pipet eindigt naargelang het geval. Hechten en lijm (epoxy hars) pipet secties om de gestapelde glazen plaatjes om stabiliteit te bieden, zodat de mal te dompelen in een 90 mm petrischaal. Er alles aan doen om ervoor te zorgen de hoeken dia lijn loodrecht op de petrischaal vloer. Laat de lijm de tijd in te stellen.
- Zet de vorm in een 2% agarose-oplossing in viswater (verkregen uit het aquarium). Giet agarose in 90 mm Petri-schaal en leg de mal bovenop de open petrischaal, waardoor de gestapelde dia randen te dompelen schuin onder de agarose oppervlak. Laat op de labtafel om gedurende 30 min.
- Verwijder de cast glijbaan en dekken de-slide bedrukt agarose met verse vis waterbevattende tricaïne verdoving (zie stap 1.9) in een verhouding van 1:25.
- Maak oplossingen van rhodamine dextran (RD) kleurstof. Hersuspendeer rodamine B 10.000 MW gelabeld dextran in geautoclaveerd ultrapuur water om een voorraad concentratie van 50 mg / ml te maken. Voor micro-injectie, verder te verdunnen de voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 5 mg / ml in een autoclaaf ultrapuur water.
OPMERKING: pigmentcellen beginnen te differentiëren in de zebravis vanaf 24 uur na de bevruchting (HPF); deze kunnen fluorescerende markers verduisteren tijdens beeldopname. - Remmen melanocyten formatie met behulp van N -Phenylthiourea (PTU), die blokken melanogenesis door remming van tyrosinase. Wordt 0.003% voorraadoplossing van PTU door oplossen PTU poeder in aquariumwater warmte bij 60 ° C volledig oplosbaar.
- Incubeer zebravis embryo's in inthyleenblauwoplossing, een milde fungicide, om schimmel bloei te voorkomen en toename van de overleving. Voeg 2 ml methyleenchloride blauw stock-oplossing, die 0,1% Methyleenblauw in Ultrapure water, tot 1 liter aquariumwater en het gebruik als een standaard embryo medium.
- Verzin een 15 mM voorraad concentratie van tricaïne / ethyl-3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout volgens de instructies in "De zebravis Book '23. Verdoven het embryo en dus ze geïmmobiliseerd aan de micro-injectie uit te voeren.
- Na verlamming het embryo, oriënteren ze voor beeldvorming met niet-toxische en visceuze eigenschappen van methylcellulose. Om een preparaat van 3% methylcellulose 200 ml maken chill 130 ml water bij -20 ° C gedurende 30 min en plaats op ijs. Verwarm 70 ml water tot 80 ° C in een glazen beker, voeg 6 g methylcellulose en schud met een glazen staaf totdat alle deeltjes bevochtigd en gelijkmatig gedispergeerd. Voeg het ijskoude water, meng en laat de bereiding afkoelen bij 4 ° C gedurende 30 minuten voordat aliquoting in 50 ml buizen.
LET OP: Het verlagen van de temperatuur kan de methylcellulose aan oplosbare geworden. De oplossing zal dikkerals het poeder hydrateert. 3% methylcellulose kunnen worden opgeslagen zonder bacteriegroei gedurende korte week bij 4 ° C of meer bij -20 ° C. Zorg ervoor dat de methylcellulose heeft RT voor gebruik bereikt. - Injecties van fluorescente kleurstof te voeren in de zebravis gebruik maken van een standaard micro-injectie set-up (figuur 1C). Deze bestaat uit een luchtcompressor verbonden met een drukregelaar systeem voedt in een rechte pipet houder voor gebruik met 1,0 buitendiameter capillairen diameter. De pipet houder moet worden ondergebracht in een MM33 compacte 3-assige besturing micromanipulator om een stalen plaat bevestigd door een magnetische stand. Embryo's kunnen worden gevisualiseerd, gemanipuleerd en geïnjecteerd met behulp van een stereo dissectiemicroscoop.
2. zebravis Veehouderij en Pre-injectie Treatment
- Handhaaf zebravis zoals eerder beschreven 23. Gebruik een aquarium set-up die op een constante temperatuur van 28,5 ° C geleverd recirculerende water zorgt, Geconditioneerd om een pH van 6,8-7,2 en de geleidbaarheid van 450-550 mS met natriumbicarbonaat en Instant Ocean Zeezout, respectievelijk. Gebruik wildkleur of transgene zebravis lijnen zo nodig aan het experiment, het handhaven van een bezettingsdichtheid van 15 mannen en 15 vrouwen per 8 liter tank. Zet de vis faciliteit fotocyclus tot 14 uur daglicht tussen 09:00-23:00.
- Zebravis paaien begint bij het begin van de fotocyclus, wanneer de lichten in de ochtend. Om ervoor te zorgen maximale eieren kunnen worden verzameld zonder verstoring van de vis, dompel kweekbakken (met mesh inserts, verkrijgbaar bij de zebravis specialisten) in wildtype voorraad tanks de avond voor de collectie.
- Op de dag van inzameling, laat 30 - 40 min voor de vissen om te paaien, waarna verzamelen en spoel eieren met behulp van een theezeefje en vers aquariumwater. Stort de gereinigde eieren in een 90 mm petrischaal met embryo medium en incubeer bij 28,5 ° C.
- Behandel de embryo's met PTU naar melano remmengenesis. Op 8 HPF, overdragen levensvatbare embryo's in een mum van vloeibare verse petrischaaltjes met 1: 100 PTU om embryo medium en verder incuberen bij 28,5 ° C tot 72 HPF.
OPMERKING: PTU kan ontwikkelingsstoornissen afwijkingen veroorzaken indien gebruikt in eerdere stadia dus moet worden beperkt tot 8 HPF etappes te posten, maar kan zo laat 24 HPF worden behandeld. Late toevoeging van PTU niet volledig blokkeren oogpigmentatie maar is over het algemeen succesvol en remmen kofferbak melanocyten formatie.
3. Micro-injectie
OPMERKING: De hartzakje omhult het hart, maar wordt gescheiden voor de bescherming en het gemak van cardiale beweging door vloeistof in de pericardiale holte. Het doel van deze procedure is RD injecteren in de pericardiale holte, dit zorgt voor een snelle opname van de kleurstof aan het vaatstelsel systeem.
- Naalden lading met 6 pi - verwaterd RD, met behulp van microloader tips en veilig in de naald houder van de micromanipulator. Breek het einde van de naald met behulp van fijne tipped pincet (Figuur 1A). Verplaats de RD oplossing voor het punt van de naald door het maximaliseren van pulsduur om de minuten, terug te schakelen naar een keer compleet msec.
- Gebruik een micrometer, de drukregelaar en verfijningen naaldpunt lengte (met tang) om de grootte van de uitgestoten druppels instellen tot 100 urn in diameter, komt dit overeen met een 0,5 nl volume (Figuur 2A).
OPMERKING: Wanneer de naald breken, wees voorzichtig te veel af te breken anders zal maken het kalibreren van de injectie volume moeilijk. Indien nodig, verder breken van de naald naar de druppelgrootte echter te verhogen, een naald dikte die datum in het hartzakje zonder overmatig buigen of schade aan het weefsel toelaat te behouden. - Voorafgaand aan de injectie, verdoven de embryo's in embryo medium dat tricaïne. Het opzetten van 2 x 35 mm petrischaaltjes met 5 ml embryo medium, label een 'tricaïne' en de andere 'Recovery'.
- Voeg 200pi voorraad tricaïne naar de gepaste label gerecht. Eenmaal klaar om te injecteren, selecteer een individueel embryo in 72 HPF en overbrengen in een minimale vloeistof aan de tricaïne gerecht. Bewaken van de activiteit van het embryo, test het embryo wordt verdoofd en geïmmobiliseerd door voorzichtig schudden met behulp van een afgeknotte microloader tip.
- Breng de narcose embryo tot de injectie schimmel en oriënteren het embryo binnen een agarose trog zodat de linker kant naar boven is gericht, het positioneren van het hart aan de linkerkant van het gezichtsveld.
- Om de RD injecteren in het hart, doorboren het hartzakje met de naald en injecteer 1 nl van RD in de pericardiale holte van de narcose embryo (figuur 2B, rechter paneel). Trek de naald na de injectie. Breng de geïnjecteerde embryo in minimale vloeistof aan de 'Recovery gerecht' en monitor voor 1 min. Breng de individuele embryo tot een 24-wells plaat met 1 ml vers embryo medium (met PTU) en label op de juiste wijze.
NOTE: Het hartzakje is taai, maar er is een opmerkelijke zwak punt op de kruising waar het hartzakje voldoet aan de ventro-caudale pharynxbogen en dorso-rostrale dooierzak (Figuur 2B pijlpunt). De naald moet worden gericht aan deze groef. Wanneer de naald op zijn plaats is, zal een stevige tik van een vinger op de top van de micromanipulator binnenkomst in de pericardiale holte te vergemakkelijken. - Herhaal de stappen 3,2-3,6 voor ten minste 10 embryo's per experimentele groep, leg elke vis in een aparte goed en uniek labelto vergunning individuele experimentele follow-ups. Incubeer bij 28.5 ° C gedurende 3 uur.
4. Imaging Acquisition
- Om 3 uur na injectie (HPI) verdoven embryo's zoals eerder beschreven en over te dragen aan een 35 mm petrischaal met 3% methylcellulose. Druk voorzichtig embryo's in de methylcellulose en oriënteren, zodat de zijkant kan worden afgebeeld.
- Verwerven van een afbeelding van het embryo onder UV, toepassing van een filter voor visualisatie of uitgestraalde licht bij 570 nm (figuur 2C). Na het verwerven, zodat het embryo om te herstellen voordat het vervangen in zowel de aangewezen. Acquire beelden voor alle geïnjecteerde embryo's en verdere incuberen bij 28,5 ° C.
OPMERKING: In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van een tl-stereomicroscoop met een TXR filter set, een DFC300FX camera en bijbehorende software. Noteer de exacte overname instellingen voor de volgende afbeelding acquisitie. - Op 24 HPI verkrijgen een tweede beelden zoals hierboven beschreven. Nadat alle beelden zijn verkregen, zowel op 3 hpi en 24 hpi, humane manier ontdoen van de embryo's of het gebruik voor andere experimentele middelen bijvoorbeeld, immunohistochemie.
5. Beeldverwerking
- Kwantificeren van fluorescentie-intensiteit van elk geïnjecteerd embryo, op 3 hpi en 24 hpi, door het analyseren van beelden met behulp van NIH ImageJ software. Om fluorescentie-intensiteit te meten, open een afbeelding in ImageJ en geef een regio van belang (ROI) op 100 px 2 (Edit → selectie → specificeren).
- Plaats het hart in het centrum van de roi (figuur 2C), ingesteld metingen om gemiddelde grijstinten en omgeving zijn onder andere (Analyze → set metingen), meting uit te voeren (Analyze → maatregel). Vullen voor elke set van beelden, op 3 hpi en 24 hpi, per embryo en de overdracht gemiddelde grijswaarden naar een spreadsheet voor verdere verwerking.
LET OP: Wij selecteerden een vaste roi grootte van 100 px 2 als dit omvat individuele harten tussen embryo's. Het hart werd geselecteerd om metingen uit te voeren vanwege de grote omvang, dat een gunstige locatie in staat stelt om tl-gehalte van het bloed te meten voorafgaand aan het invoeren van de nier. - Voeren statistische analyses met behulp van geschikte statistische software. Vergelijk groepen voor statistische significantie met een t-toets.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bardet-Biedl syndroom (BBS) is een zeldzame heterogene ciliopathie dat ongeveer 1 beïnvloedt: 160.000 mensen wereldwijd 16. Patiënten presenteren zich met een aantal bijbehorende problemen, waaronder polycystische nieren, vervolgens patiënten vaak nodig nierdialyse of transplantatie 24. ESRF is de meest voorkomende doodsoorzaak bij BBS, met ongeveer 30% van de patiënten ontwikkelen van CKD 16. Momenteel zijn 20 niet-verwante genen geïmpliceerd in BBS zonder gepubliceerde genotype-fenotype associatie. De BBS eiwitten hebben gemeenschappelijke eiwit lokalisatie domeinen binnen de cilium en basale lichamen die, samen met de kenmerkende eigenschappen van de patiënten ', concluderen een ciliopathie diagnose. BBS9 codeert Parathyoid hormoon-responsieve B1 (PTHB1) eiwit dat samen met andere BBS (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) eiwitten vormen de kern BBSome complex verantwoordelijk voor de vorming van de primaire cilium 24. Mutaties in BBS9 rekening voor 6% van de BBS cases 24. Bovendien is PTH betrokken bij nier cysten door de bevordering van renale epitheliale celproliferatie, suggereert dat het verlies van bbs9 functie zebravis zou renale gebreken 25 weergegeven. Eerdere rapporten met behulp van een bbs9 knockdown zebravismodel sluiten een beschrijving van de nier, de presentatie van de mogelijkheid om de beschreven nierfunctie assay 26 demonstreren. Knockdown van bbs9 functie is in zebravis verkregen door injectie, op de 1- tot 4-cellig stadium, een antisense morfolino om genspecifieke bbs9 vertaling en tegelijkertijd een standaard negatieve controle morfolino blokkeren tegen een intron mutatie in beta-globine (4 ng bbs9 MO, volgorde: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA en 4 ng controle MO, volgorde: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). We vonden dat het verlies van bbs9 functie resulteerde in 40% van de embryo's tonen van pronephric cysten door 5 dpf, suggereert dit was een geschikt model te analyserennierfunctie met behulp van de rhodamine dextran speling assay. We zagen dat morphant vis een aanzienlijke vermindering van hun vermogen om de fluorescente kleurstof wissen nadat 24 HPI vergelijking met controles (Figuur 3) - con: 14,8 ± 1,2 SEM, n = 9; bbs9 MO: 61.0 ± 10.3 SEM, n = 10 ; ongepaarde t-test p-waarde: 0,002). Om uit te sluiten van het potentieel dat de verminderde klaring zou kunnen zijn als gevolg van verminderde bloedcirculatie, werden embryo's geëvalueerd voor hartslag en recirculatie bloedcellen, zowel controle en morphant vis hadden vergelijkbare hartslag en de doorbloeding. Deze gegevens wijzen erop dat de nierfunctie verslechtert in bbs9 morphants. Inderdaad, bbs9 morphant embryo's ontwikkelen cystische pronephric buisjes tegelijk met die waargenomen bij BBS patiënten.
Figuur 1. apparatuur voorbereidingen set-up. (A) Borosilicate haarvaten moeten worden getrokken voor de micro-injectie met een geschikte naald trekker. De naald vereist breken met een tang (stippellijn) aan de RD toe om de naald af te sluiten, moet erop worden gelet dat de naald niet te breken te veel het renderen van een naald die niet kunnen worden gekalibreerd. Schaalbalk:. 200 pm (B) Een agarose mal voor embryomanipulatie en oriëntatie kan worden gevormd door samen te lijmen glasplaatjes en kunststof pipetten (C) De standaard micro-injectie set-up.. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Micro-injectie van rhodamine dextran in de pericardiale zak. (A) IJk de druppelgrootte tot 10 inctaan (100 micrometer) op een 1 mm stadium tasje. (B) Een correcte positionering van de naald (zwarte pijlen) in de gletsjerspleet markering van de kruising tussen de caudale faryngeale boog, dooierzak en het hart zal vergemakkelijken piercing het weefsel (pijlpunt). Schaalbalk. 200 urn (C) Rhodamine dextran blijkt snel opgenomen door het gehele vaatstelsel (witte pijlen). 100 px 2 gebieden van belangen die een gecentraliseerde hart (geel vierkant) moet worden gebruikt om metingen van de gemiddelde grijswaarde en dus pixel / fluorescentie-intensiteit te nemen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Knockdown van bbs9 veroorzaakt defecte nieren functie in de zebravis. (A) Embryo geïnjecteerd in het pericardium met rhodamine dextran 3 HPI en 24 HPI, bovenste en onderste twee panelen respectievelijk in beide control of bbs9 morphant embryo. Pijlpunten geven aan het hart; pijl geeft de vorming van een pronephric cyste. (B) Percentage fluorescentie-intensiteit overblijft na 24 HPI controle versus bbs9 MO embryo. Fout balken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM), ** P ≤ 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebravis een kwaliteit in de modellering van menselijke genetische ziekten, hun gebruik als een wetenschappelijk instrument voor in vivo onderzoek gedetailleerde studies van de genetische analyse van vele biologische systemen, waaronder de nieren ingeschakeld. Veel wordt nu begrepen over hoe de zebravis nier ontwikkelt en functies. De opvallende gelijkenissen voor de menselijke nefrogenese en homologie met ziektegenen 21 is duidelijk geworden dat de zebravis zijn fundamentele geworden in het begrijpen hoe defecten in gen-functie leiden tot de pathologie van nierziekte. Inderdaad, kan genetische manipulatie moeiteloos worden bereikt in de zebravis met behulp van antisense morfolino- knockdown technologie of meer geavanceerde gerichte genoom editing tools zoals TALENS of CRISPR. Maken knockdown of mutant modellen verdenking nierziekte genen is de eerste stap in het begrijpen van hun rol bij de ziekte manifestatie. Om dit een betrouwbare test voor nierfunctie wordt gevraagd,aan te geven of een kandidaatgen is waarschijnlijk verantwoordelijk voor de pathologie waargenomen bij patiënten.
Nierfunctietesten zijn eenvoudig en relatief goedkoop te voeren op mensen, meestal kijken niveaus van opgeloste stoffen in het bloed of urine. Echter, deze methoden zijn niet van toepassing in de zebravis vanwege zijn kleine formaat en aquatische habitat. De rhodamine dextran assay beschreven gebruikt het vermogen van pronephric tubules laag moleculaire componenten van het bloed te filteren. De podocytes gepositioneerd binnen kapsel van de nier van de Bowman, dat enveloppen de haarvaten van de glomerulus, zodat de vrije passage van kleine moleculen zoals water, ionische zouten en glucose via een spleetdiafragma 27. De filtratie spleten verder dienen om het verlies van macro eiwitten uit het bloed te voorkomen. Filtratie is beperkt moleculen dan 5 kDa en bijna volledig geblokkeerd door de grootte van serumalbumine 28 (ca.0; 65 kDa). Door het injecteren van een fluorescente kleurstof dextran van ongeveer 10 kDa, bij een bekende concentratie in de pericardiale holte, kunnen wij fluorescentie-intensiteit van het bloed te meten tijd. Onder normale omstandigheden ongeveer 85% van de initiële fluorescentie verloren uit het bloed gedurende een periode van 24 uur, door uitscheiding via de nier. Men moet er rekening mee dat de injectie in pericardiale ruimte is alleen mogelijk met een laag MW dextran die vrij in het vaatstelsel passeert. Zo, deze test geeft slechts een uitlezing voor de snelheid van de vrije ruimte voor laagmolecuulgewichtcomponenten en bevat geen informatie over de effectiviteit van de glomerulaire filtratiesnelheid geven. De laatste kan geëvalueerd worden meer rechtstreeks met behulp van hoge gewicht kleurstoffen moleculaire dan 70 kDa, die injectie in het vaatstelsel en niet in de pericardiale ruimte. Inderdaad, kan dextrans van verschillende MW worden gebruikt om de nierfunctie 28 verder te ontrafelen.
De zebravis pronephric buisjes zijn zeer trilharen met motegel cilia dat de beweging van het filtraat te vergemakkelijken in de richting van de cloaca 3,4. Defecten in ciliaire machines zijn betrokken bij nierziekte. BBS is een genetisch heterogene, autosomaal recessieve aandoening gekenmerkt door jeugd-onset retinale degeneratie, vroeg begin obesitas, cognitieve stoornissen, polydactylie en renale misvorming 24. Tot op heden zijn 20 BBS genen (BBS1-20) geïdentificeerd. Verstoring van bbs leidt tot niercyste vorming en defecte pronephric functie in de zebravis 9. BBS9 wisselwerking met andere BBS eiwitten aan de BBSome verantwoordelijk voor de juiste ciliogenese vormen, mutaties van die goed zijn voor 6% van de BBS gevallen 24. Terwijl een zebravis bbs9 knockdown model is beschreven, een beschrijving van de renale fenotype ontbrak 26. Door neerhalen bbs9 in zebravis, met de morfolino benadering tonen we het gebruik van de renale klaring assay als een manier vastnierfunctie bij een nierziekte model. Hier laten we zien dat bbs9 morphant embryo weer belemmerd tl-klaring uit de bloedstroom, wat aangeeft dat de nieren niet te laag MW opgeloste stoffen te verwijderen. Aldus, vanwege de betrokkenheid van bbs9 in ciliogenese, en de rol van pronephric cilia in filtraat beweging vergemakkelijken, de nieren waargenomen speling in morphants waarschijnlijk te wijten aan afwijkende cilia functie. Deze methode is een waardevol instrument voor de beoordeling van de nierfunctie bij zebravis ziekte modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Technische assistentie door Jaipreet Bharj. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de EU-FP7 (SYSCILIA -241.955) en De Nederlandse Nierstichting (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L.
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
