Summary
דג הזברה הוא כלי פופולרי למודל מחלת כליות כרונית (CKD). עם זאת, גודלם הקטן עושה את זה בלתי אפשרי להעריך תפקוד הכלייתי בשיטות מסורתיות. אנו מתארים assay אישור כליות צבע ניאון 1 המאפשר ניתוח כמותי של תפקוד כליות דג הזברה בCKD.
Abstract
עובר דג הזברה מציע מודל צייתן ללמוד organogenesis ומודל מחלה גנטית אנושית. למרות פשטותו היחסית, בכליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות כמעט באותה הצורה כמו בני אדם. הבדל עיקרי בבנייה של הכליה האנושית הוא נוכחותם של מיליונים nephrons בהשוואה לדג הזברה שיש רק שניים. עם זאת, פישוט מערכת כה מורכבת ליחידות פונקציונליות בסיסיות סייע ההבנה של איך כליות מפתחת ומפעילות. בדג הזברה, קו האמצע ממוקם glomerulus אחראי על סינון הדם הראשוני לשתי צינוריות pronephric שלסטות לרוץ בילטרלי במורד הציר העוברי לפני שהוא נדבק זה לזה בביב. Tubules pronephric מאוכלסים בכבדות על ידי cilia ניעתי שיקל על התנועה של תסנין לאורך אבובית מפולחת, המאפשר החלפה של מומסים שונים עד שלבסוף יציאה באמצעות 2-4 הביב. גנים רבים אחראים למחלת כליות כרונית, including אלה הקשורים לciliogenesis, נחקרו בדג הזברה 5. עם זאת, תיקו גדול בחזרה היה הקושי בהערכת תפקוד כליות דג הזברה לאחר מניפולציה גנטית. מבחני מסורתיים למדידת הפרעות בתפקוד כליות בבני האדם הוכיחו translational לא לדג זברה, בעיקר בשל הסביבה המימית שלהם וגודל קטן. לדוגמא, זה לא אפשרי מבחינה פיזית כדי לחלץ דם עוברי ממבוימים דגים לניתוח של תוכן אוריאה וקריאטינין, כפי שהם קטנים מדי. בנוסף, דג הזברה אינה מייצר מספיק שתן לבדיקה על 'המדיד' פרוטאינוריה פשוטה, המבוצע לעתים קרובות במהלך בדיקות ראשוניות מטופל. אנו מתארים assay ניאון שמנצל את השקיפות האופטית של דג הזברה כדי לפקח כמותית האישור של צבע ניאון, לאורך זמן, מכלי הדם והחוצה דרך הכליות, לתת קריאה מתוך תפקוד הכלייתי 1,6-9.
Introduction
הכליה האנושית משחקת תפקיד מכריע בסינון פסולת המטבולית מן הדם ומתאושש מומסים נדרשים כדי לקיים הומאוסטזיס הסלולר. ישנם מספר מחלות גנטיות אנושיות הגורמות להפרעות בתפקוד כליות. מחלת הכליות התורשתית הנפוצה ביותר היא מחלה אוטוזומלית דומיננטית בכליות פוליציסטיות (ADPKD) מאופיינת בהתפתחות של שלפוחיות נוזל מילא בתוך צינוריות נפריטית; הנזק שנגרם על ידי cystogenesis הוא מזיק לכליות פונקציה 10. יש ADPKD התרחשות של 1: 800 - 1: 1000 ומהווה 8-10% מהחולים באי ספיקת כליות סופנית (ESRF) 11. מספר גנים היו מעורבים לגרום ADPKD כולל polycystin-1 (PKD1) ו-2 (PKD2), המהווים כ 85% ו- 15% מהמקרים, בהתאמה 12,13. יתר על כן, מוצרי הגן לPKD1 ו-2 למקם את cilium והם יסוד לciliogenesis 14,15. יש עכשיו משפחה מוכרת של הפרעות גנטיות אנושיות, הידוע בשםciliopathies, המשפיע על פעילות cilia ולגרום למחלת כליות כרונית 16.
המספר הולך וגדל של מחלות גנטיות אנושיות המשפיעות על התפתחות ותפקוד הריסים הוא ציור העניין העולמי באברון שריד שנחשב בעבר זה. Cilium, בליטה סלולרית דמוי שיער, מועשרת בקולטנים ותעלות יונים הכרחיים לתמרה של אירועי תא איתות מפתח. Cilium מורכב מaxoneme מבוסס microtubule, מובנה בדרך כלל לתשע כפילויות microtubule מסודרות רדיאלית עם או בלי זוג microtubules הגופייה מרכזי. מבנה axonemal מגדיר את הסוג ואופן פעולה הריסים. הסדר microtubule 9 + 2 מעניק תנועתיות לcilium שבו הוא ניצל בתנועה של נוזלים על פני משטחי אפיתל. תצורת 9 + 0 היא הניעה שאינה אלא הוא האמינה בעיקר פונקציה באירועי איתות תאית 17. מלבד CKD, את ההשלכות של חוסר תפקוד הריסים הן קבוצה של מאפייןתכונות ciliopathy הכוללות, השמנת יתר, ניוון רשתית, פולידקטיליה, ופגיעה קוגניטיבית 16. עם זאת, CKD הוא בין המזיקה ביותר לאיכות חיים של החולה ולכן כוח מניע מרכזי מאחורי הפיתוח של דגמים מתאימים בvivo לCKD הריסים קשורים.
דג הזברה הוא מודל מצוין להבין את האטיולוגיה של מחלה גנטית אנושית. הפיתוח מהיר שלהם, ייצור של מספר הגדול של ביצים, רקמה שקופה, וצמיחה ברחם לשעבר מאפשר תהליכי התפתחות דג הזברה להיות דמיינו ואירועים ביולוגיים מניפולציות בקלות רבה. גנים ניתן לשנות גנטי באמצעות ההצלחה האחרונה של כלים לעריכת הגנום (CRISPR 18 וTALENS 19), הפילו את השימוש בטכנולוגית morpholino antisense 20, או מוסדרים פרמקולוגית על ידי התוספת של תרכובות לסביבה המימית שלהם. ואכן, דג הזברה להציע פלטפורמה למתחייבת דוארxperiments שאינם מתירנית במודלים של בעלי חיים אחרים. בעוד דג הזברה הם בעלי חוליות פשוטות יחסית (בהשוואה לבני אדם) הם חולקים איברים רבים נשמרים פונקציונלי, גנים, ותהליכי איתות במשותף עם בני אדם. לדוגמא, בכליות דג הזברה היא דומות להפליא במבנה ותפקוד בהשוואה לבני האדם 21,22. עם זאת, בניגוד לכליות היונקים שמתפתחת דרך רצף של שלבים, כל אחד מסומן על ידי כליות מפותחות יותר (כִּליַת רֵאשִׁית, כליה בינים, וmetanephros), דג הזברה העוברית מתפתחת רק כִּליַת רֵאשִׁית, בצורה לא בוגרת ביותר של כליות. בעוד ניתן למצוא מיליוני nephrons להרכיב את אבני הבניין של הכליות היונקים, עובר דג הזברה יש רק שניים. Glomeruli, המאפשרת לתסנין הדם הראשוני, הם התמזגו בקו האמצע רק הגחון לאב העורקים. מסנני דם דרך glomeruli לtubules pronephric הפועלים caudally לאורך הציר, פיוזינג לפני היציאה דרך הביב. Tu pronephricbules הם ריסי בכבדות עם cilia ניעתי, כי הם מתירנית לזרימה של תסנין לכיוון יציאת הזנב 3,4. מבנה pronephric פשוט זו שומר על הומאוסטזיס דג הזברה דרך מספר שבועות של צמיחת זחל שבו הם לפתח סופו של דבר למבנה כליה בינים מורכב יותר 21. עם זאת, מעולם לא דג הזברה מתפתחת metanephros 21. למרות מוזרויות דג הזברה, נפרון דג הזברה הוא מקוטע עם פרופילי ביטוי גנים שווים לזה שנצפה ביונקים ובכך מציע ללא תחרות במודל vivo לnephrogenesis 3,22.
באופן שיגרתי בחולים, נבחנו צורך בתפקוד כליות באמצעות סדרה של בדיקות דם ושתן. בדרך כלל הדם מנותח למומס מלחים, אוריאה וקריאטינין. רמות גבוהות של אוריאה, קריאטינין וריכוזי מלח חריגים מעידות על בעיות בתפקוד כליות. בדיקת שתן באמצעות מדיד colorimetric מזהה רמות חריגות של החלבון, blooד, מוגלה, חיידקים והווה סוכר בדגימות שתן. בדיקות כאלה בדרך כלל דורשים כ 30 מיליליטר של שתן או 5 - 10 מיליליטר של דם. זה כבר קשה לתרגם סוגים אלה של מבחני לקטנים באורגניזמים מודל vivo, כגון דג הזברה, בעיקר בשל האופי הבלתי אפשרי של איסוף דם או שתן מספיק כדי לבצע את assay. כאן, אנו מתייחסים לחוסר בדיקות פונקציה מתאימות דג הזברה כליות ולתאר טכניקה חדשנית למחקר שלה. על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לתוך זרם הדם אנו יכולים לפקח ובנפרד לכמת לאורך זמן הסינון והפרשה של פעילות ניאון מהדם דרך הכליות. שיטה זו יכולה לשמש כדי לחקור נזק לכליות הנגרמות על ידי מחלה, שאנו מספקים דוגמה ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה: בעלי חיים תחזוקה, בעלי, ונהלים מוגדרים ונשלטים על ידי בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986. כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו תחת רישיונות שניתנו על ידי שר הפנים (PIL מס '70/7892) בעמידה בביולוגית שירותי קבוצת ניהול והוועדה אתיקה הביולוגיים השירותים, SGUL, לונדון, בריטניה. כל המאמצים שנעשו כדי לצמצם את מספר בעלי החיים המשמשים וכדי לחדד את שני ההליכים והבעלים כדי למזער את הסבל ולשפר את הרווחה.
1. הכנה של מכשירים, הרדמה, ופלורסנט דיי
- באמצעות חולץ micropipette ונימים סטנדרטיים ורוסיליקט קיר (ללא חוטים) למשוך מחטים באורך המתאים לmicroinjection (איור 1 א).
- תן עובש agarose לכיוון של עוברים להזרקה קלה לקרום הלב (איור 1). דבק כ sl מיקרוסקופ עשר זכוכיתאידו יחד כדי ליצור "מדרגות" של שקופיות קיזוז. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש טיפת דבק שרף אפוקסי הסט המהיר במרכזו של כל שקופית.
- פיפטה לגזור קטע של כ 78 מ"מ באמצע דרך אורך דרך שתי טפטפות פלסטיק 10 מיליליטר באמצעות אזמל מחומם מבער בונזן, להסיר מסתיימת כפי שראוי. צרף וחתכים דבק פיפטה (שרף אפוקסי) לשקופיות זכוכית נערמו כדי לספק יציבות כדי לאפשר העובש לטבול לתוך צלחת פטרי 90 מ"מ. לעשות כל מאמץ כדי להבטיח את פינות השקופיות ליישר אנכיות לרצפת צלחת פטרי. לאפשר זמן דבק להגדיר.
- עופרת העובש בפתרון agarose 2% שנעשה במי דגים (שקבל את האקווריום). יוצקים agarose לתוך צלחת פטרי 90 מ"מ ומניח את התבנית על גבי צלחת פטרי הפתוחה, המאפשר את השקופית נערמה קצוות כדי לצלול בזווית מתחת לפני שטח agarose. השאר להגדיר על ספסל המעבדה למשך 30 דקות.
- הסר את גבס השקופיות ולכסות את agarose-טבוע שקופיות עם מים דגים טרייםהמכיל חומר הרדמה Tricaine (ראה שלב 1.9) בשעה 01:25 יחס.
- הפוך את הפתרונות של dextran rhodamine צבע (RD). rhodamine B Resuspend 10,000 מגה וואט שכותרת dextran במי ultrapure autoclaved לעשות ריכוז מניות של 50 מ"ג / מיליליטר. עבור microinjection, נוסף לדלל את המניות לריכוז סופי של 5 מ"ג / מיליליטר במי ultrapure autoclaved.
הערה: תאי פיגמנט מתחילים להבחין בדג זברה מ -24 שעות לאחר הפריה (hpf); אלה יכולים לטשטש סמני ניאון במהלך רכישת תמונה. - לעכב היווצרות מלנוציט באמצעות N -Phenylthiourea (PTU), אשר חוסם melanogenesis באמצעות עיכוב של טירוסינאז. הפוך פתרון מניות 0.003% מPTU ידי המסת אבקת PTU במי אקווריום, פתרון חום על 60 מעלות צלזיוס לsolubilize באופן מלא.
- דגירה עוברי דג הזברה בפתרון מתילן כחול, פטריות קלות, כדי למנוע פריחת פטרייתי ולהגדיל את ההישרדות. הוסף 2 מיליליטר של פתרון מניות מתילן כחול, המכיל 0.1% מתילן כחול בuמים ltrapure, ל1 ליטר של מים ושימוש באקווריום כמדיום עובר סטנדרטי.
- מרכיבים את ריכוז מניית 15 מ"מ של Tricaine מלח methanesulfonate / אתיל 3-aminobenzoate כפי שהורה "ספר דג הזברה '23 ב. להרדים את העוברים וכתוצאה מכך המשותק כדי לבצע את הליך microinjection.
- לאחר הרדמת העוברים, לכוון אותם, להדמיה באמצעות הנכסים שאינם רעילים וצמיג של methylcellulose. כדי להפוך הכנת 200 מיליליטר של methylcellulose 3%, לצנן 130 מיליליטר מים ב -20 ° C למשך 30 דקות ומניחים על קרח. מחממים 70 מיליליטר של מים עד 80 מעלות צלזיוס בכוס זכוכית, להוסיף 6 גרם של methylcellulose, ולהתסיס באמצעות מוט זכוכית עד שכל החלקיקים רטוב ומפוזר באופן שווה. מוסיף את המים קרים כקרח, לערבב, ולאפשר ההכנה להתקרר על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני aliquoting לצינורות 50 מיליליטר.
הערה: הורדת הטמפרטורה מאפשרת methylcellulose להפוך מסיס. הפתרון יהיה עבה יותרכמלחלח אבקה. 3 methylcellulose% ניתן לאחסן ללא צמיחת חיידקים לתקופות קצרות של שבוע על 4 מעלות צלזיוס או יותר ב -20 ° C. ודא methylcellulose הגיע RT לפני השימוש. - כדי לבצע זריקות של צבע ניאון לדג הזברה להשתמש הגדרה סטנדרטית microinjection (איור 1 ג). זה מורכב ממדחס אוויר מחובר למערכת ווסת לחץ שמזינה לתוך מחזיק פיפטה ישר לשימוש עם 1.0 נימי קוטר חיצוניות. בעל פיפטה יש שוכן בתוך micromanipulator MM33 הקומפקטי 3 ציר שליטה מאובטח לצלחת בסיס פלדה על ידי דוכן מגנטי. ניתן דמיינו עוברים, מניפולציות והזריקו באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו.
2. דג הזברה בעלי וטיפול טרום הזרקה
- לשמור על דג הזברה כמתואר 23 בעבר. השתמש בהגדרת אקווריום המספקת מים הסירקולציה מחודשים מסופקים בטמפרטורה קבועה של 28.5 מעלות צלזיוס, מותנה pH 6.8-7.2 ומוליכות של 450-550 מייקרו-שניות עם סודיום ביקרבונט ומיידי אוקיינוס מלח ים, בהתאמה. השתמש wildtype או קווי דג הזברה מהונדסים כמתאים לניסוי, שמירה על צפיפות גרב של 15 זכרים לנקבות 15 ל8 טנק L. הגדר את photocycle מתקן דגים עד 14 שעות של אור יום בין 09:00-23:00.
- השרצה דג הזברה מתחילה בתחילת photocycle, כאשר האורות להדליק בבוקר. כדי להבטיח ניתן לאסוף ביצים המרביות מבלי להפריע את הדגים, לצלול (מוסיף המכיל רשת, זמין ממומחי דג הזברה) טנקי רבייה לטנקי מניית wildtype הערב לפני האוסף.
- ביום האוסף, לאפשר 30-40 דקות לדגים להשריץ, לאחר שיאסוף ולשטוף ביצים באמצעות מסננת תה ומים באקווריום טריים. להפקיד את הביצים ניקו במדיום עובר המכיל 90 מ"מ צלחת פטרי ולדגור על 28.5 מעלות צלזיוס.
- פנק את העוברים עם PTU לעכב melanoספר בראשית. בשעת 8 בhpf, להעביר עוברי קיימא בנוזל מינימאלי לצלחות פטרי טריות המכילות 1: 100 PTU עד בינוני עובר ודגירה נוספת על 28.5 מעלות צלזיוס עד 72 hpf.
הערה: PTU יכול לגרום למומים התפתחותיים אם משתמש בו בשלבים מוקדמים יותר כך צריך להיות מוגבלים לפרסם 8 שלבי hpf, אך ניתן לטפל בי מאוחר ככל 24 hpf. תוספת מאוחרת של PTU לא תחסום באופן מלא פיגמנטציה עין אך היא בדרך כלל מוצלח ועיכוב היווצרות מלנוציט תא המטען.
3. Microinjection
הערה: קרום הלב encases הלב אבל מופרד להגנה וקלות התנועה של הלב על ידי נוזל בתוך חלל קרום הלב. מטרתו של נוהל זה היא להזריק RD לתוך חלל קרום הלב, זה מאפשר לספיגה מהירה של הצבע למערכת כלי הדם.
- מחטי עומס עם 6 μl - בדילול RD, באמצעות טיפים microloader ולהבטיח לבעל המחט של micromanipulator. לשבור את הקצה של המחט באמצעות טיפקס בסדרהמלקחיים ed (איור 1 א). הזז את פתרון RD לקצה המחט על ידי ניצול מרבי משך דופק להגדרת דקות, לחזור לMSEC פעם מלאה.
- השתמש מיקרומטר שלב, ווסת הלחץ, וחידודים לאורך קצה מחט (באמצעות מלקחיים) כדי להתאים את הגודל של רביב גורש 100 מיקרומטר בקוטר, זה משווה ל 0.5 נפח nl (איור 2 א).
הערה: כאשר שבירת המחט, להיזהר לא לשבור יותר מדי את אחרת זה יעשה כיול נפח ההזרקה קשה. במידת צורך, לשבור עוד קצה המחט כדי להגדיל את גודל הירידה עם זאת, לשמור על עובי מחט המאפשר כניסה לקרום הלב ללא כיפוף או נזק מופרזים לרקמות. - לפני הזריקה, להרדים את העוברים במדיום עובר המכילים Tricaine. הגדר את 2 x 35 מ"מ צלחות פטרי המכילים 5 מיליליטר בינוני עובר, 'Tricaine' תווית אחת ו'שחזור 'האחר.
- הוסף 200μl של המניה Tricaine לצלחת שכותרתו כראוי. ברגע מוכן להזרים, בחר עובר בודד ב 72 hpf ולהעביר בנוזל מינימאלי למנת Tricaine. לפקח על הפעילות של העובר, לבדוק את העובר הוא הרדים ומשותק על ידי תסיסה עדינה באמצעות קצה microloader קטוע.
- העבר את העובר הרדים להזרקת העובש ולהתמצא העובר בתוך שוקת agarose כך בצד השמאל פונה כלפי מעלה, מיצוב הלב בצד השמאל של שדה הראייה.
- להזריק RD ללב, לחדור את קרום הלב עם המחט ולהזריק nl 1 של RD לתוך חלל קרום הלב של העובר המורדם (איור 2, פנל מימין). למשוך את המחט לאחר הזרקה. העבר את העובר המוזרק בנוזל מינימאלי ל'צלחת השחזור 'ולפקח דקות 1. העבר את עובר הפרט לצלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר בינוני עובר טרי (המכיל PTU) ולתייג כראוי.
הערה: קרום הלב הוא קשה, עם זאת יש נקודת תורפה בולטת בצומת שבו קרום הלב פוגש את קשתות ventro-הזנב בלוע וצק חלמון dorso-מקורי (חץ איור 2). המחט צריכה להיות מופנה לחריץ זה. כאשר המחט נמצאת במקום, ברז משרד אצבע על גבי micromanipulator יאפשר כניסה לתוך חלל קרום הלב. - חזור על שלבים 3.2-3.6 לפחות 10 עוברים לכל קבוצת ניסוי, למקם כל דגים ובנפרדים ומעקב ניסיוני בודד היתר ייחודי labelto. לדגור על 28.5 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
4. הדמיה רכישה
- בשעת 3 לאחר שעה הזרקה (HPI) להרדים עוברים כפי שתואר לעיל ולהעביר לצלחת פטרי המכילה 35 מ"מ methylcellulose 3%. דחף בעדינות העוברים לmethylcellulose ולהתמצא כך הצד לרוחב ניתן הדמיה.
- לרכוש תמונה של העובר תחת UV, באמצעות מסנן עבור o להדמיהf נפלטה אור ב 570 ננומטר (איור 2 ג). לאחר רכישת תמונה, לאפשר את העובר להתאושש לפני החלפה במיועדת גם. לרכוש תמונות לכל עוברים המוזרקים ודגירה נוספת על 28.5 מעלות צלזיוס.
הערה: בפרוטוקול זה השתמשנו סטראו ניאון עם מערכת סינון TXR, מצלמה DFC300FX ותוכנת יישום המתאימה. רשום את ההגדרות המדויקות רכישה לרכישת תמונה שלאחר מכן. - בגיל 24 HPI, לרכוש סיבוב של תמונות שנייה כפי שתואר לעיל. ברגע שכל התמונות שנרכשו, בשני HPI 3 ו -24 HPI, יחס אנושי להשליך את העוברים או להשתמש באמצעים אחרים ניסיוניים למשל, אימונוהיסטוכימיה.
עיבוד 5. תמונה
- לכמת עוצמת ניאון של כל עובר מוזרק, בשעה 3 HPI ו -24 HPI, על ידי ניתוח תמונות באמצעות תוכנת ImageJ של NIH. כדי למדוד עוצמת ניאון, פותח תמונה בImageJ ולציין אזור של עניין (ROI) בשעה 1(בחירת → עריכת → לציין) 00 px 2.
- מקם את הלב במרכז ROI (איור 2 ג), להגדיר מדידות לכלול בקנה מידה אפורה ממוצעת ואזור (לנתח → מדידות סט), לבצע מדידה (לנתח → מידה). השלם עבור כל קבוצה של תמונות, בשעה 3 HPI ו -24 HPI, לכל עובר ולהעביר ערכים בקנה מידה אפורה ממוצע לגיליון אלקטרוני לעיבוד נוסף.
הערה: בחרנו גודל roi קבוע של 100 px 2 כמו זה מקיף את לב פרטני בין עוברים. הלב נבחר לביצוע מדידות בשל גודלו הגדול המאפשר מיקום נוח למדוד תוכן ניאון של הדם לפני כניסה לכליות. - ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות תוכנה סטטיסטית מתאימה. השוואה בין קבוצות למובהקות סטטיסטיות באמצעות מבחן t של סטודנט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תסמונת Bardet-Biedl (BBS) היא ciliopathy הטרוגנית נדיר שפוגע בכ -1: 160,000 איש ברחבי העולם 16. חולים הנוכחיים עם מספר הבעיות הקשורות כוללים כליות פוליציסטיות, לאחר מכן חולים לעתים קרובות דורשים דיאליזה או השתלת כליה 24. ESRF הוא הגורם השכיח ביותר למוות בBBS, עם כ -30% מחולים שפתח CKD 16. נכון לעכשיו, 20 גנים הקשורים הלא היו מעורבים בBBS ללא קשר גנוטיפ, פנוטיפ שפורסם. חלבוני BBS לשתף תחומים לוקליזציה חלבון נפוצים בגופי cilium ובסיסיים ש, יחד עם תכונות האופייניות של החולים, להסיק אבחון ciliopathy. BBS9 מקודד B1 Parathyoid הורמון מגיב חלבון (PTHB1) שביחד עם BBS האחר (BBS1, BBS2, BBS4, BBS5, BBS7, BBS8) חלבונים יוצרים את הליבה BBSome אחראית מורכבת ליצירת cilium העיקרי 24. מוטציות בחשבון BBS9 במשך 6% מג BBS24 ases. יתר על כן, PTH היה מעורב בהיווצרות ציסטה בכליות באמצעות קידום שגשוג תאי האפיתל כליות, המצביע על הפסד של פונקצית bbs9 בדג זברה עשוי להציג פגמי כליה 25. דיווחים קודמים תוך שימוש במודל דג הזברה bbs9 מציאה לכלול תיאור של הכליות, המציגים את ההזדמנות להפגין assay תפקוד הכליות תאר 26. מציאה של פונקצית bbs9 הושגה בדג זברה על ידי הזרקה, בשלב 1 עד 4 תאים, morpholino antisense לחסום תרגום גן ספציפי bbs9 ובמקביל morpholino שליטה שלילי סטנדרטי נגד מוטציה אינטרוניים בbeta-גלובין אדם (4 ng bbs9 MO, רצף: GGCCTTAAACAAAGACATCCTGTAA וMO שליטה 4 ng, רצף: CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA). מצאנו כי אובדן תפקוד bbs9 הביא 40% מעוברים בו מוצגות ציסטות pronephric על ידי 5 DPF, מה שמרמז שזה היה מודל מתאים לניתוחתפקוד כליות באמצעות assay אישור dextran rhodamine. אנו הבחנו שיש לי דגי morphant ירידה משמעותית ביכולת שלהם כדי לנקות את צבע פלואורסצנטי לאחר 24 HPI השוואה לקבוצת ביקורת (איור 3) - con: 14.8 ± 1.2 SEM, n = 9; MO bbs9: 61.0 ± 10.3 SEM, n = 10 ; ערך מזווג מבחן t P: 0.002). כדי לשלול את הפוטנציאל שצמצם אישור יכול להיות בגלל זרימת דם מופחתת, עוברים הוערכו לתאי פעימות לב ודם הסירקולציה מחודש, שליטה ודגי morphant היו קצב לב דומה וזרימת דם. נתונים אלה מצביעים על כך שתפקוד כליות נפגעים בmorphants bbs9. ואכן, עוברי morphant bbs9 לפתח tubules pronephric פיברוזיס במקביל לזה שנצפה בחולי BBS.
הכנת 1. ציוד איורוהגדרה. צריכים להיות משך נימי בורוסיליקט () לmicroinjection באמצעות חולץ מחט מתאים. המחט דורשת שבירה עם מלקחיים (קו מקווקו) להתיר RD כדי לצאת מהמחט, יש להיזהר לא לשבור את המחט יותר מדי טיוח מחט שלא יכול להיות מכוילת. בר סולם:. 200 מיקרומטר (B) עובש agarose למניפולצית עובר וכיוון יכול להיות מעוצב על ידי הדבקה יחד שקופיות זכוכית והפלסטיק טפטפות (C) הגדרת microinjection סטנדרטית.. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
Microinjection איור 2. של dextran rhodamine לתוך שק קרום הלב. () כייל את גודל הירידה עד 10 increments (100 מיקרומטר) על reticule שלב 1 מ"מ. מיקום נכון של המחט (חיצים שחורים) לנקיק סימון הצומת בין קשת בלוע הזנב, שק חלמון והלב יקל פירסינג הרקמות (ראש החץ) (B). בר סולם:. 200 מיקרומטר dextran (C) Rhodamine ניתן לראות במהירות נלקח על ידי כל כלי הדם (חיצים לבנים). יש להשתמש 100 px 2 אזורים של אינטרסים המכסים לב מרכזי (ריבוע צהוב) כדי לבצע מדידות של הערך האפור הממוצע ולכן פיקסל / עוצמת ניאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מציאה איור 3. bbs9 גורמת func כליות הפגוםtion בדג זברה. (א) עוברים מוזרק לתוך קרום הלב עם dextran rhodamine ב 3 HPI ו -24 HPI, עליון ושני פנלים תחתון בהתאמה, בשתי שליטה או עוברי morphant bbs9. ראשי חץ עולים לב; חץ מצביע על ההיווצרות של ציסטה pronephric. עוצמת ניאון אחוז (B) שנותרה לאחר 24 HPI בשליטה מול עוברי MO bbs9. ברים שגיאה להראות את שגיאת התקן של הממוצע (SEM), ** P ≤ 0.01. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
דג הזברה להציע כלי רב ערך למודל מחלה גנטית אנושית, השימוש בם כמכשיר מדעי לin vivo מחקר איפשר מחקרים מפורטים של ההתפלגות הגנטית של רבים מערכות ביולוגיות, כוללים הכליות. הרבה עכשיו הבין על איך כליות דג הזברה מתפתחות ופונקציות. הדמיון הבולט לnephrogenesis והומולוגיה עם גנים של מחלות שגרמו 21 אנושיים ממחיש עד כמה דג הזברה הפכה יסודי בהבנה כיצד פגמים בעצמם תפקוד גן לפתולוגיה של מחלת כליות. ואכן, מניפולציה גנטית יכולה להיות מושגת בקלות בדג זברה באמצעות טכנולוגיית מציאה morpholino antisense או כלי עריכה מתקדמים יותר הגנום ממוקד כגון TALENS או CRISPR. יצירת מודלים מציאה או מוטציה לגנים הגורמים למחלות כליות חשד היא הצעד הראשון בהבנת מעורבותם בביטוי המחלה. כדי לעשות זאת assay אמין לתפקוד כליות הוא ביקשכדי לציין אם גן מועמד צפוי אחראי לפתולוגיה שנצפתה בחולים.
בדיקות תפקוד כליות הן פשוטות וזולות יחסית לביצוע בבני אדם, בדרך כלל מסתכל על רמות של מומסים בדם או בשתן. עם זאת, שיטות אלה אינן ישימות בדג זברה בשל גודלו הקטן ובית הגידול המימי. Assay dextran rhodamine המתואר כאן מנצל את היכולת של tubules pronephric לסנן רכיבי משקל מולקולריים נמוכים מהדם. Podocytes ממוקם בתוך הקפסולה של באומן של הכליות, העוטפות את הנימים של glomerulus, לאפשר לפטירתו החופשית של מולקולות קטנות כגון מים, מלחים יוני וגלוקוז דרך סרעפת חריץ 27. חריצי הסינון לתפקד נוספים למניעת אובדן חלבוני מאקרו מהדם. סינון מוגבל למולקולות מעל 5 kDa וחסמו כמעט לחלוטין בגודל של אלבומין בסרום 28 (כ0; 65 KDA). על ידי הזרקת צבע dextran ניאון של כ -10 kDa, בריכוז ידוע לתוך חלל קרום הלב, אנו מסוגלים למדוד עוצמת ניאון של הדם לאורך זמן. בתנאים רגילים כ -85% מקרינה ראשונית הוא איבד מהדם, במשך 24 שעות, באמצעות הפרשה דרך הכליות. יש לציין כי ההזרקה לתוך חלל קרום הלב היא אפשרית רק עם dextran MW הנמוך שעובר בחופשיות לתוך כלי הדם. לפיכך, assay זה נותן רק לקריאה החוצה לשיעור של אישור עבור רכיבי משקל מולקולריים נמוכים ולא נותן שום מידע על היעילות של סינון גלומרולרי. האחרון ניתן להעריך באופן ישיר יותר באמצעות צבעי משקל מולקולריים גבוהים מעל 70 kDa, הדורש הזרקה לתוך כלי הדם ולא לחלל קרום הלב. ואכן, dextrans של MWS השונים יכול לשמש כדי לנתח תפקוד כליות 28 נוסף.
Tubules pronephric דג הזברה הם ריסי מאוד עם מוcilia האריח שלהקל על התנועה של תסנין ל3,4 הביב. פגמים במכונות הריסים היו מעורבים במחלת כליות. BBS הוא הפרעה המאופיינת בניוון ילדות הופעת רשתית, השמנת יתר בגיל מוקדם, ליקוי קוגניטיבי, פולידקטיליה ומום כליות 24 גנטי הטרוגנית, אוטוזומלית רצסיבית. נכון להיום, 20 גני BBS (BBS1-20) זוהו. שיבוש של BBS מוביל להיווצרות ציסטה כליות ותפקוד pronephric הפגום בדג הזברה 9. BBS9 אינטראקציה עם חלבונים אחרים BBS כדי ליצור את BBSome אחראי לciliogenesis המתאים, מוטציות של המהווים 6% מהמקרים BBS 24. בעוד דווח מודל מציאה bbs9 דג הזברה, תיאור של פנוטיפ הכליות היה חסר 26. על ידי דריסה bbs9 בדג זברה, באמצעות גישת morpholino, אנחנו מדגימים את השימוש של assay הפינוי כלייתי כשיטת כדי לקבועתפקוד כליות במודל מחלת כליות. כאן, אנו מראים כי עוברי morphant bbs9 להציג אישור ניאון מנע מהזרם הדם, מצביעים על כך שהכליות לא הצליחו להסיר את המומסים MW נמוכים. כך, בגלל מעורבותה של bbs9 בciliogenesis, ותפקידם של ריסי pronephric בהנחיית תנועת תסנין, אישור הכליות נצפה בmorphants עשוי להיות בשל תפקוד cilia חריג. שיטה זו מהווה כלי רב ערך להערכת תפקוד כליות במודלי מחלה דג הזברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש לי המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
סיוע טכני המסופק על ידי Jaipreet Bharj. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאיחוד האירופי-FP7 (SYSCILIA -241,955) והכליות הולנדי הקרן (CP11.18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease - clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, ajt, Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , 4th, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , Academic Press. (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
