Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een Published: February 26, 2015 doi: 10.3791/52543
Automatic Translation
1, 2, 2,3
1Centre for Neuroprosthesis, EPFL | STI | IMT/IBI | LSBI, 2Blond McIndoe Research Laboratories, Institute of Inflammation & Repair, The University of Manchester, 3University Hospital of South Manchester

Summary

Ganglia (DRG) zijn structuren die de sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. Wanneer gedissocieerd kunnen zij samen gekweekt met SC-achtige adipose afgeleide stamcellen (ASC), die een waardevol model voor in vitro zenuwregeneratie en myelinisatie bestuderen nabootsen van de in vivo omgeving bij de verwonding.

Introduction

Perifere zenuw verwondingen zijn gemeen met ongeveer 9.000 gevallen in het Verenigd Koninkrijk die zich elk jaar in een overwegend jonge en werkende bevolking 1. Ondanks microchirurgische zenuwreparatie technieken, normale herstel van de functie is onbereikbaar met als gevolg verminderde de hand gevoel, verminderde motoriek en frequente pijn en koude intolerantie 2. Dergelijke verwondingen hebben een diepgaande en blijvende impact op de patiënt en hun vermogen om dagelijkse activiteiten uit te voeren, met minder dan 60% weer aan het werk 3.

Na letsel, het fenotype en de morfologie van neuronen en Schwann-cellen (SC) veranderen om een ​​geschikte omgeving voor de axon kiemen te scheppen. In het geval van doorsnijding, wordt de zenuw verdeeld in proximale en distale stompen; de proximale stomp zijnde het punt van waaruit de regeneratieve proces plaatsvindt, terwijl de distale stomp ondergaat Wallerian degeneratie waarna de SC detachvan de gewonde axonen, de-differentiëren en te vermenigvuldigen. Dit is fundamenteel aan het wegnemen van myeline puin en het voorbereiden van de distale stomp voor zenuw re-generatie 4,5. Axon kiemen wordt ondersteund door de productie van neurotrofe factoren en chemokines vrijgegeven door SC de distale stomp, en geleid door de basale lamina achtergelaten na Wallerian degeneratie 6,7. SC uitlijnen langs de regenererende axon die de banden van Büngner, de hulp van de axon groei naar het doelorgaan, het verminderen van vertakking buiten de endoneurial buis. Volgende reïnnervatie, SC vormen de nieuwe myelineschede wikkelen de geregenereerde axonen, maar sensorische en motorische functie is slechts gedeeltelijk hersteld 8.

Dorsale wortel ganglia (DRG) zijn structuren in het foramen intervertebrale van de wervelkolom, die de sensorische neuronale cellen innerveren de perifere organen. Wanneer gedissocieerd, kunnen ze worden gebruikt als een geschikte in vitro model voor de studie van de zenuw regeneratie 9-11, met inbegrip van onderzoek van myeline vorming. In het bijzonder volwassen DRG neuronen na te bootsen de in vivo eigenschappen van deze cellen en zorgen voor een formidabele hulpmiddel om nieuwe strategieën voor perifere zenuw reparatie in tissue engineering studeren.

Co-culturen vormen een dynamisch systeem simuleert in vitro de interactie van twee (of meer) celtypen in een bepaalde in vivo omgeving. Eén van de voordelen van deze cel co-kweek modellen is de flexibiliteit en hoge controle die het extracellulaire milieu kan worden uitgeoefend. DRG neuronen vaak toegepast samen kweeksystemen met SC de werkelijke interacties die optreden tussen de twee celtypen in het perifere zenuwstelsel nabootsen 10,12 - 14. Er werd aangetoond dat SC extracellulaire matrix (ECM) proteïnen en groeifactoren die opmerkelijk kan verbeterenvermogen van DRG neuronen om te overleven en ontkiemen neurites 15,16. Echter, SC vereisen langere tijd te prolifereren en ondanks de vooruitgang in celkweek techniek, is het nog steeds moeilijk om een ​​geschikt aantal cellen voor tissue engineering toepassingen genereren. Daarnaast wordt het offer van een gezonde zenuw noodzakelijk om autologe SC oogsten. Daarom is het verschil sourcing SC is belangrijk voor tissue engineering en in vitro testen van zenuwregeneratie. In deze weergave kan ASC worden beschouwd als een waardevol alternatief voor de ontwikkeling van een tissue engineering construct wordt gebruikt voor perifere zenuwen reparatie 17,18. Eerder werk toonde het vermogen van deze cellen om te differentiëren tot SC-achtige ASC, expressie karakteristieke glial-markers, zoals S-100, p75 en glia fibrillair zuur eiwit (GFAP) 19, alsmede de myeline eiwit nul (P0) 20 . De afscheiding van gliale groeifactoren, zoals BDNF (BDNF), zenuwgroeifactor (NGF) en gliale cel afgeleide neurotrofe factor (GDNF) werd ook waargenomen 21,22. Daarom kan SC-achtige ASC worden gebruikt als promotor van perifere zenuwregeneratie, zoals aangetoond zowel in vitro als in vivo studies 23-26. Bovendien kan ASC worden geoogst via minimaal invasieve procedures in groter aantal dan andere types stamcellen; de frequentie van stamcellen in vetweefsel 100 tot 1000 maal hoger dan in het beenmerg 27, en ze een hogere proliferatie in vergelijking met SC en beenmerg mesenchymale stamcellen.

Dit werk heeft als doel een gedetailleerd protocol te hoge efficiënte oogsten van gedistantieerd DRG neuronen en ASC respectievelijk uit te voeren, de laatste wordt gedifferentieerd in SC-achtige cellen. De co-cultuur van deze twee celtypes zullen daarom een ​​praktisch systeem dat kan worden gebruikt voor toekomstige studies op het vermogen van DRG neurons om neurites en de mechanismen van myeline vorming op verschillende steiger voor zenuwweefsel techniek ontkiemen.

Protocol

LET OP: Alle experimenten met dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Britse Dieren (wetenschappelijke procedures) Act, 1986 uitgevoerd.

1. Experimentele Set-up

  1. Voorafgaand aan de weefsels en cellen oogst start, controleer dan of alle gereedschappen zijn steriel. Of het nu nodig, autoclaaf een paar scherpe chirurgische schaar, een zeer fijne tang en een boete standaard tang. Ook steriliseren materiaal vooraleer zaaien van cellen met UV sterilisatie, blootstelling ethanol of stoomsterilisatie als passend.
  2. Voorbereiding van de media voor stamceltransplantatie oogst en differentiatie
    1. Bereid de stamcellen groeimedium, bevattende Minimum Essential Medium (α-MEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 200 mM L-glutamine en 1% penicilline-streptomycine (PS).
    2. Bereid een 10 mM voorraad oplossing van forskolin door het oplossen van 10 mg forskolin in 2,436 ml steriele dimethyl sulfoxyde. Gebruik bij uiteindelijke concentratie van 14 uM. </ Li>
    3. Bereid een 35 mg / ml stockoplossing van retinoinezuur door het oplossen van 50 mg in 1,43 ml steriele dimethyl sulfoxyde. Gebruik eindconcentratie van 350 ng / ml.
    4. Bereid bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF) voorraden (100 ug / ml) door het oplossen van 10 ug gevriesdroogd poeder in 100 pl gedestilleerd steriel water. Gebruik eindconcentratie van 5 ng / ml.
    5. Bereid basische fibroblast groeifactor (bFGF) voorraad (100 ug / ml) door het oplossen van 50 mg gevriesdroogd poeder in 500 pi steriel gedestilleerd water. Gebruik eindconcentratie van 10 ng / ml.
    6. Bereid de stamcel differentiatie medium, bevattende stamcellen groei medium aangevuld met 14 uM forskoline, 126 ng / ml gliale groeifactor-2 (GGF-2), 5 ng / ml van bloedplaatjes afgeleide groeifactor (PDGF), en 10 ng / ml basische fibroblast groeifactor (bFGF).
  3. Voorbereiding van de media en de voorraad oplossingen voor neuron oogst en dissociatie
    1. Bereid Bottenstein en Sato's (BS) medium 28, door het toevoegen van 1% PS en 1% N2 aanvulling op Ham's F12 medium. Bereken het eindvolume benodigde 500 gl per putje (bij gebruik van een 24-wells plaat).
    2. Bereid collagenase IV voorraden in Ham's F12 medium bij de concentratie van 1,25% gew / vol. Filter-steriliseren van de oplossing en bewaar bij -20 ° C 200 pi aliquots.
    3. Bereid runder alvleesklier trypsine bestanden in Ham's F12 medium in een concentratie van 2,5% w / v, filter-steriliseer en bewaar bij -20 ° C 200 pi aliquots.
    4. Bereid de zenuwgroeifactor (NGF) voorraadoplossing bij een concentratie van 5 ug / ml in een filter gesteriliseerd 1 mg / ml vetzuurvrij runderserumalbumine (BSA) oplossing F12 medium en bewaar bij -20 C 200 gl porties. Niet filter instellen voor het NGF na bereiding.
  4. Indien geen oppervlaktemodificatie is uitgevoerd, laag dekglaasjes / platen met poly-D-lysine (0,1 mg / ml gedurende 15 min bij KT) En / of laminine (2-10 ug / cm2 gedurende 2 uur bij 37 ° C) tot neuron hechting en neuriet uitgroei zover passend.
  5. Altijd opwarmen media in een waterbad bij 37 ° C voor gebruik.

2.-vet-afgeleide stamcellen (ASC) Oogst en Differentiatie in een SC Fenotype

  1. ASC oogst van visceraal en lies vet van volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten
    1. Voordat het bereiden van een buis met 10-15 ml Hanks 'Balanced Saline Solution (HBSS), aangevuld met 1% v / v oplossing van PS en bewaar op ijs tot vetafname.
    2. Beëindigen van de rat door cervicale dislocatie en onthoofding. Scheer de rat en het maken van een incisie door de buikhuid, het blootstellen van de interne organen en het vermijden van bloeden. Verwijder het visceraal vet omhult de maag en darmen (meestal gekenmerkt door een vette gele consistentie) en de inguinale vet rond de testikels van een volwassen mannelijke Sprague-Dawley rat. Overdracht de vet in de buis met HBSS op ijs.
    3. In een bioveiligheidskast (klasse II) hak het vet met een schaar en een steriel scheermesje tot fijne consistentie is bereikt en overzetten in een buis die 15 ml 0,2% w / v collagenase type I oplossing vers bereid en steriel gefiltreerd op de dag.
    4. Breng de buis in een waterbad bij 37 ° C en laat het vetweefsel te verteren in aanwezigheid van het enzym gedurende 30 min, 1 uur onder continu roeren. Bewaken van de spijsvertering op de voet en te stoppen voordat het weefsel volledig is losgekoppeld, zal dit levensvatbaarheid van de cellen en cel opbrengst te verbeteren. Filter Theun-gedissocieerde weefsel door een 100 micrometer cel zeef.
      OPMERKING: Goede weefsel spijsvertering zal resulteren in een homogene consistentie van het vet, zichtbaar op het oog toen voorzichtig schudden de buis, het verwerven van een beige uiterlijk.
    5. Neutraliseer het enzym door toevoeging van 15 ml van stamcellen kweekmedium dat foetaal runderserum bij 37 ° C en centrifugeer deoplossing bij 160 g gedurende 10 min teneinde de stromale vasculaire fractie, waaronder stamcellen verzamelen op de bodem van de buis.
    6. In dit stadium kan de pellet wordt geresuspendeerd in 1 ml rode bloedcellen lysis buffer verontreiniging bloedcellen te verwijderen. Na resuspensie en pipetteren gedurende 1 min, voeg 10 ml vers stengelgroei celmedium en centrifugeer bij 160 g gedurende 10 min.
    7. Zuig voorzichtig het supernatant van de buis, het verzorgen van de gedeponeerde celpellet aan de onderkant. Resuspendeer de cellen in 10 ml van stamcellen groeimedium, overbrengen naar een 75 cm2 flessen en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Handhaaf de cellen op subconfluente niveaus tot passage 1-2, veranderende medium om de 3 dagen.
  2. ASC differentiatie naar een SC fenotype
    1. Bij passage 1-2, verwijder de groei van stamcellen medium uit de 75 cm 2 kolf en te vervangen door 10 ml vers medium dat 1 mM β-mercapto-ethanol vers preparrood en filter-gesteriliseerd op de dag. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. In dit stadium is het belangrijk dat de cellen gezaaid met lage dichtheid (30%) voordat de differentiatie.
    2. Was de cellen voorzichtig met HBSS, aspireren en vervangen door 10 ml medium bevattende 350 ng / ml retinoïnezuur. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 72 uur. Proberen om de blootstelling van de cel medium tot licht te minimaliseren.
    3. Na 3 dagen, was de cellen voorzichtig met HBSS, aspireren en te vervangen door 10 ml van stamcel differentiatie medium (zie stap 1.2.6). Handhaaf de cellen op subconfluente niveaus, veranderende medium om de 3 dagen.
      NB: Na 2 weken van incubatie worden ASC gedifferentieerd in SC-achtige ASC, het uiten van hun karakteristieke fenotype (zoals aangetoond door Kingham et al. 5). Ze kunnen dan worden gebruikt tot de 10e passage zonder merkbare veranderingen in het gedrag 29.
<p class = "jove_title"> 3. Oogst en dissociatie van ganglia (DRG) Neuronen

  1. Beëindigen van de rat door cervicale dislocatie en onthoofding. Scheer de rat en til de huid aan de wervelkolom bloot. Met behulp van een scherpe schaar, excide de wervelkolom die extra zorg van de opgesloten organen en bloedvaten. Breng de wervelkolom in een biologisch veiligheidskabinet (klasse II) met behulp van een petrischaal en verwijder eventuele dorsale gedeelte.
  2. Verdeel de wervelkolom in tweeën langs de langsas met steriele en scherpe chirurgische schaar om het snoer weefsel bloot. Op dit punt is het nuttig om de wervelkolom in twee kleinere segmenten onder het niveau van de ribbenkast gesneden, om het gemakkelijker te hanteren tijdens de DRG neuronen oogst. Met behulp van fijne tang, verwijder voorzichtig alle navelstrengweefsel, aandacht te besteden aan niet te trekken en verwijder de DRG wortels. Zo de DRG en wortels worden blootgesteld binnen het wervellichaam kanalen nog ingekapseld in de kolom. Observeren DRG als witte filamenten coming direct uit de grachten.
  3. Trek de volledige DRG wortel (niet alleen de DRG) van de wervel kanalen met behulp van zeer fijne tang, gaan diep in het wervellichaam grachten en het betalen van de aandacht van de wortels van de ganglia niet te beschadigen. Breng de DRG in een petrischaaltje (60 mm2) met 3-4 ml F12-medium Ham's aangevuld met 1% PS. Bij gebruik van verschillende dieren, gebruik aparte gerechten.
  4. Onder een microscoop ontleden, het reinigen van de DRG van een eventueel overschot van de zenuwwortels rondom de ganglia met behulp van een steriel pincet en een scalpel om gliale besmetting cel te verminderen. Breng de DRG in een kleine petrischaal (35 mm 2) 1,8 ml vers F12 medium.
  5. Voeg 200 ul van 1,25% gew / v collagenase type IV stockoplossing (eindconcentratie 0,125%) en incubeer de DRG bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 1 uur. Zuig voorzichtig het medium met een glazen pipet, met aandacht niet te zuigen of beschadiging van de DRG. Voeg verse F12 medium soepelteerd met 0,125% gew / v collagenase type IV enzym en incubeer gedurende 1 uur zoals eerder beschreven.
  6. Zuig het medium en voorzichtig te wassen de DRG met F12-medium. Voeg vervolgens 1,8 ml F12-medium en 200 ul trypsine (eindconcentratie van 0,25% gew / v) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 30 min.
  7. Verwijder trypsine en voeg 1 ml F12-medium aangevuld met 500 pi van FBS om de enzymatische reactie te stoppen. Zuig het medium en voorzichtig te wassen de DRG met F12 medium voor drie keer om sporen van het serum te verwijderen.
  8. Voeg 2 ml vers F12 medium en de DRG zorgvuldig over te dragen met het medium in een 15 ml buis met behulp van een glazen pipet. Voorzichtig dissociëren de DRG neuronen door en neer te pipetteren (ongeveer 8-10 keer) met de glazen pipet (plastic tips kunnen worden gebruikt als alternatief).
  9. Laat het pellet bezinken op de bodem van de buis en verzamel het medium in een nieuwe buis. Voeg 2 ml vers F12 medium om de buis met de pellet en herhaal de mechanische dissociatie met de glazen pipet. Herhaal deze stap tot de schorsing homogeen wordt (ongeveer 3-4 keer) en het verzamelen van alle gedissocieerde DRG in de nieuwe buis. Dit reduceert de spanning die uit de mechanische dissociatie en verbetert de levensvatbaarheid van de neuronen.
  10. Filter de resulterende gehomogeniseerde suspensie in een nieuwe 15 ml buis met behulp van een 100 micrometer cel zeef om un-gedissocieerde neuronen en ander vuil te verwijderen. In dit stadium kan het geschikt zijn eerste filter de celsuspensie in een 50 ml buisje en breng de oplossing in de kleinere buis met behulp van een glazen pipet. Centrifugeer de suspensie bij 110 g gedurende 5 min.
  11. Bereid een 15% runderserumalbumine (BSA) door toevoeging van 500 pl 30% BSA oplossing 500 ui F12 medium. Langzaam pipet de oplossing beneden de wand van een buis van 15 ml tot een geleidelijke eiwit trail te creëren. In dit stadium is het nuttig om de buis te houden op 45 ° en langzaam los BSA met de cijfers opde valk buis als referentie voor de vorming van "track".
  12. Zuig het supernatant van stap 3.10 verlaten 500 ui op de bodem van de buis en resuspendeer de celpellet in hetzelfde medium. Langzaam pipet de suspensie langs het eiwit pad vooraf bereid in stap 3.11 (gebruik de getallen op de buis als referentie) en gecentrifugeerd bij 500 g gedurende 5 min.
  13. Zuig het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 ml gemodificeerd BS medium (of een gemengd medium voor de SC-achtige ASC / DRG co-cultuur, zoals hierna beschreven in stap 4.5.
    OPMERKING: De volume resuspendeer de DRG neuronen kunnen worden gekeken naar de huidige vereiste volume, afhankelijk van de uiteindelijke celconcentratie gewenst en het aantal monsters dat moet worden geënt. Eén dier voldoende cellen een 24-wells plaat experiment.
  14. Incubeer de geënte monsters bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur celbinding staan ​​en tenslotte voeg vers medium BS aangevuld met 50 ng / ml zenuwgroeifactor factor (NGF).

4. Direct Co-cultuur van SC-achtige ASC en DRG neuronen

  1. Onderhouden SC-achtige ASC in de cultuur bij subconfluente niveaus zoals beschreven in stap 2.2.3. Vierentwintig uur vóór DRG oogst, zuigen de stamcel differentiatie medium en was de cellen met HBSS. Zuig en incubeer in 3 ml trypsine bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 3 min.
  2. Controleer onder een lichtmicroscoop dat alle cellen losgemaakt van de fles. Tik voorzichtig de kolf om onthechting te helpen. 7 ml medium om de trypsine reactie te stoppen, het verzamelen van de celsuspensie in een 15 ml buis en centrifugeer bij 110 g gedurende 5 min.
  3. Zuig het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml stamcel differentiatie medium. Tel de cellen met een hemocytometer en verdun de celsuspensie volgens de eindconcentratie vereiste. Idealiter zaaien 20000 SC-achtige ASC / cm2 zou een confluente laag cellen waarborgen.
  4. Zaad van de SC-achtigeASC op het substraat en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur om celhechting mogelijk.
  5. Na 24 uur incubatie, zuig het medium en voeg de DRG neuronen bovenop de cellen zoals beschreven in stap 3.14 en 3.15. Verander het medium een ​​gemengd medium dat 50% stamcel differentiatie medium en 50% van BS medium. Bovendien verminderen de FBS concentratie 1-2,5% in het uiteindelijke gemengde medium helpt voorkomen de verspreiding van verontreinigende satelliet cellen afkomstig van de DRG dissociatie.
  6. Incubeer de monsters samen gekweekt bij 37 ° C, 5% CO2 en in cultuur houden gedurende de vereiste tijd voor toekomstig onderzoek.

Representative Results

Culturen van gedissocieerde DRG neuronen vormen een geschikt in vitro model voor de studie van zenuwregeneratie. Echter, onbehandelde ondergronden niet in een geschikte omgeving voor DRG bevestiging en uitbreiding van neurieten. SC-achtige ASC kunnen groeifactoren en chemokines 19, die het vermogen van DRG neuronen neurieten ontkiemen kunnen verbeteren wanneer zij vrijkomen in het kweekmedium te produceren. De aanwezigheid van SC-achtige ASC in het kweeksysteem kan ook een belangrijke rol spelen bij het reguleren van de DRG functies.

Dit protocol (figuur 1) geeft de procedure om een directe co-cultuur van SC-achtige ASC en DRG neuronen, waarbij neuronale cellen in rechtstreeks contact met eerder geënt SC-achtige ASC voeren. Het belangrijkste probleem in verband met deze procedure is de hoge variabiliteit van het aantal DRG neuronen geoogst van verschillende dieren. Om deze reden kunnen de resultaten soms moeilijk zijn om compare en bijzondere aandacht moet tijdens de plaatsingsprocedure betaald ter verkrijging steeds een vergelijkbare celdichtheid in elk experiment. Is geoptimaliseerd protocol ten minste het aantal satelliet cellen die overblijven van de DRG neuronen dissociatie met de BSA gradiënt (stap 3.11) verminderen. Daarnaast kunnen cytosine-arabinose (ARA-C) supplement worden toegevoegd aan de BS medium om verder te minimaliseren satelliet celpopulatie, zoals beschreven door Kingham et al. 11. De keuze van de behandelingstijd moet zorgvuldig uitgebalanceerd met de DRG en SC-achtige ASC vitaliteit, ook beïnvloed door de aanwezigheid van ARA-C supplement in het kweekmedium zijn. Daarom is het zeer moeilijk om een ​​satelliet celvrij systeem bereiken.

Figuur 2 toont het belang van de SC-achtige ASC voor DRG neuriet kiemen in een co-cultuur model met behulp van onbehandeld en chemisch gemodificeerde poly - caprolacton (PCL) films als substraten. DRG neuronen waren maintained in cultuur voor 3 dagen in aanwezigheid of afwezigheid van SC-achtige ASC, met een gemengde oplossing die 50% van BS medium en 50% stamcel differentiatie medium, zoals beschreven in stap 4.5. Na deze periode werden de cellen gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gekleurd met β-tubuline III (DRG neuronen) en S100 (SC-achtige ASC) om celmorfologie te onderzoeken en het vermogen van DRG neuronen neurieten uitsteken bestuderen. Geen neurieten werden waargenomen op onbehandelde oppervlakken in afwezigheid van SC-achtige ASC (Figuur 2A), terwijl de vorming van neurieten duidelijk verbeterd in de co-kweeksysteem (figuur 2C). Gemiddeld aantal neurieten per cellichaam aanzienlijk toegenomen 0-3 in aanwezigheid van stamcellen. Bevestiging van deze resultaten werd gegeven door scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse, weergegeven in figuur 3. Met name de SEM beelden tonen dat het vermogen van DRG neuronen neurieten ontkiemen treedt met voorkeur in samenhangmet SC-achtige ASC, zoals aangegeven door de gele pijlen in figuur 3C.

Er zij op gewezen dat het gebruik van laminine gemodificeerde substraten (waaronder laminine afgeleide peptiden) in kweeksystemen die DRG neuronen is vaak gedefinieerd als een in staat van neuronale celkweek heeft opmerkelijke effecten op neuriet vorming en uitbreiding 30-32 . Echter, de in figuur 2D en figuur 3D resultaten blijkt dat de combinatie van chemische en biologische signalen verder kunnen bijdragen aan de respons van DRG neuronen.

Figuur 1
Figuur 1. Bereiding van de directe DRG-SC-achtige ASC co-kweeksysteem. DRG neuronen en ASC zijn respectievelijk afgeleid van de wervelkolom en het viscerale en inguinale vet volwassen male Sprague-Dawley ratten. Na de digestie van het vetweefsel door een cascade van enzymatische reacties, worden ASC gedifferentieerd in SC-achtige cellen en gehandhaafd in sub-confluente omstandigheden tot gebruik. SC-achtige ASC zijn vooraf gezaaid op elke ondergrond 24 uur voordat de DRG oogst. Op de dag worden DRG neuronen geëxtraheerd en gescheiden door een reeks enzymatische en mechanische belasting. De neuronen worden vervolgens gezaaid op de bovenkant van de eerder gezaaid SC-achtige ASC en in kweek gehouden totdat getest (mixed medium: met 50% van de stamcel differentiatie medium en 50% van de gewijzigde BS gemiddeld). Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

Figuur 2
Figuur 2. Fluorescentie beelden van DRG neuronen in diverse kweekomstandigheden.(A) onbehandelde PCL films; (B) RGD-gemodificeerde PCL films; (C) samen gekweekt met SC-achtige ASC op onbehandeld PCL films; (D) samen gekweekt met SC-achtige ASC op RGD-gemodificeerde PCL films. Cellen werden in kweek gedurende 3 dagen met een gemengde oplossing die 50% gemodificeerd BS medium en 50% van stamcellen differentiatie medium. Hierna werden de cellen gefixeerd in 4% paraformaldehyde, gepermeabiliseerd in Triton-X-oplossing, en niet-specifieke bindingsplaatsen werden geblokkeerd met 1% BSA. Neuronale cellen werden vervolgens gekleurd tegen β-tubuline III (FITC; groen) en SC-achtige ASC tegen S-100 (AlexaFluor568; red) antilichamen. Tenslotte kernen werden gekleurd met DAPI (blauw). Beelden werden verkregen met behulp van een fluorescentie microscoop (Olympus BX60, Japan). (Re-print met toestemming van de Luca et al. 30. Klik hier om een grotere vers bekijkenion van dit cijfer.

Figuur 3
Figuur 3. SEM beelden van DRG neuronen in diverse kweekomstandigheden (A) onbehandeld PCL films (B) RGD-gemodificeerde PCL films,. (C) samen gekweekt met SC-achtige ASC op onbehandeld PCL films; (D) samen gekweekt met SC-achtige ASC on-RGD gewijzigde PCL films. De gele pijlen geven de contactpunten tussen SC-achtige ASC en DRG, bevestigt hun directe interactie in de co-cultuur systeem. Cellen werden in cultuur behouden gedurende 3 dagen en in 2,5% glutaaraldehyde vast. Na dehydratatie in gegradeerde ethanolreeks (50%, 70%, 90%, 100%) werden de cellen uiteindelijk gespoeld in hexamethyldisilazaan en gedroogd alvorens montage op stubs en goud sputteren voor SEM analyse. Beelden werden verkregen met behulp van een SEM (Zeiss EVO60, UK) met een versnellende voltage van 10kV. (Re-print met toestemming van de Luca et al. 30. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

DRG neuronen worden vaak gebruikt bij neuronale cellen primaire kweek voor de regeneratie van neuronen te bestuderen na axotomie in vivo. Hier een nauwkeurig protocol voor DRG oogst van volwassen ratten wordt gepresenteerd, gericht op het verminderen van de bevolking van satelliet-cellen in de omgeving zonder dat de neuronale overleving in gevaar te brengen. Als ASC gedifferentieerd in een SC-achtige fenotype een alternatief voor SC celtherapie is een SC-achtige ASC / DRG co-kweeksysteem ook beschreven.

Het is algemeen bekend dat laminine (of laminine afgeleide peptidesequenties) hebben een gunstig effect op neuron overleving en neuriet vorming 31-33. Bij het uitvoeren van DRG neuron culturen het daarom wordt geadviseerd om eerder jas elk substraat met laminin om eventuele verlies van functionaliteit van de neuronale cellen te voorkomen. Het begrip laminine coatings geldt ook biomateriaal substraten voor het ontwerp vantissue engineering constructies, zoals poly - caprolacton (PCL) vaak gebruikt voor de fabricage van de zenuw leidingen 30. Ook eerdere werk aangetoond dat fibrine matrices zijn geschikte materialen voor neuronale culturen in drie dimensie 11.

Naast eiwitten coating, co-cultuur modellen waardevolle voorwaarden DRG-neuron overleving en een geschikte omgeving om de interacties die optreden tussen neuronen en SC in het perifere zenuwstelsel na letsel bestuderen. Cellen kunnen ook in vivo worden getransplanteerd met behulp van neurale inrichtingen om de rekrutering tijdstip van autologe cellen verkorten de verwonding. Dit is bijzonder belangrijk in ernstig letsel, wat kan leiden tot celsenescentie / dood en spieratrofie. Hoewel SC zijn de belangrijkste gliacellen betrokken bij het proces van regeneratie van perifere zenuwen en myelinisatie, hun beperkte beschikbaarheid en hun langzame proliferatiesnelheid maakt ze ongeschiktvoor tissue engineering toepassingen 34. ASC zijn een goed alternatief als gevolg van hun overvloed en het vermogen om te differentiëren in de SC fenotype, met expressie van specifieke gliale markers en het tonen van functionele overeenkomsten met inheemse SC 19. ASC kunnen ook eiwitten en groeifactoren 5 die gunstig zijn voor de vorming en verlenging van neurieten door DRG neuronen in een co-cultuur systeem kan produceren. Er kunnen echter twee verschillende co-kweeksystemen worden ingesteld als functie van de experimentele behoeften. De in dit document voorgestelde methode is een herziene versie van een gevestigde protocol in ons laboratorium 11 en het gaat om een direct contact tussen de twee celtypen (directe co-cultuur), waarin de tweede celtype (DRG neuronen) worden gezaaid bovenop de andere (SC-achtige ASC). Deze benadering is gebaseerd op eerdere bevindingen dat het belang van de aanwezigheid van gliale cel op het substraat aangetoond wanneer zaaien neuronale culturen 35 37. Dit effect wordt waarschijnlijk veroorzaakt door cel-cel interacties door DRG integrinen en ECM moleculen afgezet uit ascorbaat en andere signalen op de steel celoppervlak. Ook werd waargenomen dat een reductie van melkeiwitten in het medium verlaagde de proliferatie van contaminerende satelliet cellen die kunnen voortvloeien uit de dissociatie van DRG neuronen, onverminderd ASC functies. Echter, satelliet cellen, waaronder een kleine populatie van SC, moeilijk om volledig te elimineren uit kweken van DRG neuronen en weinig overblijvende cellen zullen aanwezig zijn in de co-cultuur systeem. Het is daarom belangrijk om op te merken dat deze kleine subpopulaties ook kunnen deelnemen aan myelinisatie processen tijdens in vitro studies, herinnerend aan de autologe cellen die aanwezig zijn in vivo na een blessure zijn. De tweede benadering (hier niet weergegeven) omvat het gebruik van celkweek inserts, het voorkomen van een direct contact tussen de twee celtypen (indirecte co-kweek). However is niet representatief voor de in vivo omstandigheden bij zenuwregeneratie (verminderd vermogen van neuronale cellen voor lange neurieten ontstaan), maar wordt gebruikt om het effect van vrij diffundeerbare factoren in het medium met een bepaalde celpopulatie onderzocht op de andere 38 .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 µm cell strainer BD Biosciences 352360 70 μm strainers (ref. 352350) can be used as alternative
15 ml plastic tubes Sarstedt 62.554.002
50 ml plastic tubes Sarstedt 62.547.004
75 cm2 flasks Corning BC301
Retinoic Acid >98% HPLC Sigma R2625
ARA-C supplement Sigma C6645
Recombinant Human FGF-basic (154 aa) Peprotech 100-18B
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9205
Collagenase type I Gibco 17100-017 Note: this collagenase is only used for fat tissue digestion
Collagenase type IV Worthington Biochemical LS004188 Note: this collagenase is only used to dissociate DRG explants
Foetal Bovine Serum (FBS) Biosera FB-1001
Forskolin  Sigma F3917
Glass pipettes Fisher Scientific FB50253 Sharp material to be disposed accordingly
Glial Growth Factor-2 (GGF-2) Acorda Therapeutics GGF-2 was kindly donated by Acorda Therapeutics. For a commercially available alternative, we recommend NRG1-β1 (R & D Systems, Abingdon) for stem cell differentiation to be used at the final concentration of 200 ng/ml
Nutrient Mix F12 HAM Sigma N6658 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma H9394 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
N-2 supplement (100x) Invitrogen 17502
Nerve Growth Factor 2.5s Protein, Mouse Submaxillary Glands  (NGF) Millipore NC011
Penicillin-Streptomycin (PS) Sigma P0781
Name Company Catalog Number Comments
Petri dishes Corning 430165
Recombinant Human PDGF-AA Peprotech 100-13A
Trypsin  Invitrogen 25200-056 Warm at 37 °C in a water bath. This is used for cell detachment from tissue culture flasks
Trypsin (2x bovine pancreatic) Worthington Biochemical LS003703 This is used for DRG dissociation
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma M8042 Warm at 37 °C in a water bath unless specified
2-mercaptoethanol Sigma M3148 Prepare the solution in the biological cabinet

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiberg, M., Terenghi, G. Will it be possible to produce peripheral nerves. Surg Technol Int. 11, 303-310 (2003).
  2. Terzis, J. K., Sun, D. D., Thanos, P. K. Historical and basic science review: past, present, and future of nerve repair. J Reconstr Microsurg. 13 (3), 215-225 (1997).
  3. Bruyns, C. N., Jaquet, J. B., Schreuders, T. A., Kalmijn, S., Kuypers, P. D., Hovius, S. E. Predictors for return to work in patients with median and ulnar nerve injuries. J Hand Surg Am. 28 (1), 28-34 (2003).
  4. Geuna, S., Raimondo, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int Rev Neurobiol. 87 (09), 27-46 (2009).
  5. Kingham, P. J., Kalbermatten, D. F., Mahay, D., Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G. Adipose-derived stem cells differentiate into a Schwann cell phenotype and promote neurite outgrowth in vitro. Exp Neurol. 207 (2), 267-274 (2007).
  6. Stoll, G., Jander, S., Myers, R. R. Degeneration and regeneration of the peripheral nervous system: From Augustus Waller’s observations to neuroinflammation. J Peripher Nerv Syst. 7 (1), 13-27 (2002).
  7. Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annu Rev Biomed Eng. 5, 293-347 (2003).
  8. Johnson, E. O., Zoubos, A. B., Soucacos, P. N. Regeneration and repair of peripheral nerves. Injury. 36S (4), S24-S29 (2005).
  9. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An efficient method for dorsal root ganglia neurons purification with a one-time anti-mitotic reagent treatment. PloS One. 8 (4), e60558 (2013).
  10. Stettner, M., Wolffram, K., et al. A reliable in vitro model for studying peripheral nerve myelination in mouse. J Neurosci Meth. 214 (1), 69-79 (2013).
  11. Kingham, P. J., Mantovani, C., Terenghi, G. Stem cell and neuron co-cultures for the study of nerve regeneration. Method Mol Biol. 695, 115-127 (2011).
  12. Nissinen, M., et al. Myelination in mouse dorsal root ganglion/Schwann cell cocultures. Mol Cell Neurosci. 37 (3), 568-578 (2008).
  13. Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
  14. Lewallen, K. a, Aa Shen, Y. -, De la Torre, A. R., Ng, B. K., Meijer, D., Chan, J. R. Assessing the role of the cadherin/catenin complex at the Schwann cell-axon interface and in the initiation of myelination. J Neurosci. 31 (8), 3032-3043 (2011).
  15. Evans, G. R. Challenges to nerve regeneration. Semin Surg Oncol. 19 (3), 312-318 (2000).
  16. Webber, C., Zochodne, D. The nerve regenerative microenvironment: early behavior and partnership of axons and Schwann cells. Exp Neurol. 223 (1), 51-59 (2010).
  17. Tobita, M., Orbay, H., Mizuno, H. Adipose-derived stem cells: current findings and future persperctives. Discov Med. 11 (57), 160-170 (2011).
  18. Faroni, A., Terenghi, G., Reid, A. J. Adipose-derived stem cells and nerve regeneration: promises and pitfalls. Int Rev Neurobiol. 108, 121-136 (2013).
  19. Strem, B. M., Hicok, K. C., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Xu, Y., Liu, L., et al. Myelin-forming ability of Schwann cell-like cells induced from rat adipose-derived stem cells in vitro. Brain Res. 1239, 49-55 (2008).
  21. Tomita, K., Madura, T., Sakai, Y., Yano, K., Terenghi, G., Hosokawa, K. Glial differentiation of human adipose-derived stem cells: implications for cell-based transplantation therapy. Neuroscience. 236, 55-65 (2013).
  22. Clauser, L., Tieghi, R., Palmieri, A., Carinci, F. Adipose-derived stem cells secrete neurotrophic factors. Annals of Oral and Maxillofacial Surgery. 1 (2), 1-5 (2013).
  23. Di Summa, P. G., Kingham, P. J., Raffoul, W., Wiberg, M., Terenghi, G., Kalbermatten, D. F. Adipose-derived stem cells enhance peripheral nerve regeneration. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (9), 1544-1552 (2010).
  24. Di Summa, P. G., Kalbermatten, D. F., Pralong, E., Raffoul, W., Kingham, P. J., Terenghi, G. Long-term in vivo regeneration of peripheral nerves through bioengineered nerve grafts. Neuroscience. 181, 278-291 (2011).
  25. Sun, F., Zhou, K., Mi, W., Qiu, J. Combined use of decellularized allogeneic artery conduits with autologous transdifferentiated adipose-derived stem cells for facial nerve regeneration in rats. Biomaterials. 32 (32), 8118-8128 (2011).
  26. Zhang, Y., Luo, H., et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 31 (20), 5312-5324 (2010).
  27. Gomillion, C. T., Burg, K. J. L. Stem cells and adipose tissue engineering. Biomaterials. 27 (36), 6052-6063 (2006).
  28. Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (1), 514-517 (1979).
  29. Mantovani, C., Raimondo, S., et al. Morphological, molecular and functional differences of adult bone marrow- and adipose-derived stem cells isolated from rats of different ages. Exp Cell Res. 318 (16), 2034-2048 (2012).
  30. Luca, A. C., Faroni, A., Downes, S., Terenghi, G. Differentiated adipose-derived stem cells act synergistically with RGD-modi fi ed surfaces to improve neurite outgrowth in a co-culture model. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  31. Summa, P. G., Kalbermatten, D., Raffoul, W., Terenghi, G., Kingham, P. J. Extracellular Matrix Molecules Enhance the Neurotrophic Effect of Schwann Cell-Like Differentiated. Tissue Eng. 19 (3-4), 368-379 (2013).
  32. Fudge, N. J., Mearow, K. M. Extracellular matrix-associated gene expression in adult sensory neuron populations cultured on a laminin substrate. BMC Neurosci. 14 (15), 1-19 (2013).
  33. Stabenfeldt, S. E., LaPlaca, M. C. Variations in rigidity and ligand density influence neuronal response in methylcellulose-laminin hydrogels. Acta Biomater. 7 (12), 4102-4108 (2011).
  34. Terenghi, G., Wiberg, M., Kingham, P. J. Chapter 21: Use of stem cells for improving nerve regeneration. Inl Revi Neurobiol. 87 (09), 393-403 (2009).
  35. Richardson, J. a, Rementer, C. W., Bruder, J. M., Hoffman-Kim, D. Guidance of dorsal root ganglion neurites and Schwann cells by isolated Schwann cell topography on poly(dimethyl siloxane) conduits and films. J Neural Eng. 8 (4), 046015 (2011).
  36. Seggio, aM., Narayanaswamy, A., Roysam, B., Thompson, D. M. Self-aligned Schwann cell monolayers demonstrate an inherent ability to direct neurite outgrowth. J Neural Eng. 7 (4), 046001 (2010).
  37. Xu, F. J., Wang, Z. H., Yang, W. T. Surface functionalization of polycaprolactone films via surface-initiated atom transfer radical polymerization for covalently coupling cell-adhesive biomolecules. Biomaterials. 31 (12), 3139-3147 (2010).
  38. Armstrong, S. J., Wiberg, M., Terenghi, G., Kingham, P. J. ECM molecules mediate both Schwann cell proliferation and activation to enhance neurite outgrowth. Tissue Eng. 13 (12), 2863-2870 (2007).

Tags

Neurowetenschappen Co-cultuur neuronen stamcellen neurietuitgroei perifere zenuw reparatie cel-cel interactie
Achterwortelganglia Neuronen en Gedifferentieerde Adipose-afgeleide stamcellen: Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-cultuur Model naar regeneratie van perifere zenuwen Bestudeer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. … More

de Luca, A. C., Faroni, A., Reid, A. J. Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration. J. Vis. Exp. (96), e52543, doi:10.3791/52543 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter