Summary
Musen femorale arterie wire skade model af restenose er teknisk udfordrende. I denne protokol viser vi de vigtigste tekniske detaljer afgørende for en vellykket udførelse af wire skade at fremkalde ensartet neointima for studier af restenose.
Abstract
Kardiovaskulær sygdom forårsaget af aterosklerose er den førende dødsårsag i den udviklede verden. Indsnævring af karlumenet grund af aterosklerotisk plaque udvikling eller bristning af etablerede plaques, afbryder normal blodgennemstrømning fører til forskellige følgesygdomme såsom myokardieinfarkt og slagtilfælde. I klinikken endovaskulære procedurer, såsom ballonudvidelse er almindeligt udført for at genåbne lumen. Men disse behandlinger uundgåeligt beskadige karvæggen samt det vaskulære endotel, udløser en overdreven healing reaktion og udvikling af en neointimal plak, der strækker sig ind i hulrummet forårsager fartøj restenose (re-forsnævring). Restenose fortsat en væsentlig årsag til svigt af endovaskulære behandlinger for åreforkalkning. Således prækliniske dyremodeller for restenose er af vital betydning for at undersøge patofysiologiske mekanismer samt translationel tilgange til vaskulære indgreb. Blandt flere murine experimental modeller er lårarterien wire skade bredt accepteret som den mest egnede til studier af post-angioplastik restenose, fordi det ligner angioplastiproceduren der skader både endotel og karvæggen. Men mange forskere har svært ved at udnytte denne model på grund af sin høje grad af tekniske vanskeligheder. Dette skyldes primært en metaltråd skal indsættes i den femorale arterie, der er ca. tre gange tyndere end wiren, for at generere tilstrækkelig skade til at inducere fremtrædende neointima. Her beskriver vi de vigtigste kirurgiske detaljer til effektivt at overvinde de store tekniske vanskeligheder ved denne model. Ved at følge de præsenterede procedurer udfører musen lårarterien wire skade bliver lettere. Når bekendt, kan hele proceduren være afsluttet inden for 20 min.
Protocol
BEMÆRK: Etik Statement: Alle procedurer er i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (National Academies Press, 8. udgave, 2011), og protokoller godkendes af Institutional Animal Care og brug Udvalg ved University of Wisconsin. Alle operationer blev udført under isofluran anæstesi (gennem indånding, flowhastighed 2 ml / min), og der blev gjort alt for at minimere dyrenes lidelser. Dyrene blev aflivet i et kammer efterhånden fyldt med CO 2.
1. Induktion af generel anæstesi og hudincision
- Brug Male C57BL / 6 mus med en alder på 12-16 uger og vægt på 23-28 g. Bedøve dyret med isofluran gennem et lukket kredsløb bedøvelsesmiddel apparat. Bekræft korrekt bedøvelse ved at klemme sin tå. Påfør nogle kunstige tårer salve på øjne for at forhindre tørhed.
- Placer musen i rygleje med venstre bagben lidt bortført og knæleddet slightly bøjet. Barber håret omkring den øverste venstre lår regionen og desinficere huden med chlorhexidin, anvendes tre gange ved hjælp af sterile bomuld tippes applikatorer. Brug en varm perle sterilisator at holde instrumenterne steriliseret under operationen.
- Placer en steriliseret gaze drapere over venstre ben. Lav en 1,5 cm lige, langsgående incision i huden på den venstre mediale lår fra knæleddet til lysken (figur 1A).
2. Udsættelse af lårarterien og filialer
BEMÆRK: Figur 1B viser brutto kar anatomi i overlåret. Den overfladiske femorale arterie (SFA) kan iagttages gennem et dissektionsmikroskop når huden indsnit foretaget korrekt langs midterlinien af den mediale lår.
- Åbn den tynde fascia overliggende SFA med fine pincet og derefter loop SFA med 9-0 nylon sutur.
BEMÆRK: I denne proces, den femorale nerve let sætte såide, men den tilstødende femorale vene kræver opmærksomhed, fordi dens væg er så tynd, at den nemt perforerer og blødninger. Nøglen teknik er at fokusere på arterien selv; så længe dissektion udføres tæt på arterie, enhver utilsigtet vene skader undgås. - Når SFA er loopes, holde suturen med myg pincet og træk den lidt nedad. Denne manøvre gør yderligere dissektion lettere, men for at undgå at beskadige arterien ikke trække alt for kraftigt.
- Fortsæt dissekere arterien proksimalt for at eksponere og sløjfe den fælles femoralarterie (CFA) med 9-0 nylon sutur.
BEMÆRK: Normalt looping CFA i et punkt distalt for epigastriske arterie (Figur 1B) er nok til wire indsættelse. Hold CFA sutur loop med mosquito pincet på samme måde. - Træk CFA sutur loop opad og SFA sutur loop nedad for at afdække tvedeling af SFA og dyb femoralarterie (DFA). DFA, den største gren af CFA,går mod lårmusklen (figur 1B).
BEMÆRK: Tråden vil blive indsat fra DFA senere. - Loop DFA med ekstra forsigtighed, da den tilstødende vene er filtret under arterien. I tilfælde af blødning fra venen, en 30- til 60 sek enkel kompression med gaze er normalt tilstrækkelig til at frembringe hæmostase.
- Når DFA er loopes med 9-0 nylon sutur, sørge for alle tre sutur loops er i deres korrekte positioner (figur 2A).
- Fortsæt med dissektion af DFA distalt at ligere arterien i et punkt så langt som muligt fra forgreningen. Skær ekstra sutur men efterlade en vis længde, så de to ender kan holdes med myg pincet, som stabiliserer DFA gør wire indsættelse lettere.
3. Oprettelse Wire Skade
- Indsæt Wire via DFA
- Si CFA, SFA, og DFA suturer at etablere en midlertidig hæmostat.
- Lav et lille hul i DFA med microscissors. Sæt spidserne af de buede microtweezers at dilatere hullet stort nok til en wire med en 0,015 inch diameter (figur 2B viser forskellen mellem den arterie og ledning).
- Før et hul i DFA, løsnes CFA sutur loop og forsigtigt klemme / presse DFA flere gange med sløve spids microtweezers. Denne manøvre udvider arterielle diameter bemærkelsesværdigt at lette wire indsættelse. Befugtning tråden grundigt med PBS er også vigtigt for en glat indsættelse.
- Når du foretager et hul i DFA, ikke beskære arterievæggen, men lave en lille v-formet nip og tag fat i klappen med spids skarpe microtweezers for manipulation.
- Sæt wire gennem tilstrækkeligt-dilaterede hul på DFA. Forsigtigt fremføre tråden mod bækkenarterie mens løsne suturen løkke rundt om CFA. 5-8 mm er nok til at dække alle CFA længde i de fleste tilfælde (figur 2C
- Lad Wire inde i 1 min
- Efter indsættelse af ledning til den optimale længde, overlade det til 1 min at overstrække arterievæggen. Fugt wiren og arterier med PBS for at forhindre udtørring. En anden 9-0 nylonsutur kan placeres omkring DFA proximalt til wire-indsætningspunktet i denne ventetid. Denne sutur vil senere blive anvendt til at lukke hullet på DFA efter fjernelse af tråden.
- Hent Wire og Genoptag blodgennemstrømningen
- Hold tråden med fartøjets kanylering pincet, og træk det tilbage forsigtigt; wiren skal hentes glat. For at overvinde enhver modstand, sædvanligvis forårsaget af vedhæftning af ledning til arterievæggen, fældede tråden med forsigtig rotation er nyttigt. Igen kunne en kraftig manøvre resultere i dyr tab.
- After hente tråden ligere DFA ved punktet for forgreningen med 9-0 nylonsutur. Må ikke ligere for tæt på forgreningen, hvilket ville bringe blodet udstrømning til SFA.
- Løsn SFA og CFA sutur sløjfer at genoptage normal blodgennemstrømning. Bemærk, at CFA er godt udvidet med wire insertion (figur 2D).
4. Skin Lukning og Postoperativ pleje
- Kontrol blødninger. Mindre oser kan stoppes ved simpel kompression; nogle store arterielle blødninger kræver sting med en 11-0 nylon sutur. Disse suturerede arterier i sidste ende vil resultere i arteriel okklusion.
- Luk huden sår med hud hæftemaskiner (normalt 3-4 hæfteklammer). Hold sårområdet steriliseret ved anvendelse af chlorhexidin kirurgisk løsning.
- Påfør efter kirurgi behandlinger. Styr smerter i mus med subkutane injektioner af buprenorphin. Hold musen på opvarmning pad, indtil det har genvundet SUFstrækkelig bevidsthed for at opretholde brystleje. Hus den på et rent bur uden selskab af andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fire uger efter operationen, indsamles wire-sårede femoralarterie og gøre en paraffin blok prøve at analysere neointimadannelse. Fremkald generel anæstesi som beskrevet ovenfor. Åbn brystet straks og indsætte en 20-gauge butterfly nålen til den venstre ventrikel. Slut linje til en infusion flaske. Udfør perfusion fiksering via dråbeinfusion PBS efterfulgt af 4% paraformaldehyd (som regel 10-20 ml hver). Infusionen flasken placeres ca. 140 cm højere end hjertet niveau, så dyret perfuseres ved fysiologisk pressure.Wait i 20 minutter og derefter tage ud wire-sårede CFA og ordne det i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C. Lav en paraffin blok af prøven under anvendelse af standard histologiske teknikker og forberede tværsnit af 5-um tykkelse for histologisk farvning.
Hematoxylin-eosin-farvning vil tillade klar visualisering af neointima-dannelse inde i wire-skadet femoral arterie (figur 3A, wire-skadet femorale arterie, 3B skadede femoral arterie) .Brug en ordentlig software til at måle lumen område (LA), det indre elastiske lamina (IEL) område, og den ydre elastiske lamina (EEL) område fra tværsnit (figur 3C). Beregn intima område ved at trække lumen område fra IEL area; beregne medierne område ved at trække IEL område fra EEL område. Intima område / media area ratio anvendes til at sammenligne neointima formationer mellem forskellige eksperimentelle grupper.
Figur 1: skematiske illustrationer af Skin incision og karrene anatomi. (A) En passende hudincision er omkring 1,5 cm i længde, langs midterlinien af mediale overlår. (B) Find den overfladiske femorale arterie første, fælles femorale arterie næste, og endeligdyb femoral arterie. Skær hver arterie omhyggeligt uden at beskadige den tilstødende vene.
Figur 2: Wire Skade Procedure. (A) Den fælles femorale arterie (pil), den overfladiske femorale arterie (stiplet pil), og den dybe femoral arterie (pilespids) udsættes og løkker med suturer. (B) Bemærk størrelsen forskellen mellem arterier og 0,015 inch wire. (C) Tråden indsat via dybe femoral arterie. Hold ledningen inde i 1 min for at have arterievæggen overbebyrdet. (D) Blood flow genoptages. Den fælles femorale arterie er godt udvides efter wire skade (pil). Bar angiver 1 mm.
Figur3: Hematoxylin-eosin farvning af wire-skadet og uskadte lårarterier. (A) et tværsnit af en wire-skadet femoral arterie afslører en tyk, stærkt cellulære neointima plak. (B) et tværsnit af en uskadt femorale arterie viser intakte arteriel vægkonstruktioner uden neointima formation. (C) Den grønne linje skildrer lumen område, den gule linje afgrænser intern elastisk lamina, og den blå linje afgrænser ekstern elastisk lamina. Bar indikerer 100 um.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Proceduren Tråden skade er gældende for alle musestammer, så længe deres anatomiske strukturer er ens. 4 I dette papir, anvendte vi C57BL / 6-mus med en alder på 12-16 uger. Som vi har lært fra vores indledende undersøgelser, lårarterierne af mus yngre end 10 uger er ofte så små, at wire indsættelse er ganske udfordrende. På den anden side, wire indsættelse i mus ældre end 16 uger er teknisk lettere, men har tendens til at resultere i mere variabel neointimal hyperplasi. Hunmus tendens til at pådrage sig mindre neointimal dannelse end mænd. Selv procedure tråden skade kan udføres på begge sider af de femorale arterier, foretrækker vi venstre side på grund af den anatomiske tilgængelighed for højrehåndede operatører.
Blandt alle de musemodeller af post-angioplastik restenose, arteriel wire skade hovedsagelig nøje efterligner angioplastik ved endotel blotlægning og karvæggen overstreching. 2,5,6 Derer to store mål-arterier til ledninger skade: femorale arterier og halspulsårer. Fra et teknisk synspunkt, wire indsættelse er lettere for halspulsårer, fordi de er bredere end lårarterier. , Neointimadannelse har imidlertid tendens til at være mindre robust i halspulsårer end i femorale arterier, sandsynligvis på grund af mindre effektiv blotlægning. Nogle forfattere anvender en håndlavet enhed til at skabe en mere aggressiv endotel blottelse i halspulsårer. 7 På den anden side den fordel, at den femorale arterie wire skade er, at den kan udføres med homogent fremstillet, kommercielt tilgængelige kabler til at inducere neointimal hyperplasi i en reproducerbar måde.
For at gøre en succesfuld tråd skade i mus lårarterier, det vigtigste er at operere under et dissektionsmikroskop med tilstrækkelig forstørrelse og bruge fine instrumenter - microtweezers og microscissors i særdeleshed. Microtweezers med skarpe tips er nyttige for dissect ud væv omkring arterien mens dem med stumpe tips er nyttige til at placere en sutur løkke omkring arterien og til at spile wiren indgangshullet fra en skarp arteriotomi med microscissors.
En anatomisk dissektion af arterien er en anden tast. Omkring arterielle adventitia der findes en tynd plan, hvor dissektion kan udføres let og jævnt. Find flyet først, derefter gå videre med dissektion. Også forsøge at dissekere den tilstødende vene kun på stedet for sutur loops at undgå vene skader, som er den væsentligste årsag til blødning i denne procedure. Selv i den oprindelige metode arterien og venen sløjfes sammen, 4 finder vi, at looping arterie giver kun bedre kontrol for både hæmostase og wire indsættelse.
Wire indsættelse er den vanskeligste del af denne procedure. En 0,015 tommer ledning er ca. tre gange tykkere end DFA, arterien adgang. De vigtigste teknikker herer: dilatere DFA selv før arteriotomi; at give et mindre indgangshullet som gradvis dilateret med microtweezer tips; og undgå kraftig wire indsættelse - de teknikker er beskrevet i protokollen afsnit. Mens der i den oprindelige metode lidocain anvendes til at spile arterien før wire indsættelse 4, finder vi det unødvendigt.
Neointimadannelse efter femoral arterie wire skade skrider med tiden, toppe ved 3-4 uger efter skade, og forbliver stabil efter 8 uger. 4,8 Forfatterne normalt vente i 4 uger baseret på vores foreløbige data, at mængden af neointima efter 3 uger er generelt mindre end den mængde, ved 4 uger efter wire skade (data ikke vist).
Interessant, svarene på arteriel skade varierer mellem forskellige musestammer. Ifølge flere rapporter undersøger forskelle mellem musestammer efter femoral eller halspulsåren skade, FVB / N-mus viser den højeste amoUNT af neointimadannelse efterfulgt af 129 / SVJ, C3H / HeJ, BALB / C, og C57BL / 6, hhv. 4,9,10 Disse karakteristika bør overvejes, når du opretter en forsøgsplan. Den femorale skade model kan også anvendes til undersøgelse af inflammatoriske ændringer efter vaskulær skade. Inflammatorisk celleinfiltration blev rapporteret at stige betydeligt tre dage efter skade. 11
Sammenfattende wiren skade model under anvendelse af muse lårarterier er særligt egnet til at undersøge post-angioplasti restenose, og processen kan udføres sikkert og nemt ved anvendelse af fremgangsmåden præsenteret her. Hele proceduren kan være færdig inden for 20 min, når de teknikker er fuldt bekendt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
- Dzau, V. J., Braun-Dullaeus, R. C., Sedding, D. G. Vascular proliferation and atherosclerosis: new perspectives and therapeutic strategies. Nat Med. 8 (11), 1249-1256 (2002).
- Hui, D. Y. Intimal hyperplasia in murine models. Curr Drug Targets. 9 (3), 251-260 (2008).
- Ferns, G. A., Avades, T. Y. The mechanisms of coronary restenosis: insights from experimental models. Int J Exp Pathol. 81 (2), 63-88 (2000).
- Sata, M., et al. A mouse model of vascular injury that induces rapid onset of medial cell apoptosis followed by reproducible neointimal hyperplasia. J Mol Cell Cardiol. 32 (11), 2097-2104 (2000).
- Xu, Q. Mouse models of arteriosclerosis: from arterial injuries to vascular grafts. Am J Pathol. 165 (1), 1-10 (2004).
- Lv, L., Meng, Q., Ye, M., Wang, P., Xue, G. STAT4 deficiency protects against neointima formation following arterial injury in mice. J Mol Cell Cardiol. 74C, 284-294 (2014).
- Zhu, B., Kuhel, D. G., Witte, D. P., Hui, D. Y. Apolipoprotein E inhibits neointimal hyperplasia after arterial injury in mice. Am J Pathol. 157 (6), 1839-1848 (2000).
- Fu, Y., Duru, E. A., Davies, M. G. Effect of metabolic syndrome on the response to arterial injury. J Surg Res. , (2014).
- Kuhel, D. G., Zhu, B., Witte, D. P., Hui, D. Y. Distinction in genetic determinants for injury-induced neointimal hyperplasia and diet-induced atherosclerosis in inbred mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 22 (6), 955-960 (2002).
- Cooley, B. C. Mouse strain differential neointimal response in vein grafts and wire-injured arteries. Circ J. 71 (10), 1649-1652 (2007).
- Ishigami, N., et al. Deficiency of CuZn superoxide dismutase promotes inflammation and alters medial structure following vascular injury. J Atheroscler Thromb. 18 (11), 1009-1017 (2011).
