Summary
O mouse modelo de lesão fio artéria femoral de reestenose é tecnicamente desafiador. Neste protocolo, mostrar os principais detalhes técnicos essencial para a realização com êxito lesão fio para induzir neo�tima consistente para estudos de reestenose.
Abstract
A doença cardiovascular causadas por aterosclerose é a principal causa de morte no mundo desenvolvido. O estreitamento da luz do vaso, devido ao desenvolvimento da placa aterosclerótica ou a ruptura de placas estabelecidos, interrompe o fluxo normal do sangue levando a várias morbidades, tais como infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral. Na clínica procedimentos endovasculares, como a angioplastia são comumente realizados para reabrir o lúmen. No entanto, estes tratamentos inevitavelmente danificar a parede do vaso, bem como o endotélio vascular, desencadeando uma resposta de cicatrização excessiva e o desenvolvimento de uma placa que se estende da neointima no lúmen fazendo com que a restenose do vaso (re-estreitamento). A reestenose permanece uma das principais causas do fracasso dos tratamentos endovasculares para aterosclerose. Assim, os modelos animais pré-clínicos de reestenose são de vital importância para a investigação dos mecanismos fisiopatológicos, bem como translacional abordagens para intervenções vasculares. Entre vários experime murinomodelos ntal, lesão fio artéria femoral é amplamente aceito como o mais adequado para estudos de reestenose pós-angioplastia, pois se assemelha ao procedimento de angioplastia que prejudica a ambos endotélio e da parede do vaso. No entanto, muitos pesquisadores têm dificuldade em utilizar este modelo devido ao seu alto grau de dificuldade técnica. Isto é primeiramente porque um fio de metal tem de ser inserido dentro da artéria femoral, o que é cerca de três vezes mais fino do que o fio, para gerar suficiente para induzir lesão neoíntima proeminente. Aqui, descrevemos os detalhes cirúrgicos essenciais para efetivamente superar as maiores dificuldades técnicas deste modelo. Seguindo os procedimentos apresentados, realizando a lesão de arame artéria femoral de rato torna-se mais fácil. Uma vez familiarizado, todo o processo pode ser concluído no prazo de 20 min.
Protocol
Declaração de Ética: NOTA: Todos os procedimentos estão em conformidade com o Manual sobre Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (National Academies Press, 8ª edição, 2011), e os protocolos aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional da Universidade de Wisconsin. Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia isoflurano (através de inalação, taxa de fluxo de 2 ml / min), e foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento. Os animais foram sacrificados numa câmara gradualmente cheio com CO 2.
1. A indução da anestesia geral e incisão na pele
- Use macho C57BL / 6 com idade de 12-16 semanas, com peso de 23-28 g. Anestesiar o animal por isoflurano através de um aparelho anestésico-circuito fechado. Confirme anesthetization adequada por beliscar seu dedo do pé. Aplique um pouco de pomada lágrimas artificiais nos olhos para evitar o ressecamento.
- Posicione o mouse em decúbito dorsal com o membro posterior esquerdo ligeiramente sequestrado e do joelho sl conjuntaightly flexionados. Raspar o cabelo em torno da região da coxa esquerda e desinfectar a pele com clorexidina, aplicado três vezes usando algodão estéril aplicadores derrubado. Use um esterilizador talão quente para manter os instrumentos esterilizados durante a cirurgia.
- Coloque uma cortina de gaze esterilizada sobre a perna esquerda. Faça, uma incisão na pele longitudinal 1,5 centímetros em linha reta na coxa medial esquerdo da articulação do joelho até a virilha (Figura 1A).
2. Exposição da artéria femoral e Ramos
NOTA: A Figura 1B mostra a anatomia vascular grave na coxa superior. A artéria femoral superficial (SFA) pode ser observado através de um microscópio de dissecação, quando a incisão na pele é adequadamente feita ao longo da linha média da coxa medial.
- Abra-se a fáscia fina que recobre a SFA com uma pinça fina e, em seguida, enrole o SFA com 9-0 nylon sutura.
NOTA: Neste processo, o nervo femoral é facilmente colocar comoide, mas a veia femoral adjacente requer muita atenção, pois sua parede é tão fina que facilmente perfura e sangra. A técnica chave é se concentrar na própria artéria; enquanto a dissecção é realizada perto da artéria, veia qualquer dano acidental é evitável. - Uma vez que a SFA é enrolado, segure o fio de sutura com uma pinça mosquito e puxe-o levemente para baixo. Essa manobra torna ainda mais dissecção mais fácil, mas para evitar danificar a artéria não puxar com muita força.
- Continue dissecção da artéria proximal para expor e laço da artéria femoral comum (CFA) com 9-0 nylon sutura.
NOTA: Normalmente, o looping CFA em um ponto distal à artéria epigástrica (Figura 1B) é suficiente para a inserção do fio. Segure o laço de sutura CFA com uma pinça mosquito da mesma forma. - Puxe o laço de sutura CFA para cima e para o laço de sutura SFA para baixo para descobrir a bifurcação da SFA e artéria femoral profunda (DFA). O DFA, o principal ramo do CFA,vai para o músculo da coxa (Figura 1B).
NOTA: O fio será inserido a partir da DFA mais tarde. - Passe o DFA com cuidado extra porque a veia adjacente está embaraçada por baixo da artéria. Em caso de hemorragias a partir da veia, um de 30 a 60 segundos de compressão simples com gaze é geralmente suficiente para produzir a hemostasia.
- Uma vez que o DFA é intercalado com 9-0 nylon sutura, certifique-se todos os três laços de sutura estão em suas posições corretas (Figura 2A).
- Prossiga com a dissecção da DFA distal ao ligar a artéria em um ponto, na medida do possível a partir da bifurcação. Cortar sutura extra, mas deixe um determinado comprimento de modo que as duas extremidades pode ser realizada com uma pinça de mosquito, que estabilizam o DFA tornando mais fácil a inserção do fio.
3. Criação de Lesão Fio
- Insira fio via DFA
- Coe as suturas CFA, SFA, e DFA para estabelecer uma pinça hemostática temporária.
- Faça um pequeno furo no DFUm com microtesoura. Inserir as pontas das micropinças curvas para dilatar o orifício suficientemente grande para um fio com um diâmetro de 0,015 polegadas (Figura 2B demonstra a diferença de tamanho entre a artéria e o fio).
- Antes de fazer um buraco na DFA, afrouxar o laço de sutura CFA e gentilmente apertar / apertar o DFA várias vezes com micropinças maçantes de ponta. Esta manobra aumenta o diâmetro arterial notavelmente para facilitar a inserção do fio. Humedecer o fio cuidadosamente com PBS também é importante para uma inserção suave.
- Ao fazer um buraco na DFA, não colhe a parede arterial, mas fazer uma pequena alfinetada em forma de V e beliscar a aba com micropinças de ponta aguçada para a manipulação.
- Insira o fio através do furo adequadamente-dilatada no DFA. Gentilmente avançar o fio em direção à artéria ilíaca, enquanto soltando o laço de sutura em torno do CFA. 5-8 mm é suficiente para cobrir todo o comprimento CFA na maioria dos casos (Figura 2C
- Deixar fio dentro de um Min
- Depois de inserir o fio com o comprimento óptimo, deixá-lo durante 1 min para esticar a parede arterial. Umedeça o fio e artérias com PBS para evitar a secagem. Outra sutura de nylon 9-0 pode ser colocada em torno da DFA proximal ao ponto de inserção de fio durante este tempo de espera. Esta sutura será utilizado mais tarde para fechar o buraco no DFA após a remoção do fio.
- Recuperar fio e retomar o fluxo de sangue
- Segure o fio com uma pinça de punção embarcação, e puxe-o para trás suavemente; o fio deve ser recuperada sem problemas. Para ultrapassar qualquer resistência, geralmente causado pela adesão do arame para a parede arterial, puxando para trás o fio com uma rotação suave é útil. Mais uma vez, uma manobra forçada poderia resultar em perda de animal.
- AD epois de recuperar o fio, ligar o DFA no ponto de bifurcação com sutura de nylon 9-0. Não ligar muito próximo à bifurcação, o que comprometeria a saída de sangue para o SFA.
- Solte os laços de sutura SFA e CFA para retomar o fluxo de sangue normal. Note-se que o CFA é bem expandido pela inserção de fio (Figura 2D).
4. Pele Encerramento e Cuidados Pós-Operatórios
- Controle sangra. Exsudação Minor pode ser interrompido por compressão simples; algumas grandes hemorragias arteriais vai precisar de pontos com uma sutura 11-0 nylon. Estas artérias suturadas, acabará por resultar em oclusão arterial.
- Feche a pele ferida com grampeadores da pele (geralmente 3-4 grampos). Mantenha a área ferida esterilizado através da aplicação de solução cirúrgica clorexidina.
- Aplicar tratamentos pós-cirúrgicos. Controlar a dor do mouse com injeções subcutâneas de buprenorfina. Mantenha o mouse sobre a almofada de aquecimento até que recuperou sufficiente de consciência para manter decúbito esternal. Casa-lo em uma gaiola limpa sem a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado.
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Representative Results
Quatro semanas após a cirurgia, dissecção da artéria femoral feridos fios e fazer espécime Bloco A parafina para analisar a formação neointima. Induzir anestesia geral, tal como descrito acima. Abra o peito imediatamente e insira uma de calibre 20 borboleta agulha para o ventrículo esquerdo. Ligue a linha para um frasco de infusão. Realizam a fixação de perfusão através de infusão de gotas de PBS, seguido por paraformaldeído a 4% (geralmente 10-20 mL, cada um). O frasco de infusão é colocado cerca de 140 centímetros acima do nível do coração, de modo que o animal é perfundido a pressure.Wait fisiológico por 20 min, em seguida, retire o CFA feridos fios e corrigi-lo em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C. Faça um bloco de parafina de a amostra usando técnicas histológicas padrão e preparar secções transversais de espessura de 5 mm para coloração histológica.
Coloração pela hematoxilina-eosina permitirá a visualização nítida de formação neointima dentro do lesionado fios fartéria emoral (Figura 3A, artéria femoral feridos fios; 3B, artéria femoral ileso) .Use um software adequado para medir a área do lúmen (LA), a área da lâmina elástica interna (IEL), e a área (EEL) externo lâmina elástica de secção transversal (Figura 3C). Calcular a área da íntima subtraindo a área do lúmen da área IEL; calcular a área de mídia subtraindo área IEL da área EEL. Íntima relação área / área de meios é usada para comparar as formações neoíntima entre diferentes grupos experimentais.
Figura 1: ilustrações esquemáticas de incisão na pele e Vasculature Anatomy. (A) Uma incisão de pele adequado é cerca de 1,5 cm de comprimento, ao longo da linha média do medial da coxa. (B) Encontre a artéria femoral superficial em primeiro lugar, a artéria femoral comum seguinte, e, finalmente, oartéria femoral profunda. Dissecar cada artéria cuidadosamente sem danificar a veia adjacente.
Figura 2: Fio Procedimento ferimento. (A) A artéria femoral comum (seta), a artéria femoral superficial (seta pontilhada), ea artéria (cabeça de seta) femoral profunda são expostos e em loop com suturas. (B) Observe a diferença de tamanho entre as artérias e a 0,015 polegadas fio. (C) O fio é inserido através da artéria femoral profunda. Mantenha o fio dentro de 1 min para ter a parede arterial sobrecarregado. (D) O fluxo sanguíneo é retomada. A artéria femoral comum é bem-expandiu após a lesão de arame (seta). Bar indica um milímetro.
Figura3: coloração de hematoxilina-eosina de artérias femorais feridos fios e não lesados. Uma secção transversal de uma artéria femoral ferido fios (A) revela um de espessura, placas de neoíntima altamente celular. (B) Uma secção transversal de uma artéria femoral não lesionado demonstra estruturas intactas da parede arterial, sem qualquer formação de neoíntima. (C) O verde linha delimita as áreas da luz, a linha amarela delineia lâmina elástica interna, ea linha azul delineia lâmina elástica externa. Bar indica 100 um.
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Discussion
O procedimento de lesão fio é aplicável a todas as linhagens de camundongos, desde que as suas estruturas anatômicas são semelhantes. 4 Neste trabalho, utilizou-se do sexo masculino camundongos C57BL / 6 com uma idade de 12-16 semanas. Como aprendemos a partir de nossos estudos preliminares, as artérias femorais de ratos mais jovens de 10 semanas são muitas vezes tão pequeno que a inserção do fio é bastante desafiador. Por outro lado, a inserção do fio nos ratos mais velhos que 16 semanas, é tecnicamente mais fácil, mas tende a resultar em hiperplasia neointimal mais variável. Os ratos fêmeas tendem a incorrer em menor formação neointimal que os machos. Embora o procedimento de lesão de arame pode ser realizado em ambos os lados das artérias femorais, nós preferimos o lado esquerdo, devido à acessibilidade anatómica para operadores dextros.
Entre todos os modelos de ratos de reestenose pós-angioplastia, lesão arterial fio imita principalmente perto angioplastia por desnudação endotelial e overstreching parede do vaso. 2,5,6 Háduas grandes artérias alvo para lesão fio: artérias femorais e carótidas. De um ponto de vista técnico, de inserção do fio é mais fácil para as artérias carótidas, porque eles são mais largas do que as artérias femorais. No entanto, a formação da neoíntima tende a ser menos robusto do que em artérias carótidas que em artérias femorais, provavelmente devido a desnudação menos eficaz. Alguns autores utilizam um dispositivo feito à mão para criar uma desnudação endotelial mais agressivo em artérias carótidas. 7 Por outro lado, a vantagem de o modelo de lesão de arame artéria femoral é que ele pode ser realizado com homogeneamente fabricados fios, disponíveis comercialmente para induzir a hiperplasia neointimal em uma maneira reprodutível.
Para fazer com que uma lesão fio sucesso em ratos artérias femorais, é a chave para operar sob um microscópio de dissecação com ampliação suficiente e usar instrumentos finos - micropinças e microtesoura em particular. Micropinças com pontas afiadas são úteis para dissecçãot os tecidos circundantes da artéria enquanto aqueles com ponta romba são úteis para colocar um laço de sutura em torno da artéria a dilatar-se e o orifício de entrada de fios feitos por uma arteriotomia com microtesouras afiado.
Uma dissecção anatômica da artéria é outra chave. Em torno da adventícia da artéria existe um plano onde a dissecção fina pode ser realizada facilmente e sem problemas. Encontre o plano em primeiro lugar, em seguida, proceder com a dissecção. Além disso, tente dissecar a veia adjacente apenas no local de sutura loops para evitar danos veia, o que é a principal causa de hemorragia neste procedimento. Embora no método original da artéria e veia estão em loop juntos, 4 descobrimos que artéria looping só dá melhor controle para ambos hemostasia e inserção do fio.
Inserção do fio é a parte mais difícil deste procedimento. Um fio de 0,015 polegadas é cerca de três vezes mais espessa que a DFA, a artéria de acesso. As principais técnicas aquisão: a dilatar-se DFA antes arteriotomia; fazendo um pequeno orifício de entrada que está gradualmente dilatado, com dicas microtweezer; e evitando a inserção do fio forte - essas técnicas são detalhados na seção de protocolo. Enquanto que no método de lidocaína inicial é aplicada para dilatar a artéria antes da inserção do fio 4, considera-se desnecessário.
Formação neointima após lesão de arame artéria femoral progride com o tempo, um pico a 3-4 semanas após a lesão, e mantém-se estável após 8 semanas. Os autores 4,8 geralmente esperar durante 4 semanas, com base nos nossos dados preliminares que a quantidade de neoíntima em 3 semanas é, geralmente, menos do que a quantidade às 4 semanas após a lesão de arame (dados não mostrados).
Curiosamente, as respostas à lesão arterial diferem entre várias linhagens de camundongos. De acordo com vários relatórios que investigam as diferenças entre linhagens de camundongos após femoral ou lesão da artéria carótida, camundongos FVB / N exibir a maior amount de formação neointima, seguido por 129 / SvJ, C3H / HeJ, BALB / C, e C57BL / 6, respectivamente. 4,9,10 Essas características devem ser consideradas ao compor um plano experimental. O modelo de lesão do nervo femoral também pode ser utilizado para investigação de alterações inflamatórias após a lesão vascular. Infiltração de células inflamatórias foi relatado para aumentar significativamente a três dias após a lesão 11.
Em conclusão, o modelo de lesão de arame usando rato artérias femorais é particularmente adequado para investigar a restenose pós-angioplastia, e o processo pode ser realizado de forma segura e facilmente, utilizando o método aqui apresentado. Todo o procedimento pode ser terminado dentro de 20 min uma vez que as técnicas são completamente familiarizados.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fixed Core Wire Guide | Cook | G02426 | Diameter 0.015 inch, Straight |
| Dilation Forceps | Roboz | RS-4927 | Curved, blunt tips |
| Dumont Tweesers #5 | World Precision Instruments | 14095 | Straight, sharp tips |
| Dumont Vessel Cannulation Forceps | World Precision Instruments | 503373 | |
| McPherson-Vannas Scissors | World Precision Instruments | 501234 | |
| Mosquito Forceps | World Precision Instruments | 501291 | |
| Ethilon Nylon Suture 9-0 | Ethicon | 7717G | 9-0, Black Nylon Monofilament |
| Micro AROSuture, Sterile 11-0, 70 micrometers, MET Point | AROSurgical | VT4A00N07 | 11-0, Black Nylon Monofilament |
| 3M Precise Multi-Shot DS Disposable Skin Stapler | 3M | DS-25 |
References
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