Abstract
İnsan derisi önemli bir bariyer işlevi vardır ve patojenlerin doku homeostazında ve korunmasına katkıda çeşitli bağışıklık hücrelerini içerir. Cilt erişimi nispeten kolay olduğundan, periferik immün düzenleyici mekanizmaları incelemek için ideal bir platform sağlar. aynı zamanda bağışıklık yerleşik sağlıklı deri Davranış immüno hücrelerin ancak, sedef hastalığı gibi iltihaplı deri hastalıklarının gelişiminde önemli bir rol oynar. Gelişmekte olan anlayışlar rağmen, çeşitli iltihaplı cilt hastalıkları altında yatan biyolojinin anlayışımız hala sınırlıdır. biyopsi yapılan deri numunelerinden izole kaliteli (tek) hücre popülasyonları için bir ihtiyaç vardır. Şimdiye kadar, izolasyon prosedürleri ciddi canlı hücre yeterli sayıda elde eksikliği ile engellenmiştir edilmiştir. İzolasyon ve sonraki analizler nedeniyle de elde etmek için geçerli ayrılma işlemleri nedeniyle mekanik ve kimyasal strese, immün hücre soyu belirteçleri kaybı etkilenmişTek hücre süspansiyonu. Burada, otomatik bir doku aynştıncı ve kollajenaz muamelesi ile mekanik deri ayrışmasını birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan deri T hücrelerinin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması üzerine, CD4, CD8, Foxp3 ve CD11c gibi en bağışıklık soy işaretlerinin ifadesi korur. Başarılı CD4 + T hücre izolasyonu ve sonraki fenotipik ve fonksiyonel analiz örnekleri gösterilmiştir.
Introduction
cilt, vücut ve çevre arasındaki temel arayüz olarak, dış fiziksel, kimyasal ve yaralama, ultraviyole radyasyon ve mikro-organizmalar gibi biyolojik hakaretlerle karşı ilk savunma hattını sağlar. Cilt iki bölme, epidermis ve dermiş içerir ve Langerhans hücreleri, makrofajlar, dendritik hücreler (DC) ve yaklaşık 20 milyar bellek T hücreleri dahil olmak üzere bağışıklık hücreleri, çeşitli tüm kan hacmi 1 'de yaklaşık iki katı sayıda mevcut içerir 2. Verilerin artan vücut deri doku homeostazında sırasında ve çeşitli patolojik durumlarda, hem temel immünolojik fonksiyonu vardır görüşünü desteklemektedir. Normal deride yerleşik bağışıklık hücreleri immüno 3 yapmak için düşünülen ve sedef 4 gibi iltihaplı bozuklukların gelişiminde bir rol oynadığı gösterilmiştir. Psöriatik lezyonlu deride, CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin hem obs vardı sızmışerved ve CD4 ve CD8 oranı hastalığın durumu 5 bağlı olarak değişir gösterilmiştir. Bununla birlikte, hücrelerin bu popülasyonlar, mevcut tekniklerin sadece birkaç hücre yalıtılmasını için çalışma zordur.
İnsan derisinden T hücre izolasyonu için şu anda yaygın olarak kullanılan teknikler enzimatik tedavi ile mekanik cilt ayrışmasını birleştirir. İnsan deri biyopsileri yoğun Tripsin, kolajenaz ve / veya EDTA 6-8 gibi enzimler ile inkübe edilir. Cilt germe kuvvetleri ve mekanik ayrıştırma yüksek dirençli bir bariyer doku olduğu göz önüne alındığında, T hücre izolasyon kurulan yöntemleri bu hücre popülasyonlarının zor ve ex vivo hücre kültürü yapar çok az hücre ve canlı hücrelerin daha düşük sayıda üretilen meydan okuma.
Burada, mechan birleştirerek sağlıklı ve ilgili her iki psoriatik insan cildi lenfositlerin izole edilmesi için bir tadil edilmiş yöntem raporenzimatik sindirim kolajenaz ile birlikte otomatik bir doku Dissociator yerine yoğun kıyma kurulan yöntemi kullanarak deri iCal'ın ayrışma. DH'ler ve T hücrelerini içeren çeşitli canlı immün hücre alt tek bir hücre süspansiyonunun hazırlanması sonra görülmüştür. Önemli yüzey markörlerinin CD3, CD4 ve CD8 salgılanma iyi korunmuştur. Bu şekilde hazırlanan hücreler, ex vivo hücre kültürleri veya akış sitometrik analizinde kullanım için hazırdır. Bu protokol başarıyla sedef hastalarının lezyonlu deride türetilmiş tek cilt biyopsisi (4 mm) analizi için istihdam edilmiştir. Sonuçlar cilt ikamet hasta T hücreleri sağlıklı gönüllülere 9 karşılaştırıldığında IL-17 ve IFNy gibi daha inflamatuar sitokinler üretilen gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: sağlıklı bireylerden deri biyopsileri, bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra elektif plastik cerrahisi geçiren bireylerin karın cilt leftover elde edilmiştir. insan derisinin kullanımı onaylanmış ve oldu Radboud üniversite tıp merkezi, Nijmegen, Hollanda ve Almanya'nın Essen Üniversitesi insan araştırma Tıbbi Etik Komiteleri tarafından belirlenen yönetmeliklere uygun olarak.
İnsan Cilt gelen Tek Hücre süspansiyonları 1. Hazırlık (a Flow-kabinede Çalışma Steril sonraki Hücre Kültürü ise Gerekli)
- Hücre kültürü ortamı hazırlayın: Resim serumu RPMI 1640 + Penisilin / streptomisin (ml nihai konsantrasyonları, 100 ünite / 100 ug / ml) ile + piruvat (0.02 mM) ve Glutamax (0.02 mM) ilave edildi.
- Tüm kültür ortamı hazırlayın: kültür ortamı, adım 1.1 +% 10 insan toplanan serumdan (HPS) hazırlanmıştır; 4 ° C'de saklayın. Bizden önce 20 ° C ± 2 orta getiring.
- Bir 4mm yuvarlak biyopsi yumruk aleti kullanılarak deri biyopsisi elde edilir ve en fazla 4 saat veya 4 ° C AÇIK 20 ° C ± 2 de 1640 tam kültür ortamında saklayın. Laboratuvarda girişte en kısa sürede biyopsi işleyin.
NOT: Derinin uzun depolama hücresi verim ve hücre canlılığı etkileyecektir. - mavi kapaklı ayrışma tüp Etiket ve etiketli tüpe 5 ml tam kültür ortamı ekleyin.
- steril 6 oyuklu kültür plakasının (toplam 3 delikleri şeklinde), her oyuğa tam kültür ortamı içinde 2 ml ilave edilir. böylece üç durulama toplam elde, tek bir kuyunun içine biyopsi yerleştirmek durulayın, ikinci kuyunun onu taşımak ve bu adımı bir kez daha tekrar etmek steril araçlarını kullanın.
- Steril Petri kabı iyi durulanmalıdır deri biyopsisi transfer biyopsi üstünde tam kültür ortamı 100 ul ekleyin ve dikkatlice bir paslanmaz çelik tek kullanımlık steril neşter kullanılarak deri altı yağ dokusu kazıyın.
NOT: Tholan kritik bir adımdır. - Steril bir Petri kabı 4 küçük parçalar halinde her cilt biyopsisi kesin. Aktarım örnekleri (kadar tüp başına 4 mm biyopsi dört) tam kültür ortamı içinde 5 ml ihtiva eden hazırlanan ayrıştırma tüpüne.
- Sıkıca kapaklı tüpler kapatın ve otomatik doku ayrıştırıcı kovanına ters takın. Tüm örnek malzeme rotor bölgede yer olduğundan emin olun.
- "Program m_spleen _01" 56 sn için uygun döner hızında biyopsi ayırmak (birlikte bir program kartına cihazın dahili hafızasında veya tarafından sağlanan önceden tanımlanmış bir program) çalıştırarak ayrılma işlemini başlatın.
- işlendikten sonra, dissociator gelen ayrılma tüpü ayırmak ve tüm ayrışmış madde tüpün dibinde toplanan olduğundan emin olun.
- 37 ° C'de çalkalanan bir su banyosu içerisinde ayrıştırma tüpüne kolajenaz IA (80 mg / ml) ul 150 ilave edin ve örnek inkübe60 dakika ° C. thedissociation tüpüne DNaz I, 100 ul (5 MU / ml) ekleyin, iyice karıştırın.
Not: kolajenaz ya da hücre canlılığında değiştirecek uzun kuluçka süresi yüksek konsantrasyonlarda eklenmiştir. - Otomatik doku ayrıştırıcı kovana ayrışma tüp takın ve Biyopsiyi bir kez daha ayırmak "programı m_ dalak _01" çalıştırın.
- bir 50 ml Falcon tüpü üzerine 70 um naylon hücre süzgecinden yerleştirin. hücre kümeleri / doku enkaz kaldırmak için bu hücre süzgeç ayrışmış örnek malzemeleri uygulamak.
- Tüm kültür ortamı, 5 ml ile bir kez hücre süzgecinden yıkayın. 20 ° 'de santrifüje C ± 2, 10 dakika ve aspirat yüzer 450 x g.
- Yıkama adımı bir kez daha tekrarlayın. tam kültür ortamı içinde 300 ul tekrar süspansiyon hücre peletleri. Tek hücre süspansiyonları daha fazla analiz için hazırdır; ex vivo hücre kültürü için protokollerle devam etme veya akış sitometri analizine.
- Daha fazla i halindentracellular sitokin boyama, 37 ° C de 4 saat PMA (12.5 ng / ml), İyonomisin (500 ng / ml) ve Brefeldine A (5 ug / ml) ve hücreleri uyarır,% 5 CO2 kuluçka akış uygulamadan önce 4 saat sitometri analizi.
Cilt Resident T hücrelerinin 2. Poliklonal Aktivasyon (Ex Vivo Hücre Kültürü)
- Yuvarlak dipli 96 gözlü plaka içine kısım 100 ul tek hücre süspansiyonları, (adım 1.15 hazırlandı).
Not: 4 mm deri biyopsisi her biri için, elde edilen tek hücre süspansiyonları, 96 oyuklu bir plakanın en az iki kuyu ayrılabilir. - anti-CD3 / anti-CD28 mAb ile kaplanmış mikrotaneler (oyuk başına 25,000 boncuk), rekombinant insan sitokin rlL-2 (nihai konsantrasyon 25 U / ml) ve rlL-1β (nihai konsantrasyon 50 ng / ml) eklenir.
- % 5 CO2,% 100 nem, 37 inkübe iyi olarak işaretlenmiş levha kapak kültürü plakası Kapak C inkübatör °. orta renk sarıya döndüğünde orta değiştirin.
3. İlköğretim Sitometrisi Analizi / kültürlü Cilt Resident T hücrelerinin
- PBS +% 0.2 BSA: FACS tampon hazırlayın.
- V-tabanlı 96 oyuklu bir plakaya ilgi hücreleri aktarın. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve aspire yüzer.
- 100 ul PBS içinde pelletini. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve aspire yüzer.
- (: PBS kullanarak 1000 sulandırma 1), 4 ° C'de 30 dakika boyunca sabitlenebilir canlılığı boya konjüge hazırlanmış eFluorescence780 100 ul Leke hücreleri. 20 ° C ± 2, 450 2 dakika boyunca x g ve aspire yüzer FACS tamponu santrifüj 100 ul ekle.
- , Gerekli hücre yüzey markörü mAb seçin örneğin: CD45-BV421 (HI30, 1:20), CD3-ECD (UCHT1, 1:50), CD4-PC5.5 (1388,2, 1: 200), CD8-APC-AlexFluo700 (B9.11, 1: 400), CD14-FITC (TUK4, 1:50), CD19-APC-AlexFluo750 (13-119, 1:50), CD56-PE (MEM-188, 1:50), CD25-PeCy7 (BC96, 1:50), CD11c-PeCy7 (BU15, 1:10) ve CD1c-APC (AD5-8E7, 1:10), test edilen her mAb seyreltme faktörüne göre FACS tamponu kullanılarak mAb-karışım hazırlayın. olmayan leke numunesi ile birlikte antikor izotip kontrolü kullanarak kapı ayarlarını tanımlayın.
- Her kuyuya hazırlanan mAb-karışımının 25 ul ekle. ışıktan korumak, 20 ° C ± 2 20 dakika kuluçkalayın.
- 20 ° C ± 2, 450 2 dakika boyunca x g ve aspire yüzer FACS tamponu santrifüj 100 ul ekle.
- Sadece hücre yüzey boyama gerektiren numuneler için, adım 3.16 ile devam edin.
- hücre içi Foxp3 boyama durumunda:
- seyrelticiler 3 parça ile, konsantratın bir kısım karıştırılarak tespit ve permeabilizasyon tamponu hazırlayın.
- 1x permeabilization tampon hazırlayın: sterilize H 2 O 1 kısım 10x permeabilization tamponu + 9 parça
- fiksasyon ve permeabili 100 ul pelet tekraryon tamponu, iyice karıştırın ve 4 ° C'de inkübe 30 dakika ° C.
- 450 2 dakika boyunca oda sıcaklığında xg, ve aspirat yüzer her şey, santrifüj 100 ul permeabilizasyon tamponu ekleyin.
- permeabilizasyon tamponu bir kez daha hücreleri yıkayın.
- Örnek için gerekli hücre içi mAb seçin, Foxp3-eFluo450 (PCH101, 1:50), IL-17A-AlexFluo488 (eBio64DEC1, 1:50) ve IFNy-PeCy7 (4S.B3, 1: 400). Test edilen her bir mAb seyreltme faktörüne göre% 2 normal sıçan serumu içeren permeabilizasyon tamponu kullanılarak mAb'ler karışım hazırlayın. olmayan leke numunesi ile birlikte antikor izotip kontrolü kullanarak kapı ayarlarını tanımlayın.
- Her kuyuya hazırlanan mAb karışımı 20 ul ekle. 4 inkübe ışıktan korumak, 30 dakika boyunca ° C.
- 30 dakika inkübasyondan sonra, her kuyuya permeabilizasyon tampon 100 ul ilave edin. 20 ° C ± 2, 2 dakika boyunca 450 x g'de santrifüj ve aspire yüzer.
- Permeabilization Buffe hücreleri yıkayınr bir kez daha. microFACS tüpe 110 FACS tampon ul, ve transfer hücre süspansiyonları içinde süspanse pelet.
NOT: Örnek 10 renkli akım sitometri kullanarak ölçüm için hazırdır. - Gerekli olan tam hücre sayısı halinde hemen akış sitometrisi kullanılarak ölçümler önce her numune içine florosferlerin iyi karıştırılmış düzgün süspansiyonu 10 ul ekle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada sunulan protokol, tek bir 4 mm deri biyopsisi kullanırken 760 ± 178.000 kadar 615 (± SEM, sağlıklı gönüllülerin cilt demek) ± 2.200 arasında insan derisinden canlı lenfositler (± SEM, sedef hastalarının lezyonlu deriye ortalama) verecektir.
CD45 + hücrelerinin farklı CD4 + T hücreleri (~% 45), CD8 + T hücreleri (% 30) da dahil olmak üzere, sağlıklı bireylerin derisinden türetilen tek hücre süspansiyonları olarak tanımlanır ve CD11c + DH'ler (yaklaşık% 5 bulundu ), birkaç B hücreleri (CD19 +), NK hücreleri (CD56 +, CD3 ise -) veya monosit / makrofajlar (CD14 + veya CD1c +) gözlendi (Şekil 1A). Yöntem, insan deri biyopsilerinde CD4 + CD25 + Foxp3 + hücrelerinin analizi sağlar. sabitlemek ve geçirgenliği sonrası hücre içi boyama kullanılarak, transkripsiyon FAC ekspresyonunu göstermek mümkündürCD25 + T hücrelerinin tor Foxp3 (Şekil 1A).
insan derisi biyopsilerin türetilen tek hücre süspansiyonları, (veriler gösterilmemiştir) FL1 (FITC), FL2 (PE), FL3 (ECD) FL9 (Pasifik mavi) ve FL10 (krom portakal), bir Sitometreyi kullanarak kanal yüksek bir otofloresan arka planı oldukça gösterdiğinden . Lenfosit popülasyonunun doğru analizi için, biz bu nedenle lenfosit nüfus ve autofluorescent hücre popülasyonu (Şekil 1B) dışlanması yolluk için Parlak Violet 421 florokromla konjuge anti-insan CD45 mAb kullanılmasını öneriyoruz. Insan derisi yerleşik hücrelerin çoğunluğu CD3 + T hücreleri (Şekil 1 C) idi. Hücre canlılığı, analiz için ölü / ölmekte olan hücre (Şekil 1C) arasında uygulanabilir ayırt etmek için bir tamir edilebilir canlılığı boya kullanılması tavsiye edilir. 7.7 (Ortalama ± SD) canlı hücreler ± 65.3% olarak genellikle bu protokol sonuçları. veri akış sitometre daha fazla analiz için, ADVIS olduğuölü ya da ölmekte olan hücrelerin beri canlı hücre nüfus kapı, ed kendi hücre membran bütünlüğünü kaybeder ve non-spesifik böylece arka plan boyama artan konjuge antikor bağlayabilirsiniz.
Bu protokol ile izole edilmiş T hücreleri, fonksiyonel analiz için son derece uygundur. Sedef hastalarının lezyonlardan tek 4 mm biyopsi kullanılarak, biyopsisi alınan T-hücreleri, brefeldin A varlığında, PMA / ionomisin ile uyarma 4 saat (Şekil 2), aşağıdaki, IL-17A ve IFNy ürettiği gösterilmiştir.
Dahil Psoryatik deri lezyonları taze hazırlanmış tek hücreli cilt süspansiyonlar ayrıca ex vivo hücre kültüründe ve daha sonra fonksiyonel analiz için de kullanılabilir. Pro-inflamatuar sitokinler, IL-1β veya IL-23 8 gün mevcudiyetinde, anti-CD3 / anti-CD28 mAb ile kaplanmış mikro-poliklonal stimülasyon sonrasında Genişletmenin ardından, hücreler örneğin, kendi cytok için analiz edilebilirine kapasitesi (Şekil 3) üretir. Bu şekilde, sağlıklı ve Psoriasis derisinden türetilen hücrelerin sitokin üretimi potansiyeli arasında açık bir fark gözlenmiştir. psoriatik bulunan bireylerden alınan T hücrelerinin sedef ilişkili sitokinler IL17A ve IFNy üretimi için çok daha yüksek bir kapasite göstermiştir. Bu durum, ex vivo kültür sonra prototipik sedef sitokin fenotipi yoktur sağlıklı kontrol durumunda muhafaza edilmesi anlamına gelir.
Şekil 1:. Lökositlerin farklı tipleri metinde tarif edilen protokol kullanılarak izole sağlıklı bireylerin Cilt yerleşik lenfositlerin derisinden türetilen tek hücre süspansiyonları olarak tanımlanır ilgi artı tamir edilebilir canlılığı, boyanın florokrom-konjuge mAb'ler ile boyanmış ve hemen analiz edildi akım sitometri. (A) Akış cyCD4 +, CD8 + ve CD25 + Foxp3 Cilt yerleşik lenfositler içinde + alt - monositler (CD14), DCler (CD11c), B hücreleri (CD19), NK hücreleri (CD56 +, CD3) arasında tometric tespiti. Anti-insan CD45 / BV421 mAb otofloresan hücrelerinden lenfositleri ayırır. CD45 + hücreleri için kullanılan yolluk stratejileri (B) 'de gösterilmektedir. Izole edildikten sonra uygun bir CD45 +, CD3 + T hücreleri (C) yüzdesi. Sayı pozitif hücrelerin yüzdesini gösterir. Üç farklı deneyler / donör dışında bir temsilci deney gösterilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: sedef hastalarının lezyonlu deride türetilen T hücreleri süredence, IL-17A ve IFNy. Tek bir 4 mm deri biyopsisi ağızdan üzerine sedef hastanın lezyonlu deride alınan veya bilimsel kullanım için bilgilendirilmiş onam yazılmıştır. Cilt yerleşik T hücreleri metinde tarif edilen protokol kullanılarak izole edilmiştir. Cilt ikamet T hücreleri tarafından IL-17A ve IFNy üretimi. Brefeldin A varlığında, PMA / ionomisin ile 4 saat uyarılmasına tepki olarak sitokinlerin hücre içinde birikmesine akış sitometresi ile ölçüldü. sitokin-pozitif hücrelerin yüzdesi gösterilmektedir. Üç farklı hastanın verileri gösterilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Cilt yerleşik T hücreleri, IL-17A ve IFNy aşağıdaki ex vivo üretme yeteneğine sahiptir
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, verimli insan derisi biyopsi cilt yerleşik T hücrelerini izole etmek için bir protokol mevcut. Bu protokolün avantajı canlı lenfositlerinin nispeten yüksek sayılar izolasyon ve ilgili yüzey belirteçlerinin ifade. Belirlenen hücre alt edildi: CD11c + DH'ler, CD4 + ve CD8 + T hücreleri ve Foxp3 + CD25 + hücreleri. Önemli olarak, izole edilmiş bir cilt yerleşik T hücrelerinin ex vivo kültür çok iyi uygulanabilir ve daha sonra fonksiyonel analiz için bırakıldı.
İnsan deri dokuları yapısal bütünlüğünü korumak için işlev dışı yapışma proteinlerine ait enzimatik bozulmaya mekanik ayrışmayı birleştirerek tek hücre süspansiyonları olarak ayrışmış edilebilir. epidermis ve dermis dispase bazlı tabaka ayrışması bu söz konusu cilt katmanlarında hücre infiltrasyonu belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olmasına rağmen, biz dispase tedavi t led farked CD25 ve CD27 hücre yüzey ifadesi büyük bir azalma (gösterilmemiştir). Bu belirteçler lenfosit alt kümelerini karakterize etmek için önemli olduğu gibi, biz dispase tedavi etkiler sonraki immünofenotıpleme inanıyoruz. Dakikada, T hücresi sayıları epidermis 10 içinde mevcut ise dermiş uzaklaştırılması T hücrelerinin büyük bir çoğunluğu dermis lokalize sağlıklı bireylerin deride, çünkü CD25 veya CD27 ifade eden hücrelerde gözlendi azaltılması için sorumlu olduğu olası değildir -12. İzole keratinositlerin çoğalması kapasitesine dispase zararlı etkisi daha önce 13 bildirilmiştir. hücre fonksiyonu çalışmanın amacı ise, bu nedenle, dispase ihtiyatlı kullanılması garanti edilir. Bizim protokolde biz deri biyopsisi tek hücre süspansiyonu elde etmek kollajenaz türünü kullanarak edilmiştir. Kollajenaz I kollajenaz IV ile karşılaştırıldığında yüksek triptik aktiviteye sahiptir ve dolayısıyla daha sert olmasına rağmen te olmuştur, çünkü biz bu özel kollajenaz seçmişHücre kültürü için uygunluğu açısından sted. Hücre kültürü için uygun olan bir kollajenaz IV kullanımı ayrıca mevcut protokol optimize etmek için sonraki bir adımda olabilir.
Niteliği gereği, cilt germe kuvvetleri ve mekanik ayrıştırma karşı oldukça dirençlidir. Şimdiye kadar, insan derisinde bağışıklık hücrelerinin kapsamlı bir analiz nispeten sert sindirim protokolleri kullanırken yeterli hücre sayıları elde teknik zorlukları engel olmuştur. Sonuç olarak, bugüne kadar yayınlanmış çalışmaların çoğu immünohistokimyasal analizler güveniyor. Deri biyopsilerinin CD4 + T hücrelerinin doğrudan izolasyonu için hantal olarak kabul edilir. Alternatif cilt eksplant kullanımı kültürleri 10 üzerinden tarama olacaktır. Bununla birlikte, bu kültür 2-3 hafta alır ve cilt eksplant kültür ortamı spesifik T hücre alt takım tercih edilen tarama yol açabilecek sitokinler ve kemokinlerin seçilen bir dizi ihtiva etmektedir. Buna ek olarak, kültür süresi affec olabilirHücrelerin fenotip t. Geçerli protokol fenotipik ve doğrudan izolasyon sonra T hücre popülasyonlarının fonksiyonel çalışma hem etkinleştirme eklenen sitokinler ya da kemokinler ve CD4 (ve aynı zamanda diğer hücre belirteçleri) ifadesi de izolasyon sonra korunmuş kullanılmasını yapmaz.
Bir ticari olarak temin edilebilen otomatik bir doku ayıracı bozulması hücre dışı matris için gerekli kolajenaz ile kuluçkada bekletildi, deri parçalarının ayrılması için kullanılmıştır. ekstrasellüler matriksin hücreleri sonraki serbest bırakılması için, otomatik ayıracı yeniden kullanılır. Cildin geniş manuel kesme (veriler gösterilmemiştir) benzer hücre sayıları elde rağmen, sonuçlar daha az tutarlı ve sanatçının deneyimi daha bağımlıdır. cihaz tarafından sunulan önceden belirlenmiş bir prosedür kullanılarak derinin ayrışma daha tekrarlanabilir sonuçlar verecek. Bu cilt gösteren çalışmalar ile uyumlu çeşitli l içeriyoreukocytes 2,14, CD11c + DH'ler, CD8 + ve CD4 + T hücreleri alt takımlarının ve Foxp3 + hücreleri Burada sunulan protokol ile hazırlanan tek hücre popülasyonlarında gözlenmiştir. Önemli olarak, protokol uygulanabilir lenfositlerin nispeten yüksek bir verim elde edilir. Nedeniyle protokolün verimliliği, sadece tek bir 4 mm deri biyopsisi elde edilebilir sık sık hasta malzeme, özellikle yararlıdır okuyan zaman. Yöntemi kullanarak, biz sedef hastalarının lezyonlu derisinden izole edilen T hücrelerinin sağlıklı bir cilt 9 ile karşılaştırıldığında, IL-17A ve IFNy üretmek için yüksek kapasite gösterdi göstermek başardık.
Araştırma, söz bağlı olarak, bundan başka, tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması sonra belirli hücre alt saflaştırmak için gerekli olabilir. Bu durumda, deri daha büyük parçaları alt analiz için yeterli hücrelerin verimini sağlamak için kullanılabilir. Bunu yaparken cildin daha küçük pi oyulmuş gerektiğini, emin olunizolasyon protokolü başlamadan önce x 2 mm yaklaşık 2 mm eces.
Sonuç olarak, bu protokol, böylece deri immün yanıtlarda eden bilgi iyileştirilmesi, tek hücre düzeyinde anlamlı fenotipik ve fonksiyonel olarak çözümlenmesini kolaylaştıran, deri yerleşik hücreleri izole etmek için geliştirilmiş bir yol sunar.
bir ayrıştırma tüpüne birden fazla biyopsi işleme, özellikle mevcut protokol kritik adım deri altı yağ dokusu doğru kaldırılması ve küçük parçalar halinde deri kesimi vardır. Yağ dokusu ve / veya büyük doku parçaları ayıracı yeniden çalışır soran düzgün çalışmamasına neden olur. Bu ciddi bir hücre canlılığı zarar verecektir. tekniğin sınırlama tek 4 mm deri biyopsisinden türetilmiş hücre sayısı hücrelerin alt kümelerinin daha sonra izolasyonu için yeterli olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Sedef hastalarının deri biyopsileri nazik Dr. Andreas Koerber bilimsel kullanım için yazılı veya sözlü aydınlatılmış onam sonra (Essen, Almanya Üniversitesi Dermatoloji bölümü) tarafından verilmiştir.
XH da NSFC 61263039 ve NSFC 11101321 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1,000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
- Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
- Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
- Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
- Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
- Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
- Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
- He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
- Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
- Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
- Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
- Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
- Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).
