Мы описываем протокол для эффективного выделения резидентных Т-клеток кожи из биопсии кожи человека. Этот протокол позволяет получить достаточное количество жизнеспособных резидентных лимфоцитов кожи человека для проточного цитометрического анализа и культивирования ex vivo.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Человеческой кожи имеет важную барьерную функцию, и содержит различные иммунные клетки, которые вносят вклад в гомеостаз ткани и защиты от патогенных микроорганизмов. Поскольку кожа является относительно легко получить доступ, он обеспечивает идеальную платформу для изучения периферические механизмы иммунных регуляторных. Иммунные клетки резидентные у здоровых поведения кожи иммунологического, но и играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз. Несмотря на возникающие идеи, наше понимание биологии, лежащей в основе различных воспалительных заболеваний кожи по-прежнему ограничено. Существует необходимость для хорошего качества населения (одиночный) клеток, выделенных из образцов биопсии кожи. До сих пор процедуры изоляции были серьезно затруднена из-за отсутствия получения достаточного количества жизнеспособных клеток. Выделение и последующий анализ также пострадали от потери иммунных маркеров клеточной линии дифференцировки, из-за механического и химического стресса, вызванного существующими процедурами диссоциации, чтобы получитьодноклеточной суспензии. Здесь мы опишем модифицированный метод для выделения Т-клеток от обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем сочетания механической диссоциации кожи с использованием автоматизированной диссоциатор тканей и лечения коллагеназы. Эта методика сохраняет экспрессию большинства маркеров иммунной линии дифференцировки, таких как CD4, CD8, Foxp3 и CD11c при приготовлении одноклеточных суспензий. Примеры успешного выделения клеток CD4 + T и последующего фенотипических и функционального анализа показаны.
Введение
Кожа, в качестве основного интерфейса между телом и окружающей средой, обеспечивает первую линию защиты от внешних физических, химических и биологических оскорблений, таких как язву ультрафиолетового излучения и микроорганизмов. Кожа состоит из двух основных отделения, эпидермис и дерму, и содержит множество иммунных клеток , включая клетки Лангерганса, макрофаги, дендритные клетки (ДК) и около 20 миллиардов Т - клеток памяти, почти в два раза больше числа присутствующих во всем объеме крови 1 , 2. Все больше данных поддерживает идею о том, что кожа имеет существенные иммунологические функции, как во время гомеостаза тканей и при различных патологических с....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Примечание: биопсию кожи у здоровых индивидуумов были получены из брюшной кожи пережиток лиц, перенесших плановое пластическую операцию после устного или письменного информированного согласия для научного использования. Использование человеческой кожи был утвержден и в соответствии с правилами, установленными Медицинским этическими комитетами для человеческого исследования в медицинском центре университета Radboud, Неймеген, Нидерланды и Университет Эссен, Германия.
1. Подготовка одноклеточных суспензий из человеческой кожи (работа стерильного в потоке-кабинете, если последующее Культура клеток требуется)
- Готовят среду для куль....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Протокол, представленные здесь, даст между 2200 ± 615 (среднее значение ± SEM, кожа здоровых добровольцев) до 178000 ± 760 (среднее значение ± SEM, пораженной кожи пациентов, страдающих псориазом) жизнеспособных лимфоцитов из кожи человека при использовании одного 4 мм биопсии кожи.
Различные типы CD45 + клеток , были идентифицированы в одноклеточных суспензий , полученных из кожи здоровых лиц , включая CD4 + T-клеток (около 45%), CD8 + Т-клетки (~ 30%), и CD.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы приводим протокол, чтобы эффективно изолировать резидентные кожи Т-клеток из биопсий кожи человека. Преимуществом этого протокола является выделение относительно большого числа жизнеспособных лимфоцитов, экспрессирующих и соответствующие поверхностные маркеры. Подмножества клеток были идентифицированы: CD11c + DCs, клетки CD4 + и CD8 + Т - клетки и Foxp3 + CD25 +. Важно отметить, что экс естественных условиях культуры изолированных резидентов кожи .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
биопсии кожи у пациентов с псориазом были любезно предоставлены доктором Андреасом Koerber (дерматологии отдела в Университете г. Эссен, Германия) после устного или письменного информированного согласия для научного использования.
XH также поддерживается NSFC 61263039 и 11101321 NSFC.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Одноразовый биопсийный перфоратор | Kai Europe | BP-40F | 4 мм |
| Одноразовые стерильные скальпели | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Синий колпачок, используется как диссоциационная трубка. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Автоматизированный тканевый диссоциатор. Использование «программы spleen_01» для диссоциации биопсии кожи. |
| Сетчатый фильтр для ячеек | BD | 352350 | 70 & микро; m нейлоновая |
| 96-луночная U-образная нижняя пластина | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Пируват натрия | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Пенициллин/стрептомицин | Life Technologies | 15140-122 | |
| Человек Объединенная сыворотка (HPS) | собственного приготовления | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, подходит для клеточной культуры |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Корректируемая жизнеспособность красителя (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Окрашивание мертвых клеток перед фиксацией клеток; разбавление PBS в соотношении 1:1,000 |
| Концентрат фиксации/пермеабилизации | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Разбавитель фиксации/пермеабилизации | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Буфер для пермеабилизации (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Мышиный античеловеческий CD45 | BD | 563879 | клон: HI30; фактор разведения 1:50 |
| FITC Мышь античеловеческий CD14 | Dako | T0844 | Клон: TUK4; фактор разведения 1:50 |
| PE Мышь античеловеческий CD56 | Dako | R7127 | Клон: MOC-1; фактор разведения 1:50 |
| ECD Мышь античеловеческий CD3 | Beckman - Coulter | A07748 | Клон: UCHT1; коэффициент разведения 1:50 для поверхностного окрашивания; коэффициент разведения 1:25 для внутриклеточного окрашивания. |
| PC5.5 Мышиный античеловеческий CD4 | Beckman - Coulter | B16491 | Клон: 13B8.2; коэффициент разведения 1:200 |
| PeCy7 Мышиный античеловеческий CD11c | Beckman - Coulter | A80249 | Клон: BU15; фактор разведения 1:50 |
| APC Мышиный античеловеческий CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Клон: AD5-8E7; коэффициент разбавления 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Мышиный античеловеческий CD8 | Beckman - Coulter | A66332 | Клон: B9.11; коэффициент разведения 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Мышь против человека CD19 | Beckman - Coulter | A94681 | Клон: J3-119; фактор разведения 1:50 |
| PeCy7 Мышь против человека CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Клон: BC96; коэффициент разведения 1:50 |
| PE Крыса античеловеческий CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | клон: HECA-452; фактор разведения 1: |
| eFluo450 Крыса против человека Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Клон: PCH101; внутриклеточное окрашивание; фактор разведения 1:50 |
| AlexFluo488 Мышь против человека IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Клон: eBio64DEC17; внутриклеточное окрашивание; фактор разведения 1:50 |
| PeCy7 Мышь против человека IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Клон: 4S. В3; внутриклеточное окрашивание; коэффициент разбавления 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman - | Coulter 7547053 | Счетные шарики, для проточной цитометрии |
Ссылки
- Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
- Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
