Summary

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em> Ex Vivo</em> Культура клеток

Published: April 08, 2016
doi:

Summary

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Abstract

Человеческой кожи имеет важную барьерную функцию, и содержит различные иммунные клетки, которые вносят вклад в гомеостаз ткани и защиты от патогенных микроорганизмов. Поскольку кожа является относительно легко получить доступ, он обеспечивает идеальную платформу для изучения периферические механизмы иммунных регуляторных. Иммунные клетки резидентные у здоровых поведения кожи иммунологического, но и играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний кожи, таких как псориаз. Несмотря на возникающие идеи, наше понимание биологии, лежащей в основе различных воспалительных заболеваний кожи по-прежнему ограничено. Существует необходимость для хорошего качества населения (одиночный) клеток, выделенных из образцов биопсии кожи. До сих пор процедуры изоляции были серьезно затруднена из-за отсутствия получения достаточного количества жизнеспособных клеток. Выделение и последующий анализ также пострадали от потери иммунных маркеров клеточной линии дифференцировки, из-за механического и химического стресса, вызванного существующими процедурами диссоциации, чтобы получитьодноклеточной суспензии. Здесь мы опишем модифицированный метод для выделения Т-клеток от обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем сочетания механической диссоциации кожи с использованием автоматизированной диссоциатор тканей и лечения коллагеназы. Эта методика сохраняет экспрессию большинства маркеров иммунной линии дифференцировки, таких как CD4, CD8, Foxp3 и CD11c при приготовлении одноклеточных суспензий. Примеры успешного выделения клеток CD4 + T и последующего фенотипических и функционального анализа показаны.

Introduction

Кожа, в качестве основного интерфейса между телом и окружающей средой, обеспечивает первую линию защиты от внешних физических, химических и биологических оскорблений, таких как язву ультрафиолетового излучения и микроорганизмов. Кожа состоит из двух основных отделения, эпидермис и дерму, и содержит множество иммунных клеток , включая клетки Лангерганса, макрофаги, дендритные клетки (ДК) и около 20 миллиардов Т – клеток памяти, почти в два раза больше числа присутствующих во всем объеме крови 1 , 2. Все больше данных поддерживает идею о том, что кожа имеет существенные иммунологические функции, как во время гомеостаза тканей и при различных патологических состояниях. Иммунные клетки резидентные в нормальной коже , как полагают, проводят иммунологического 3 и было показано, играют важную роль в развитии воспалительных заболеваний , таких как псориаз 4. В псориатической пораженной кожи, и CD4 + и CD8 + Т – клетки проникали были наблerved и показано , что отношение CD4 и CD8 варьирует в зависимости от состояния заболевания 5. Тем не менее, эти популяции клеток трудно изучать, так как существующие методы позволяют изолировать только несколько клеток.

В настоящее время широко используются методы для выделения Т-клеток из человеческой кожи сочетают механическую диссоциацию кожи с ферментативной обработкой. Биопсий кожи человека широко фарша и инкубировали с ферментами , такими как трипсин, коллагеназа и / или ЭДТА 6-8. Принимая во внимание , что кожа является барьером ткани , которая обладает высокой устойчивостью к растягивающих сил и механической дезагрегации, установленные методы выделения Т – клеток получают очень мало клеток, и даже более низкие количества жизнеспособных клеток, что делает ех Vivo культуры клеток этих клеточных популяций трудно и испытывающий.

Здесь мы сообщаем модифицированный метод для выделения лимфоцитов из обоих здоровых и привлеченным псориатический кожи человека путем объединения Mechanскую диссоциация кожи с использованием автоматизированной диссоциатор ткани вместо установленного метода широко мясорубки вместе с ферментативное расщепление с помощью коллагеназы. Различные жизнеспособные подмножества иммунных клеток, включая контроллеры домена и Т-клетки наблюдались после приготовления одной клеточной суспензии. Важно, что экспрессия поверхностных маркеров CD3, CD4 и CD8 хорошо сохранился. Клетки , полученные таким способом, будут готовы к использованию в бывших клеточных культурах или естественных условиях анализа проточной цитометрии. Этот протокол был успешно применен для анализа единичных биоптатах кожи (4 мм), полученные из повреждений кожи у пациентов с псориазом. Результаты показали , что кожа пациента житель Т – клетки получают более провоспалительных цитокинов , таких как IL-17 и IFN & gamma ; по сравнению со здоровыми добровольцами 9.

Protocol

Примечание: биопсию кожи у здоровых индивидуумов были получены из брюшной кожи пережиток лиц, перенесших плановое пластическую операцию после устного или письменного информированного согласия для научного использования. Использование человеческой кожи был утвержден и в соответств?…

Representative Results

Протокол, представленные здесь, даст между 2200 ± 615 (среднее значение ± SEM, кожа здоровых добровольцев) до 178000 ± 760 (среднее значение ± SEM, пораженной кожи пациентов, страдающих псориазом) жизнеспособных лимфоцитов из кожи человека при использовании одного 4 мм биопсии кожи. ?…

Discussion

Здесь мы приводим протокол, чтобы эффективно изолировать резидентные кожи Т-клеток из биопсий кожи человека. Преимуществом этого протокола является выделение относительно большого числа жизнеспособных лимфоцитов, экспрессирующих и соответствующие поверхностные маркеры. Подмножес?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

биопсии кожи у пациентов с псориазом были любезно предоставлены доктором Андреасом Koerber (дерматологии отдела в Университете г. Эссен, Германия) после устного или письменного информированного согласия для научного использования.

XH также поддерживается NSFC 61263039 и 11101321 NSFC.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Disposable Biopsy Punch Kai Europe BP-40F 4 mm
Disposable sterile scalpels Dalhausen 1100000510
gentleMACS C tube Miltenyi Biotech 130-093-237 Blue-capped, used as the dissociation tube.
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235 Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy.
Cell strainer  BD 352350 70 µm nylon
96-well U-bottom plate Greiner Bio-One 650180
RPMI 1640 Life Technologies 22409-015
Sodium pyruvate Life Technologies 11360-039
GlutaMAX Life Technologies 35050-061
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15140-122
Human Pooled Serum (HPS) in house prepared
Collagenase I Sigma-Aldrich C2674 Type 1-A, suitable for cell culture
DNase I Calbiochem 260913
PBS B Braun 3623140
BSA Sigma-Aldrich A4503-500G
Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 eBioscience 65-0865-18 Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000
Fixation/Permeabilization Concentrate eBioscience 00-5123-43
Fixation/Permeabilization Diluent eBioscience 00-5223-56
Permeabilization Buffer (10x) eBioscience 00-8333-56
BV421 Mouse anti-human CD45 BD 563879 Clone: HI30; dilution factor 1:50
FITC Mouse anti-human CD14 Dako T0844 Clone: TUK4; dilution factor 1:50
PE Mouse anti-human CD56 Dako R7127 Clone: MOC-1; dilution factor 1:50
ECD Mouse anti-human CD3 Beckman – Coulter A07748 Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining.
PC5.5 Mouse anti-human CD4 Beckman – Coulter B16491 Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200
PeCy7 Mouse anti-human CD11c Beckman – Coulter A80249 Clone: BU15; dilution factor 1:50
APC Mouse anti-human CD1c Miltenyi Biotech 130-090-903 Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10
APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 Beckman – Coulter A66332 Clone: B9.11; dilution factor 1:400
APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 Beckman – Coulter A94681 Clone: J3-119; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human CD25 eBioscience AD5-8E7 Clone: BC96; dilution factor 1:50
 PE Rat anti-human CLA Miltenyi Biotech 130-091-635 clone: HECA-452; dilution factor 1:
eFluo450 Rat anti-human Foxp3 eBIoscience 48-4776-42 Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50
AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A eBioscience 53-7179-42 Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50
PeCy7 Mouse anti-human IFNg eBioscience 25-7319-41 Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400
Flow-Count Fluorospheres Beckman – Coulter 7547053 Counting beads, for flow cytometry

References

  1. Clark, R. A., et al. The vast majority of CLA+ T cells are resident in normal skin. J Immunol. 176, 4431-4439 (2006).
  2. Zaba, L. C., Fuentes-Duculan, J., Steinman, R. M., Krueger, J. G., Lowes, M. A. Normal human dermis contains distinct populations of CD11c+BDCA-1+ dendritic cells and CD163+FXIIIA+ macrophages. J Clin Invest. 117, 2517-2525 (2007).
  3. Gebhardt, T., et al. Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus. Nature Immunol. 10, 524-530 (2009).
  4. Boyman, O., et al. Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha. J Exp Med. 199, 731-736 (2004).
  5. Christophers, E., Mrowietz, U. The inflammatory infiltrate in psoriasis. Clin Dermatol. 13, 131-135 (1995).
  6. Jiang, X., et al. Skin infection generates non-migratory memory CD8+ T(RM) cells providing global skin immunity. Nature. 483, 227-231 (2012).
  7. Havran, W. L., et al. Limited diversity of T-cell receptor gamma-chain expression of murine Thy-1+ dendritic epidermal cells revealed by V gamma 3-specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci U S A. 86, 4185-4189 (1989).
  8. Campbell, J. J., et al. CCR7 expression and memory T cell diversity in humans. J Immunol. 166, 877-884 (2001).
  9. He, X., et al. Targeting PKC in human T cells using sotrastaurin (AEB071) preserves regulatory T cells and prevents IL-17 production. J Invest Dermatol. 134, 975-983 (2014).
  10. Clark, R. A., et al. A novel method for the isolation of skin resident T cells from normal and diseased human skin. J Invest Dermatol. 126, 1059-1070 (2006).
  11. Clark, R. A., Kupper, T. S. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 109, 194-202 (2007).
  12. Keijsers, R. R., et al. In vivo induction of cutaneous inflammation results in the accumulation of extracellular trap-forming neutrophils expressing RORgammat and IL-17. J Invest Dermatol. 134, 1276-1284 (2014).
  13. Hybbinette, S., Bostrom, M., Lindberg, K. Enzymatic dissociation of keratinocytes from human skin biopsies for in vitro cell propagation. Experimental dermatology. 8, 30-38 (1999).
  14. Hennino, A., et al. Skin-infiltrating CD8+ T cells initiate atopic dermatitis lesions. J Immunol. 178, 5571-5577 (2007).

Play Video

Cite This Article
He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture. J. Vis. Exp. (110), e52564, doi:10.3791/52564 (2016).

View Video