마우스 모델에서 조직 공학 혈관의 생성 및 손톱 확장
Summary
여기, 우리는 두 번 시드를 부분적으로 유도 만능 줄기 세포로 쥐에 이식을위한 기능적인 조직 설계 혈관 이식을 생성하는 프로토콜을 제시 (PiPSC은) – 탈세 포화 선박 발판 생물 반응기에서 유래 내피 세포 – 평활근 세포 및 PiPSC 산출했다.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
혈관 도관의 건설은 심혈관 질환으로 인한 손상 및 손상된 혈관의 수술 수리에 대한 기본적인 전략이다. , 동종 이식,자가 조직 (심낭 또는 복재 정맥)과 이종 이식 1, 현재까지 수술에 사용 된 이식 재료는 생체 적합성 합성 고분자 ([고어 텍스의 ePTFE] 또는 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 [쿠론] 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 [테플론, 확장 된 폴리 테트라 플루오로 에틸렌)을 포함한다. 인공 이식 (예를 들어 고어 텍스 쿠론)이 가장 일반적으로 사용되는 반면, 이러한 재료 가능성 협착증, 칼슘 증착, 혈전 색전 감염을 포함 수많은 장단기 합병증을 일으킨다. 와 현재 생물학적 이식 환자는 혈전 색전증 감소하지만, 그들은 여전히 석회화 열화이 때문에 차 이식 실패 및 단축 내구성으로 제한을 발생합니다. 따라서, 수술 t을 크게 향상에도 불구하고년, 연구자와 임상의를 통해 echniques 여전히 혈관 질환을위한 이상적인 도관을 식별의 필요성 부담한다. 더 최근에, 혈관 조직 공학의 연구 분야는 세포를 성공적 래프팅 1 기능성 용기 전형 생체 모방 환경을 만들 목적으로, 생분해 성 지지체에 혼입되어있는 개념을 생성하고있다. 기본적으로 혈관 구조의 성공은 세 가지 필수 구성 요소에 따라 달라집니다; 즉, 발판, 내피 세포 내층 및 평활근 세포 층, 네이티브 맥관계에 필적 기계적 특성을 제공하기 위해 적절한 세포 외 기질을 함유하는 지지체, 및 / 조절을 개시에 필요한 세포 / 분자 시그널링을 포함 셀 수리.
장기 이식 개통과 신 조직의 지속적인 개발, 제 비계의 효과적인 세포 파종에 크게 의존ereby 매우 중요한 세포 유형의 결정을 렌더링. 몇몇 보고서 소경 도관 3-6 개발 성숙한 내피 다양한 소스로부터 평활근 세포의 사용을 입증한다. 유망하지만, 충분한자가 혈관 내피 부족 성숙한 평활근 세포가 상당한 부담으로 작용 얻었다. 최근에, 다양한 소스로부터의 줄기 세포는 혈관 조직 공학 어플리케이션에 이용되어왔다. 실제로, 배아 줄기 세포 (7)를 포함한 줄기 세포 다양한 종류의 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, 골수 유래 단핵구 (12), 중간 엽 줄기 세포 (13), 혈관 내피 전구 세포 및 성숙한 혈관벽 줄기 세포 유래 한 항원 SCA (-1) + (14, 15)이 정의 된 모든 미디어에 응답 내피 기능 중 하나 또는 평활근 세포로 분화 할 수있는 것으로 입증되었다 줄기 / 선조 세포 및배양 조건. 또한, 줄기 세포의 무제한 자기 갱신 용량은 그들 만 성숙한 내피 성장 정지 및 노화를 진행하기 전에 한정된 횟수 위해 나눌 수 평활근 세포와 달리 더 나은 후보를 만든다.
그 래프팅은 생체 적합성, 생체 역학적 특성 및 생분해 속도 등 여러 가지 요인에 따라 달라위한 골격 물질의 선택은 성공적인 조직 공학적 용기를 생성한다. 기본적으로, 물질은 생분해해야 이식을위한 발판을 만드는 데 사용하고 불필요한받는 사람 면역 반응을 탑재되지 않습니다. 또한, 세포 부착과 이후의 생존에 적합한 기공 및 미세을 포함해야합니다. 현재까지, 혈관 조직 공학에서 사용되는 지지체 가장 일반적인 재료는 폴리 글리콜 산, 폴리 락트산, 폴리 카프로 락톤 ε (16)의 중합체를 포함한다. 최근 탈세 포화 된 생물학적 물질은 할또한 일부 성공을 적용. 여러 실험실자가 세포와 탈세 포화 인간, 개 또는 돼지의 혈관을 뿌리는 것은 응고 내막 증식증 17-19 저항 생물학적 이식을 한 것으로 나타났습니다. 혈관 조직 공학의 다른 전략은 비계 지원 (20), (21)없이 예를 들어, 세포 외 기질 단백질 기반의 혈관 이식, 섬유소 젤 (13)에 파종 세포 생성 세포 시트를 포함한다.
현재의 프로토콜 기능 내피 세포와 평활근 세포, 중증 합병 면역 결핍증에 조직 공학 혈관의 기능 PiPSC 유래 혈관 세포를 항구 탈세 포화 된 혈관 지지체로 구성된 생물 반응기 및 이식의 세대 (SCID에 인간 PiPSC의 분화를 보여줍니다 ) 마우스. PiPSC이 세포는 쥐에서 종양을 형성 윤리적 제기하지 않기 때문에 혈관 이식의 조직 공학에 사용할 최적의 세포 유형이며,동종 면역 반응. 더욱이, 우리는 핍 내피 세포 및 핍 – 평활근 세포를 생성하기위한 전략이 효율적인 10,11 재현임을 보여 주었다. 그 후, 우리는 따라서 이식과 생존 효능을 향상 밀접하게 네이티브 용기 내에 존재하는 기질 단백질을 모방하는 PiPSC 유래 혈관 세포의 파종을위한 탈세 포화 된 선박을 설계했습니다. 또한, 종래 PiPSC 뿌리기에 용기의 탈세 포화가 대 식세포 등의 면역 세포 유형에 의해 마운트 염증 반응의 발생을 방지한다. 더 중요한 것은,이 프로토콜은 단지 인간 번역에 대한 혈관 도관 유망 생성하는 방법을 나타내지 않는, 또한 연구 및 마우스 모델을 통해 혈관 조직 재생을 제어하는 분자 메커니즘을 이해 귀중한 수단을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 기능적 조직 공학 혈관 PiPSC 인간 섬유 아세포를 사용하여 생성 될 수있는 사운드, 빠르고, 단순하고 재현성 효율적인 전략을 나타낸다. 이 기술은 가까운 미래의 재생 의학, 조직 공학 및 잠재적 환자 맞춤형 세포 치료를위한 유용한 도구를 나타냅니다. 프로토콜의 효능을 보장하는 중요한 단계는 혈관 생물 반응기에서 PiPSC의 준비, 멸균 완전히 탈세 포화 대동맥 이식, 발판에 PiP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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