Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón
Summary
A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) – deriva células musculares lisas y PIPSC – células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
La construcción de conductos vasculares es una estrategia fundamental para la reparación quirúrgica de los vasos dañados y heridos resultantes de enfermedades cardiovasculares. Hasta la fecha, los materiales utilizados en la cirugía de injerto biocompatible incluyen polímeros sintéticos (politetrafluoroetileno [teflón], politetrafluoroetileno expandido [ePTFE; Gore-Tex] o tereftalato de polietileno [Dacron]), aloinjertos, tejido autólogo (pericardio o vena safena) y xenoinjertos 1. Mientras que los injertos artificiales (por ejemplo, Gore-Tex y Dacron) son los más utilizados, estos materiales probablemente causan numerosas complicaciones a corto y largo plazo que incluyen la estenosis, la deposición de calcio, trombo-embolia y las infecciones. Aunque los pacientes con injertos biológicos presentes con una disminución de eventos tromboembólicos, todavía se encuentran con limitaciones, como el fracaso del injerto secundaria y durabilidad acortada debido a la degradación de la calcificación 2. Por lo tanto, a pesar de las mejoras significativas en t quirúrgicaechniques largo de los años, los investigadores y los médicos todavía están cargados con la necesidad de identificar el conducto ideal para enfermedades vasculares. Más recientemente, el campo de la investigación de la ingeniería de tejido vascular ha generado un concepto en el que las células se incorporan en estructuras biodegradables, con el objetivo de crear un entorno biomimético que personifica un recipiente funcional para injerto realizado con éxito 1. Fundamentalmente, el éxito de las construcciones vasculares depende de tres componentes esenciales; las células que componen el andamio, es decir, una capa interna de células endoteliales y una capa de células del músculo liso, un andamio que contiene la matriz extracelular apropiado para proporcionar propiedades mecánicas comparables a la vasculatura nativa, y la señalización molecular / celular que se requiere para iniciar / regulador reparación.
La permeabilidad del injerto a largo plazo y el desarrollo sostenido de los neo-tejidos son altamente dependientes de la siembra de células eficaz de andamios, THereby haciendo que la decisión del tipo de célula de importancia crítica. Varios informes demuestran el uso de endoteliales maduras y las células musculares lisas de diferentes fuentes para desarrollar conductos de pequeño diámetro de 3-6. Aunque prometedores, la falta de vasos autólogos suficiente para obtener endoteliales maduras y las células musculares lisas siguen siendo una carga considerable. Más recientemente, las células madre a partir de diversas fuentes han sido explotados para aplicaciones de ingeniería de tejidos vasculares. Células mononucleares de hecho, las células madre pluripotentes una variedad de tipos de células madre, incluyendo células madre embrionarias 7, inducida (CMPI) 8,9, PIPSC 10,11, derivadas de la médula ósea 12, células madre mesenquimales 13, las células progenitoras endoteliales y la pared del vaso adulto -derivado células madre antígeno-1 (Sca-1) + células madre / progenitoras 14,15 todos se han demostrado que son capaces de diferenciarse en células endoteliales ya sea funcional o de músculo liso en respuesta a los medios de comunicación definidos ycondiciones de cultivo. Además, la capacidad ilimitada de auto renovación de las células madre a tomar mejores candidatos a diferencia endoteliales maduras y las células musculares lisas que sólo se puede dividir por un número finito de veces antes de someterse a la detención del crecimiento y la senescencia.
La selección del material de andamio para generar tejido éxito recipiente diseñado para el injerto depende de varios factores tales como la biocompatibilidad, propiedades biomecánicas, y la velocidad de biodegradación. Fundamentalmente, los materiales utilizados para crear andamios para los injertos deben ser biodegradables y no se montarán las respuestas inmunes receptores innecesario. Además, debe abarcar una porosidad adecuada y la microestructura para la fijación celular y la supervivencia posterior. Hasta la fecha, los materiales más comunes usados para andamios en la ingeniería de tejidos vascular incluyen polímeros de ácido poliglicólico, ácido poliláctico, y poli ε-caprolactona 16. Más recientemente, los materiales biológicos descelularizados tienenTambién ha aplicado con cierto éxito. Varios laboratorios han demostrado que la siembra de los vasos porcina humana descelularizado, canino o con células autólogas proporciona un injerto biológico que resistió la coagulación y la hiperplasia intimal 17-19. Otras estrategias de ingeniería de tejidos vascular incluyen injertos vasculares extracelulares basado proteínas de matriz por ejemplo, células de siembra en gel de fibrina 13 y generando láminas de células sin el apoyo del andamio 20, 21.
El protocolo actual demuestra la diferenciación de PIPSC humano en endotelial funcional y células musculares lisas, la generación de un biorreactor que consiste en un andamio recipiente descelularizado para albergar células vasculares derivadas de PIPSC funcionales, y el injerto de los vasos de ingeniería tisular en la inmunodeficiencia combinada severa (SCID ) ratones. PIPSC son un tipo de célula óptima a utilizar para la ingeniería de tejidos de injertos de vasos ya que estas células no forman tumores en ratones o plantean ético yallo respuestas inmunes. Por otra parte, hemos demostrado que la estrategia para la generación de células musculares Pipa-células endoteliales y Pipa-lisas es eficiente y reproducible 10,11. A partir de entonces, se diseñó un recipiente de descelularizado para la siembra de las células vasculares derivadas de PIPSC para imitar las proteínas de la matriz que existe dentro de un vaso nativo, mejorando así la supervivencia de injerto y la eficacia. Además, la descelularización de los vasos antes de la siembra PIPSC previene la aparición de las respuestas inflamatorias montadas por tipos de células inmunes, tales como macrófagos. Más importante aún, este protocolo no sólo representan una metodología para generar prometiendo conductos vasculares para la traducción a los seres humanos, sino que también proporciona medios valiosos para el estudio y la comprensión de los mecanismos moleculares que regulan la regeneración del tejido vascular a través de modelos de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo actual indica un sonido, la estrategia rápido, simple, eficiente y reproducible en la que los vasos de ingeniería tisular funcionales se pueden generar utilizando PIPSC a partir de fibroblastos humanos. Esta técnica representa una herramienta valiosa para la medicina regenerativa, la ingeniería de tejidos y terapia celular específica del paciente potencialmente en el futuro cercano. Los pasos críticos para garantizar la eficacia del protocolo incluyen la preparación de PIPSC, preparación de injertos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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