Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo
Summary
Qui, vi presentiamo un protocollo per generare ingegneria dei tessuti dei vasi innesti che sono funzionali per l'innesto in topi con un doppio semina cellule staminali pluripotenti indotte in parte (PiPSC) – derivato cellule muscolari lisce e PiPSC – cellule endoteliali derivate su una nave decellularized ponteggio bioreattore.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
La costruzione di condotti vascolari è una strategia fondamentale per la riparazione chirurgica di vasi danneggiati e feriti derivanti da malattie cardiovascolari. Ad oggi, materiali protesici utilizzati in chirurgia includono polimeri sintetici biocompatibili (politetrafluoroetilene [Teflon], politetrafluoroetilene espanso [ePTFE, Gore-Tex] o polietilene tereftalato [Dacron]), trapianti, tessuto autologo (pericardio o vena safena) e xenotrapianti 1. Mentre innesti artificiali (ad esempio, Gore-Tex e Dacron) sono più comunemente utilizzati, questi materiali possono causare numerose complicazioni a breve e lungo termine, che includono la stenosi, deposizione di calcio, trombo-embolizzazione e infezioni. Anche se i pazienti con innesti biologici presentano diminuite eventi tromboembolici, che ancora incontrano limitazioni come ad esempio il fallimento del trapianto secondario e durata accorciata a causa di calcificazione degrado 2. Pertanto, nonostante i significativi miglioramenti in t chirurgicaechniques corso degli anni, ricercatori e clinici sono ancora gravati con la necessità di individuare il condotto ideale per le malattie vascolari. Più recentemente, il campo di ricerca di ingegneria del tessuto vascolare ha generato un concetto in cui le cellule sono incorporati in scaffold biodegradabili, con lo scopo di creare un ambiente biomimetico che esemplifica una nave funzionale per successo innesto 1. Fondamentalmente, il successo dei costrutti vascolari dipendono tre componenti essenziali; cellule che compongono il ponteggio, cioè, uno strato interno di cellule endoteliali e di uno strato di cellule muscolari lisce, un'impalcatura contenente la matrice extracellulare appropriata per fornire proprietà meccaniche paragonabili alla vascolarizzazione nativa, e la segnalazione molecolare / cellulare che è richiesto per avviare / regolazione riparazione.
Lungo pervietà dell'innesto termine e lo sviluppo sostenibile dei neo-tessuti sono altamente dipendenti semina cellulare efficace di ponteggi, thereby rendendo la decisione di tipo di cellula di importanza critica. Diverse relazioni dimostrano l'uso di cellule endoteliali mature e cellule muscolari lisce da varie fonti di sviluppare condotte di piccolo diametro 3-6. Sebbene promettenti, la mancanza di vasi autologhi sufficienti per ottenere endoteliali mature e cellule muscolari lisce rimangono un onere considerevole. Più di recente, le cellule staminali provenienti da diverse fonti sono state sfruttate per applicazioni di ingegneria dei tessuti vascolari. Cellule mononucleate Infatti, una varietà di tipi di cellule staminali comprese le cellule staminali embrionali 7, indotto cellule staminali pluripotenti (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, derivate dal midollo osseo 12, cellule staminali mesenchimali 13, cellule progenitrici endoteliali della parete vasale e adulti -derived cellule staminali antigene-1 (Sca-1) + cellule staminali / progenitrici 14,15 sono stati tutti dimostrato di essere in grado di differenziarsi in cellule endoteliali sia funzionale o muscolari lisce in risposta ai media definiti econdizioni di coltura. Inoltre, la capacità di auto rinnovamento illimitata delle cellule staminali le rendono migliori candidati a differenza endoteliali mature e cellule della muscolatura liscia che può dividere solo per un numero finito di volte prima di subire l'arresto della crescita e senescenza.
La selezione del materiale per generare scaffold tessuto successo nave progettata per l'innesto dipende da diversi fattori quali la biocompatibilità, le proprietà biomeccaniche, e il tasso di biodegradazione. Fondamentalmente, i materiali usati per creare scaffold per gli innesti devono essere biodegradabili e non verranno montati destinatario inutili risposte immunitarie. Inoltre, esso deve comprendere una porosità e microstruttura adatto per il fissaggio e la sopravvivenza cellulare successiva. Ad oggi, i materiali più comuni utilizzati per ponteggi in ingegneria dei tessuti vascolari comprendono polimeri dell'acido poliglicolico, acido polilattico, e poli ε-caprolattone 16. Più recentemente, materiali biologici decellularized hannoanche state applicate con successo. Diversi laboratori hanno dimostrato che la semina umana decellularized, cane o vasi suina con cellule autologhe fornito un innesto biologico che ha resistito coagulazione e iperplasia intimale 17-19. Altre strategie di ingegneria del tessuto vascolare includono innesti vascolari extracellulari a base di proteine della matrice ad esempio, cellule semina in fibrina gel 13 e generando fogli cellulari senza supporto impalcatura 20, 21.
L'attuale protocollo dimostra la differenziazione di PiPSC umana in endoteliale funzionale e cellule muscolari lisce, la generazione di un bioreattore costituito da un ponteggio nave decellularized per porto cellule vascolari PiPSC-derivati funzionali, e l'innesto dei vasi ingegneria tessutale in grave immunodeficienza combinata (SCID ) topi. PiPSC sono un tipo di cellule ottimale da utilizzare per l'ingegneria dei tessuti di innesti per vasi, perché queste cellule non formano tumori in topi o sollevano eticorisposte allo-immunitarie. Inoltre, abbiamo dimostrato che la strategia per la generazione di cellule muscolari Pip-cellule endoteliali e semi-liscio è efficiente e riproducibile 10,11. Successivamente, abbiamo progettato una nave decellularized per la semina delle cellule vascolari PiPSC derivate per imitare da vicino le proteine della matrice che esiste all'interno di un vaso nativo, aumentando così l'innesto e la sopravvivenza di efficacia. Inoltre, la decellularization dei vasi prima PiPSC semina impedisce il verificarsi di risposte infiammatorie montati da tipi di cellule immunitarie quali macrofagi. Ancora più importante, questo protocollo non rappresenta solo un metodo per generare promettenti condotti vascolari per la traduzione in esseri umani, ma fornisce anche strumenti preziosi di studio e la comprensione dei meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione del tessuto vascolare attraverso modelli di mouse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo attuale indica un suono, veloce strategia, semplice, efficiente e riproducibile in cui i vasi ingegneria tessutale funzionali possono essere generati utilizzando PiPSC da fibroblasti umani. Questa tecnica rappresenta uno strumento prezioso per la medicina rigenerativa, l'ingegneria dei tessuti e terapia cellulare potenzialmente paziente-specifica in un prossimo futuro. Passaggi critici per assicurare l'efficacia del protocollo comprendono la preparazione di PiPSC, preparazione di innesti aortica st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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