هنا، نقدم بروتوكول لتوليد الأنسجة المهندسة ترقيع الأوعية التي هي وظيفية للتطعيم في الفئران عن طريق بذر المزدوج الناجم جزئيا الخلايا الجذعية المحفزة (PiPSC) – المشتقة خلايا العضلات الملساء وPiPSC – الخلايا البطانية مشتقة على decellularized سفينة سقالة مفاعل حيوي.
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
بناء قنوات الأوعية الدموية هي استراتيجية أساسية للإصلاح الجراحي للتلف وإصابة الأوعية الناتجة عن أمراض القلب والأوعية الدموية. حتى الآن، والمواد الكسب غير المشروع المستخدمة في الجراحة وتشمل حيويا البوليمرات الاصطناعية (تترافلوروإيثيلين [تفلون]، وسعت تترافلوروإيثيلين [EPTFE، غور تكس] أو البولي ايثلين [الداكرون])، المغايرة، الأنسجة ذاتي (التامور أو الوريد الصافن) وxenografts 1. في حين الطعوم الاصطناعية (على سبيل المثال، غور تكس والداكرون) هي الأكثر شيوعا، وهذه المواد المحتمل أن يسبب العديد من المضاعفات على المدى القصير والمدى الطويل التي تشمل تضيق، ترسب الكالسيوم وخثرات الانصمام والالتهابات. على الرغم من أن المرضى الذين يعانون من الطعوم البيولوجية الحالية مع تراجع أحداث خثرات صمية، فإنها لا تزال تواجه القيود مثل فشل الكسب غير المشروع الثانوي والمتانة تقصير بسبب تدهور تكلس 2. لذلك، على الرغم من التحسينات الكبيرة في تي الجراحيةلا تزال مثقلة echniques على مر السنين، والباحثين والأطباء مع ضرورة تحديد قناة مثالية لأمراض الأوعية الدموية. وفي الآونة الأخيرة، وقد ولدت مجال أبحاث هندسة الأنسجة الوعائية مفهوم التي تدرج بها الخلايا في السقالات القابلة للتحلل، وذلك بهدف خلق بيئة بيوميمتيك التي تجسد سفينة الوظيفية لنجاح تطعيم 1. في الأساس، فإن نجاح يبني الأوعية الدموية يعتمد على ثلاثة عناصر أساسية. الخلايا التي تتكون من سقالة، أي طبقة داخلية خلية البطانية وطبقة الخلايا العضلية الملساء، سقالة تحتوي على المصفوفة خارج الخلية المناسبة لتوفير الخصائص الميكانيكية مماثلة لالأوعية الدموية الأصلي، والإشارات الجزيئية / الخلوي ما هو مطلوب لبدء / تنظيم إصلاح.
طويلة المدى المباح الكسب غير المشروع والتنمية المستدامة للأنسجة الجدد تعتمد اعتمادا كبيرا على بذر خلية فعالة السقالات، عشرereby تقديم قرار نوع من الخلايا ذات أهمية حاسمة. وتظهر عدة تقارير استخدام البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء من مصادر مختلفة لتطوير قنوات صغيرة قطرها 3-6. وعلى الرغم من واعدة، وعدم وجود السفن ذاتي كافية للحصول تبقى البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء عبئا كبيرا. وفي الآونة الأخيرة، تم استغلال الخلايا الجذعية من مصادر مختلفة لتطبيقات هندسة الأنسجة الوعائية. خلايا وحيدات النوى في الواقع، ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الجذعية بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية 7، الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) 8،9، PiPSC 10،11، والمستمدة نخاع العظم 12، الخلايا الجذعية الوسيطة 13، الخلايا الاصلية البطانية وجدار الوعاء الدموي الكبار -derived الخلايا الجذعية مستضد 1 (SCA-1) + الخلايا الجذعية / السلف كلها قد أثبتت 14،15 لتكون قادرة على التمايز إلى خلايا إما البطانية وظيفية أو العضلات الملساء ردا على وسائل الاعلام محددة وشروط الثقافة. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة تجديد الذات غير محدودة من الخلايا الجذعية جعلها المرشحين الأفضل على عكس البطانية ناضجة وخلايا العضلات الملساء التي يمكن أن يقسم إلا لعدد محدود من المرات قبل ان يخضع لاعتقال النمو والشيخوخة.
اختيار المواد سقالة لتوليد الأنسجة ناجحة سفينة هندسيا للتطعيم يعتمد على عدة عوامل مثل توافق مع الحياة، خصائص النشاط الحيوي، ومعدل التحلل البيولوجي. في الأساس، والمواد المستخدمة في إنشاء السقالات لترقيع يجب أن تكون قابلة للتحلل ولن جبل المتلقي لزوم لها الاستجابات المناعية. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تشمل المسامية مناسبة والمجهرية لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة لاحق. حتى الآن، والمواد الأكثر شيوعا لالسقالات في هندسة الأنسجة الوعائية وتشمل البوليمرات من حمض polyglycolic، عديد حمض اللبنيك، وبولي ε-caprolactone 16. وفي الآونة الأخيرة، المواد البيولوجية decellularized لهاكما تم تطبيقه مع بعض النجاح. وقد أظهرت العديد من المختبرات التي البذر السفن الخنازير البشرية decellularized، والكلاب أو مع خلايا ذاتي قدمت الكسب غير المشروع البيولوجي التي قاومت تخثر وباطنة تضخم 17-19. وتشمل الاستراتيجيات الأخرى في هندسة الأنسجة الوعائية خارج الخلية ترقيع الأوعية الدموية القائمة على البروتينات المصفوفة على سبيل المثال، بذر الخلايا في الليفين هلام 13 وأوراق خلية توليد دون دعم سقالة 20 و 21.
يوضح البروتوكول الحالي تمايز PiPSC الإنسان في البطانية الوظيفية وخلايا العضلات الملساء، وتوليد مفاعل حيوي يتكون من سقالة سفينة decellularized لإيواء خلايا الأوعية الدموية PiPSC المشتقة وظيفية، وترقيع الأوعية الأنسجة المهندسة إلى نقص المناعة الشديد مجتمعة (SCID ) الفئران. PiPSC تشكل نوع من الخلايا الأمثل لاستخدامها لهندسة الأنسجة الطعوم السفينة لأن هذه الخلايا لا تشكل الأورام في الفئران أو رفع الأخلاقي وردود ألو-المناعية. وعلاوة على ذلك، لقد أظهرنا أن استراتيجية لتوليد بالنقاط، البطانية الخلايا ونقطة على نحو سلس خلايا العضلات هي فعالة وقابلة للتكرار 10،11. بعد ذلك، قمنا بتصميم سفينة decellularized لزرع البذور من خلايا الأوعية الدموية PiPSC المشتقة من لتقليد بشكل وثيق البروتينات المصفوفة موجود داخل سفينة الأم، وبالتالي تعزيز التطعيم وبقاء فعالية. وعلاوة على ذلك، فإن decellularization من السفن قبل PiPSC البذر يمنع وقوع الاستجابات الالتهابية التي شنت من قبل أنواع الخلايا المناعية مثل الضامة. الأهم من ذلك، هذا البروتوكول لا تمثل سوى منهجية لتوليد واعدة قنوات الأوعية الدموية للترجمة إلى البشر، ولكنها توفر أيضا وسيلة قيمة لدراسة وفهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في تجديد الأنسجة الوعائية من خلال نماذج الماوس.
ويشير البروتوكول الحالي لوسريعة استراتيجية سليمة وبسيطة وفعالة وقابلة للتكرار الذي يمكن توليد الأنسجة المهندسة السفن الوظيفية باستخدام PiPSC من الخلايا الليفية الإنسان. هذه التقنية تمثل أداة قيمة للطب التجديدي، هندسة الأنسجة والعلاج بالخلايا يحتمل المريض محددة في ?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |