एक माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर वेसल्स का सृजन और कलम बांधने का काम
Summary
यहाँ, हम डबल बोने आंशिक रूप से प्रेरित स्टेम सेल से चूहों में कलम बांधने का काम के लिए कार्य कर रहे हैं कि ऊतक इंजीनियर पोत ग्राफ्ट उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत (PiPSC) – एक decellularized पोत पाड़ बायोरिएक्टर पर व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं – चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और PiPSC निकाली गई।
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
संवहनी नाली का निर्माण हृदय रोगों से उत्पन्न क्षतिग्रस्त और घायल जहाजों की शल्य चिकित्सा की मरम्मत के लिए एक बुनियादी रणनीति है। , Allografts, ऑटोलॉगस ऊतक (पेरीकार्डियम या saphenous नस) और xenografts 1; तिथि करने के लिए, सर्जरी में इस्तेमाल भ्रष्टाचार सामग्री biocompatible है सिंथेटिक पॉलिमर ([गोर-टेक्स ePTFE] या पॉलीथीन terephthalate [Dacron] polytetrafluoroethylene [Teflon], विस्तारित polytetrafluoroethylene) शामिल हैं। कृत्रिम ग्राफ्ट (जैसे, गोर-टेक्स और Dacron) सबसे अधिक इस्तेमाल कर रहे हैं, whilst इन सामग्रियों की संभावना एक प्रकार का रोग, कैल्शियम बयान, thrombo-embolization और संक्रमण शामिल है कि कई छोटी और लंबी अवधि जटिलताओं के कारण। साथ मौजूद जैविक grafts के साथ रोगियों thrombo-embolic की घटनाओं में कमी आई है, वे अभी भी इस तरह कड़ा हो जाना गिरावट 2 के कारण माध्यमिक भ्रष्टाचार असफलता और छोटा स्थायित्व के रूप में सीमाओं मुठभेड़। इसलिए, शल्य टी में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूदसाल, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों से अधिक echniques अभी भी संवहनी रोगों के लिए आदर्श नाली की पहचान करने के लिए की जरूरत के बोझ तले दब रहे हैं। हाल ही में, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के अनुसंधान के क्षेत्र कोशिकाओं सफल ग्राफ्टिंग एक के लिए एक कार्यात्मक पोत के प्रतीक हैं कि एक biomimetic माहौल बनाने के उद्देश्य के साथ, biodegradable के scaffolds के रूप में शामिल कर रहे हैं, जिसमें एक अवधारणा उत्पन्न किया है। मूलरूप में, संवहनी निर्माणों की सफलता के तीन आवश्यक घटकों पर निर्भर करती है; यानी पाड़, एक endothelial सेल भीतरी परत और एक चिकनी पेशी सेल परत, देशी वाहिका संरचना करने के लिए तुलनीय यांत्रिक गुणों प्रदान करने के लिए उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स युक्त एक चबूतरा है, और / विनियमन की शुरुआत के लिए आवश्यक है कि सेलुलर / आणविक संकेत दे कि शामिल कोशिकाओं मरम्मत।
दीर्घकालिक भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता और नव-ऊतकों के निरंतर विकास, वें scaffolds के प्रभावी सेल बोने पर अत्यधिक निर्भर हैंereby महत्व का सेल प्रकार के निर्णय प्रतिपादन। कई रिपोर्टों छोटे व्यास नाली 3-6 विकसित करने के लिए परिपक्व endothelial और विभिन्न स्रोतों से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के उपयोग के प्रदर्शन। होनहार हालांकि, पर्याप्त ऑटोलॉगस जहाजों की कमी परिपक्व endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं एक काफी बोझ रहना प्राप्त करने के लिए। अभी हाल ही में विभिन्न स्रोतों से स्टेम कोशिकाओं संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए शोषण किया गया है। दरअसल, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 7 सहित स्टेम सेल प्रकार की एक किस्म, प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं mononuclear 12, mesenchymal स्टेम सेल 13, endothelial पूर्वज कोशिकाओं और वयस्क पोत दीवार स्टेम व्युत्पन्न सेल प्रतिजन-1 (एससीए -1) + 14,15 सभी परिभाषित मीडिया के जवाब में कार्यात्मक एन्दोथेलिअल या चिकनी मांसपेशियों या तो कोशिकाओं में भेदभाव करने में सक्षम होने के लिए प्रदर्शन किया गया है स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं औरसंस्कृति की स्थिति। इसके अलावा, स्टेम कोशिकाओं की असीमित आत्म नवीकरण क्षमता उन्हें परिपक्व endothelial और केवल विकास गिरफ्तारी और वार्धक्य से गुजरने के पहले के समय की एक निश्चित संख्या के लिए विभाजित कर सकते हैं जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के विपरीत बेहतर उम्मीदवार बनाती है।
ग्राफ्टिंग ऐसे biocompatibility, बायोमैकेनिकल गुण, और बायो़डीग्रेडेशन की दर के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है के लिए पाड़ सामग्री का चयन सफल ऊतक इंजीनियर पोत उत्पन्न करने के लिए। मूलरूप में, सामग्री, biodegradable होना चाहिए ग्राफ्ट के लिए scaffolds बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है और अनावश्यक प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट नहीं होगा। इसके अतिरिक्त, यह सेल लगाव और बाद के अस्तित्व के लिए एक उपयुक्त सरंध्रता और microstructure धरना चाहिए। तिथि करने के लिए, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग में scaffolds के लिए इस्तेमाल सबसे आम सामग्री polyglycolic एसिड, polylactic एसिड, और पाली ε-caprolactone 16 की पॉलिमर शामिल हैं। हाल ही में, decellularized जैविक सामग्री हैयह भी कुछ सफलता के साथ लागू किया गया। कई प्रयोगशालाओं ऑटोलॉगस कोशिकाओं के साथ decellularized मानव, कुत्ते या सुअर का वाहिकाओं बोने के थक्के और intimal हाइपरप्लासिया 17-19 विरोध कि एक जैविक भ्रष्टाचार प्रदान की जाती है कि पता चला है। संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग में अन्य रणनीतियों पाड़ समर्थन 20, 21 बिना जैसे बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन आधारित संवहनी ग्राफ्ट, आतंच जेल में 13 बोने कोशिकाओं और पैदा करने सेल पत्रक शामिल हैं।
मौजूदा प्रोटोकॉल कार्यात्मक endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, गंभीर संयुक्त इम्यूनो में ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं के एक कार्यात्मक PiPSC व्युत्पन्न नाड़ी कोशिकाओं बंदरगाह के लिए एक decellularized पोत पाड़ से मिलकर बायोरिएक्टर, और ग्राफ्टिंग की पीढ़ी (SCID में मानव PiPSC के भेदभाव को दर्शाता है ) चूहों। PiPSC इन कोशिकाओं को चूहों में ट्यूमर फार्म या नैतिक बढ़ा नहीं है क्योंकि पोत grafts के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक इष्टतम सेल प्रकार के होते हैं औरallo-प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। इसके अलावा, हम पिप्स-endothelial कोशिकाओं और पिप्स-चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए रणनीति कुशल और 10,11 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि पता चला है। इसके बाद, हम इस प्रकार ग्राफ्टिंग और अस्तित्व प्रभावकारिता को बढ़ाने, बारीकी से एक देशी पोत के भीतर मौजूद है कि मैट्रिक्स प्रोटीन की नकल करने PiPSC व्युत्पन्न नाड़ी कोशिकाओं के बोने के लिए एक decellularized पोत बनाया गया है। इसके अलावा, पूर्व PiPSC बोने के लिए जहाजों की decellularization ऐसे मैक्रोफेज के रूप में प्रतिरक्षा सेल प्रकार से मुहिम शुरू की भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की घटना को रोकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल केवल मनुष्य में अनुवाद के लिए संवहनी नाली का वादा उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, लेकिन यह भी अध्ययन और माउस मॉडल के माध्यम से संवहनी ऊतक पुनर्जनन को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को समझने के मूल्यवान साधन प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मौजूदा प्रोटोकॉल कार्यात्मक ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं मानव fibroblasts से PiPSC का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें एक ध्वनि, तेज, सरल, कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की रणनीति का संकेत है। इस तकनीक को निकट भ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
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