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Bioengineering

एक माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर वेसल्स का सृजन और कलम बांधने का काम

doi: 10.3791/52565 Published: March 18, 2015
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम डबल बोने आंशिक रूप से प्रेरित स्टेम सेल से चूहों में कलम बांधने का काम के लिए कार्य कर रहे हैं कि ऊतक इंजीनियर पोत ग्राफ्ट उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत (PiPSC) - एक decellularized पोत पाड़ बायोरिएक्टर पर व्युत्पन्न endothelial कोशिकाओं - चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और PiPSC निकाली गई।

Introduction

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संवहनी नाली का निर्माण हृदय रोगों से उत्पन्न क्षतिग्रस्त और घायल जहाजों की शल्य चिकित्सा की मरम्मत के लिए एक बुनियादी रणनीति है। , Allografts, ऑटोलॉगस ऊतक (पेरीकार्डियम या saphenous नस) और xenografts 1; तिथि करने के लिए, सर्जरी में इस्तेमाल भ्रष्टाचार सामग्री biocompatible है सिंथेटिक पॉलिमर ([गोर-टेक्स ePTFE] या पॉलीथीन terephthalate [Dacron] polytetrafluoroethylene [Teflon], विस्तारित polytetrafluoroethylene) शामिल हैं। कृत्रिम ग्राफ्ट (जैसे, गोर-टेक्स और Dacron) सबसे अधिक इस्तेमाल कर रहे हैं, whilst इन सामग्रियों की संभावना एक प्रकार का रोग, कैल्शियम बयान, thrombo-embolization और संक्रमण शामिल है कि कई छोटी और लंबी अवधि जटिलताओं के कारण। साथ मौजूद जैविक grafts के साथ रोगियों thrombo-embolic की घटनाओं में कमी आई है, वे अभी भी इस तरह कड़ा हो जाना गिरावट 2 के कारण माध्यमिक भ्रष्टाचार असफलता और छोटा स्थायित्व के रूप में सीमाओं मुठभेड़। इसलिए, शल्य टी में महत्वपूर्ण सुधार के बावजूदसाल, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों से अधिक echniques अभी भी संवहनी रोगों के लिए आदर्श नाली की पहचान करने के लिए की जरूरत के बोझ तले दब रहे हैं। हाल ही में, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग के अनुसंधान के क्षेत्र कोशिकाओं सफल ग्राफ्टिंग एक के लिए एक कार्यात्मक पोत के प्रतीक हैं कि एक biomimetic माहौल बनाने के उद्देश्य के साथ, biodegradable के scaffolds के रूप में शामिल कर रहे हैं, जिसमें एक अवधारणा उत्पन्न किया है। मूलरूप में, संवहनी निर्माणों की सफलता के तीन आवश्यक घटकों पर निर्भर करती है; यानी पाड़, एक endothelial सेल भीतरी परत और एक चिकनी पेशी सेल परत, देशी वाहिका संरचना करने के लिए तुलनीय यांत्रिक गुणों प्रदान करने के लिए उपयुक्त बाह्य मैट्रिक्स युक्त एक चबूतरा है, और / विनियमन की शुरुआत के लिए आवश्यक है कि सेलुलर / आणविक संकेत दे कि शामिल कोशिकाओं मरम्मत।

दीर्घकालिक भ्रष्टाचार प्रत्यक्षता और नव-ऊतकों के निरंतर विकास, वें scaffolds के प्रभावी सेल बोने पर अत्यधिक निर्भर हैंereby महत्व का सेल प्रकार के निर्णय प्रतिपादन। कई रिपोर्टों छोटे व्यास नाली 3-6 विकसित करने के लिए परिपक्व endothelial और विभिन्न स्रोतों से चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के उपयोग के प्रदर्शन। होनहार हालांकि, पर्याप्त ऑटोलॉगस जहाजों की कमी परिपक्व endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं एक काफी बोझ रहना प्राप्त करने के लिए। अभी हाल ही में विभिन्न स्रोतों से स्टेम कोशिकाओं संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए शोषण किया गया है। दरअसल, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 7 सहित स्टेम सेल प्रकार की एक किस्म, प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं mononuclear 12, mesenchymal स्टेम सेल 13, endothelial पूर्वज कोशिकाओं और वयस्क पोत दीवार स्टेम व्युत्पन्न सेल प्रतिजन-1 (एससीए -1) + 14,15 सभी परिभाषित मीडिया के जवाब में कार्यात्मक एन्दोथेलिअल या चिकनी मांसपेशियों या तो कोशिकाओं में भेदभाव करने में सक्षम होने के लिए प्रदर्शन किया गया है स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं औरसंस्कृति की स्थिति। इसके अलावा, स्टेम कोशिकाओं की असीमित आत्म नवीकरण क्षमता उन्हें परिपक्व endothelial और केवल विकास गिरफ्तारी और वार्धक्य से गुजरने के पहले के समय की एक निश्चित संख्या के लिए विभाजित कर सकते हैं जो चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के विपरीत बेहतर उम्मीदवार बनाती है।

ग्राफ्टिंग ऐसे biocompatibility, बायोमैकेनिकल गुण, और बायो़डीग्रेडेशन की दर के रूप में कई कारकों पर निर्भर करता है के लिए पाड़ सामग्री का चयन सफल ऊतक इंजीनियर पोत उत्पन्न करने के लिए। मूलरूप में, सामग्री, biodegradable होना चाहिए ग्राफ्ट के लिए scaffolds बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है और अनावश्यक प्राप्तकर्ता प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट नहीं होगा। इसके अतिरिक्त, यह सेल लगाव और बाद के अस्तित्व के लिए एक उपयुक्त सरंध्रता और microstructure धरना चाहिए। तिथि करने के लिए, संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग में scaffolds के लिए इस्तेमाल सबसे आम सामग्री polyglycolic एसिड, polylactic एसिड, और पाली ε-caprolactone 16 की पॉलिमर शामिल हैं। हाल ही में, decellularized जैविक सामग्री हैयह भी कुछ सफलता के साथ लागू किया गया। कई प्रयोगशालाओं ऑटोलॉगस कोशिकाओं के साथ decellularized मानव, कुत्ते या सुअर का वाहिकाओं बोने के थक्के और intimal हाइपरप्लासिया 17-19 विरोध कि एक जैविक भ्रष्टाचार प्रदान की जाती है कि पता चला है। संवहनी ऊतक इंजीनियरिंग में अन्य रणनीतियों पाड़ समर्थन 20, 21 बिना जैसे बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन आधारित संवहनी ग्राफ्ट, आतंच जेल में 13 बोने कोशिकाओं और पैदा करने सेल पत्रक शामिल हैं।

मौजूदा प्रोटोकॉल कार्यात्मक endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, गंभीर संयुक्त इम्यूनो में ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं के एक कार्यात्मक PiPSC व्युत्पन्न नाड़ी कोशिकाओं बंदरगाह के लिए एक decellularized पोत पाड़ से मिलकर बायोरिएक्टर, और ग्राफ्टिंग की पीढ़ी (SCID में मानव PiPSC के भेदभाव को दर्शाता है ) चूहों। PiPSC इन कोशिकाओं को चूहों में ट्यूमर फार्म या नैतिक बढ़ा नहीं है क्योंकि पोत grafts के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयोग करने के लिए एक इष्टतम सेल प्रकार के होते हैं औरallo-प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया। इसके अलावा, हम पिप्स-endothelial कोशिकाओं और पिप्स-चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए रणनीति कुशल और 10,11 प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि पता चला है। इसके बाद, हम इस प्रकार ग्राफ्टिंग और अस्तित्व प्रभावकारिता को बढ़ाने, बारीकी से एक देशी पोत के भीतर मौजूद है कि मैट्रिक्स प्रोटीन की नकल करने PiPSC व्युत्पन्न नाड़ी कोशिकाओं के बोने के लिए एक decellularized पोत बनाया गया है। इसके अलावा, पूर्व PiPSC बोने के लिए जहाजों की decellularization ऐसे मैक्रोफेज के रूप में प्रतिरक्षा सेल प्रकार से मुहिम शुरू की भड़काऊ प्रतिक्रियाओं की घटना को रोकता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल केवल मनुष्य में अनुवाद के लिए संवहनी नाली का वादा उत्पन्न करने के लिए एक पद्धति का प्रतिनिधित्व नहीं करता है, लेकिन यह भी अध्ययन और माउस मॉडल के माध्यम से संवहनी ऊतक पुनर्जनन को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्र को समझने के मूल्यवान साधन प्रदान करता है।

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Protocol

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प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग और देखभाल के लिए संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार सभी पशु प्रयोगों प्रदर्शन।

संस्कृति मीडिया के 1. तैयारी

  1. एफ-12K मध्यम, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन: मानव तंतुप्रसू सेल लाइन सीसीएल-153 के लिए संस्कृति मीडिया बनाओ।
  2. PiPSC पीढ़ी के लिए Reprogramming मीडिया बनाओ: नॉकआउट Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 20% नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, 0.1 मिमी न्यूनतम आवश्यक मध्यम (सदस्य) गैर आवश्यक अमीनो एसिड, 10 एनजी / एमएल बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक युक्त 2 (bFGF-2) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन। मीडिया का उपयोग करने से पहले bFGF-2 हौसले हर बार जोड़ें।
  3. चिकनी पेशी सेल प्रेरित करने के लिए भेदभाव मीडिया (डीएम) बनाओ (एसएमसी) भेदभाव: 10% FBS के, 0.1 मिमी β-mercaptoethanol, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 एनजी / एमएल प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक युक्त मीडिया सदस्य α(PDGF-ββ)।
  4. बनाओ अंतर्कलीय भेदभाव मीडिया endothelial सेल (ईसी) भेदभाव प्रेरित करने के लिए (ईसी-डीएम): endothelial वृद्धि मीडिया-2 (ईजीएम-2) 50 एनजी युक्त मीडिया / एमएल संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) और 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन।

आंशिक रूप से प्रेरित स्टेम कोशिकाओं में 2. Reprogramming मानव fibroblasts (PiPSC)

  1. संस्कृति के माध्यम में 0.04% जिलेटिन समाधान लेपित बोतल पर संस्कृति मानव तंतुप्रसू सेल लाइन सीसीएल-153।
  2. बीतने कोशिकाओं 1 के अनुपात में हर 3 दिन: 6। PiPSC पीढ़ी के इष्टतम दक्षता के लिए पारित होने के नौ से पहले कोशिकाओं का प्रयोग करें। 90% confluency - प्रकोष्ठों 80 पर पहुंचने पर अभिकर्मक के लिए तैयार हैं।
  3. 4 reprogramming के कारकों से युक्त polycistronic प्लाज्मिड pCAG2LMKOSimO linearize octamer बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक 4 (OCT4), Sox2, Kruppel-जैसे कारक 4 (KLF4) और सी-MYC (pCAG-OSKM)। 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए PvuI प्रतिबंध एंजाइम की 5 इकाइयों के साथ प्लाज्मिड के 5 माइक्रोग्राम प्रति डाइजेस्ट। शुद्ध करनानिर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक वाणिज्यिक किट के साथ प्लाज्मिड।
  4. Transfect निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार मानव त्वचीय तंतुप्रसू (NHDF) nucleofection किट के साथ electroporation द्वारा linearized pCAG-OSKM प्लाज्मिड के चार माइक्रोग्राम प्रति के साथ 2 एक्स 10 6 मानव fibroblasts। धीरे पूर्व गर्म Reprogramming मीडिया के 5 मिलीलीटर युक्त पूर्व 0.04% जिलेटिन लेपित T25 फ्लास्क पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं बीज।
  5. 24 घंटे के बाद, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं का एक शुद्ध आबादी को चुनने के लिए 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / neomycin की खुराक के साथ मध्यम बदल जाते हैं।
  6. 4 दिन तक हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।
    नोट: मानव fibroblasts reprogramming की चार दिनों के बाद PiPSC हो जाते हैं।

Endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में PiPSC 3. भेदभाव

  1. चार दिनों के लिए डीएम युक्त कोलेजन चतुर्थ पूर्व लेपित व्यंजन पर बीज PiPSC एसएमसी में भेदभाव प्रेरित करने के लिए। 4 दिन तक हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।
  2. कोलेजन चतुर्थ पूर्व लेपित व्यंजन सी पर बीज PiPSC6 दिन के लिए एन्दोथेलिअल डीएम ontaining endothelial कोशिकाओं में भेदभाव प्रेरित करने के लिए। 6 दिन तक हर दूसरे दिन मध्यम बदलें।

4. decellularized महाधमनी भ्रष्टाचार तैयारी

नोट: सभी समाधान और उपकरण बाँझ होना चाहिए।

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से माउस बलिदान और विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे एक लापरवाह स्थिति में माउस तय कर लो।
  2. वक्ष गुहा को खोलने के लिए उरोस्थि के माध्यम से और रिब पिंजरे के आसपास कट। महाधमनी का पर्दाफाश करने के लिए दिल, फेफड़े और घेघा निकालें। धीरे संदंश के साथ पेरी-महाधमनी वसा को हटा दें।
  3. कैंची से पूर्वकाल अंत से महाधमनी काटें और धीरे कुंद संदंश के साथ अंत पकड़ो। कुंद विच्छेदन से पीछे रीढ़ स्तंभ से महाधमनी अलग करें। ध्यान से एक द्विध्रुवी electrocoagulator साथ बंधाव द्वारा महाधमनी से सभी शाखाओं में बंटी धमनियों को बंद करने और कैंची से बंधाव के अंत से अब तक काटने।
  4. तीन मीटर के साथ महाधमनी लुमेन फ्लश करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करेंरक्त के थक्के के गठन को रोकने के लिए हेपरिन की 100 यू युक्त खारा समाधान के एल।
  5. गुर्दे में शाखाओं से पहले महाधमनी के पीछे अंत कट। महाधमनी की अखंडता को ध्यान में रखते हुए पूरी प्रक्रिया के दौरान बहुत महत्वपूर्ण है।
  6. फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में पतला 0.075% सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ महाधमनी लुमेन फ्लश।
  7. एक 10 सेमी पेट्री डिश में 0.075% एसडीएस समाधान में वक्ष महाधमनी भिगोएँ। आरटी पर 150 rpm पर 2 घंटे के लिए एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश रखें।
  8. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ महाधमनी लुमेन फ्लश।
  9. एक 10 सेमी पेट्री डिश में पीबीएस में महाधमनी भिगोएँ। आरटी पर 150 rpm पर 2 घंटे के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश रखें। पीबीएस हर 20 मिनट ताज़ा करें।
  10. पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ महाधमनी लुमेन फ्लश।
  11. अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस में decellularized महाधमनी भ्रष्टाचार रखें।

PiPSC और बायोरिएक्टर कंडीशनिंग 5. दोहरी सीडिंग

नोट: सभी समाधानs और उपकरण बाँझ होना चाहिए। एक टिशू कल्चर हुड में सभी कार्यों को पूरा करें।

  1. चित्रा 1 में सचित्र के रूप में। बायोरिएक्टर प्रवाह सर्किट इकट्ठा ट्यूबिंग साथ ऊष्मायन कक्ष, मीडिया जलाशय, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और अनुपालन चैम्बर कनेक्ट करें। संचलन के लिए आवश्यक माध्यम की न्यूनतम मात्रा 40 मिलीग्राम है।
  2. पूर्व शर्त एक 10 सेमी पेट्री डिश में डीएम के माध्यम में महाधमनी भिगोने से संस्कृति के माध्यम से decellularized पोत। आरटी पर 50 rpm पर 1 घंटे के लिए कक्षीय प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश रखें।
  3. खुर्दबीन के नीचे decellularized पोत के दोनों सिरों में एक सेमी लंबाई नायलॉन ट्यूब (आयुध डिपो 0.9 मिमी, आईडी 0.75 मिमी) डालें। पोत और 8-0 रेशम sutures के साथ ट्यूबों बाँधो।
  4. कक्ष की दीवार से इनलेट और आउटलेट बंदरगाहों (1/32 "ट्यूबिंग) के साथ नायलॉन ट्यूबों को जोड़ने के द्वारा ऊष्मायन कक्ष में decellularized महाधमनी भ्रष्टाचार इकट्ठे। मध्यम के 5mls प्रत्येक समय के साथ ऊष्मायन चैम्बर बनाए रखें।
  5. उनका कहना है पूर्व गर्म द्वारा Trypsinize PiPSCट्रिप्सिन संस्कृति डिश को कवर किया और धीरे पकवान 10 बार रॉक करने के लिए। ट्रिप्सिन त्यागें और 2 के लिए इनक्यूबेटर में पकवान छोड़ - 3 मिनट। डिश में पूर्व गर्म संस्कृति के माध्यम से जोड़ें और कोशिकाओं के साथ मध्यम मिश्रण।
  6. एक hemocytometer का उपयोग सेल संख्या की गणना। अपकेंद्रित्र 300 x जी पर 5 मिनट के लिए 5 x 10 5 कोशिकाओं से युक्त सेल निलंबन के दो aliquots। पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  7. पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला aspirating के बाद, डीएम के 50 μl में पिप्स सेल छर्रों का एक गोली resuspend। Decellularized पोत लुमेन में इस सेल निलंबन इंजेक्षन।
  8. फिर, Matrigel के 100 μl में अन्य पिप्स सेल गोली resuspend। ध्यान से decellularized महाधमनी भ्रष्टाचार पर मिश्रण विंदुक।
  9. मिश्रण पोत बाहरी सतह के आसपास wraps समान रूप से एक जेल की तरह राज्य में बदल जाता है और जब तक 15 मिनट - 10 के लिए प्रतीक्षा करें। डीएम के साथ ऊष्मायन चैम्बर भरें।
  10. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेटिंग पूरे बायोरिएक्टर रखें। मैन्युअल पहले 2 घंटा में decellularized भ्रष्टाचार अनुदैर्ध्य अक्ष हर आधे घंटे के आसपास 90 डिग्री बारी बारी से।
  11. कोशिका आसंजन सक्षम करने के लिए 12 घंटे के लिए स्थिर संस्कृति रखें।
  12. चिकनी पेशी सेल भेदभाव प्रेरित करने के लिए क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप द्वारा लुमेन के माध्यम से डीएम वितरित करें। 5 मिलीग्राम / मिनट और 24 घंटा से अधिक 20 मिलीग्राम / मिनट के लिए चरणबद्ध वृद्धि पर प्रारंभिक प्रवाह दर को प्रारंभ करें।
  13. 24 घंटे के लिए 20 मिलीग्राम / मिनट पर परिसंचारी मध्यम प्रवाह की दर रखें।
  14. मध्यम प्रवाह को रोकने और इनक्यूबेटर के बाहर स्थापित बायोरिएक्टर चाल है।
  15. पुनः बीज PiPSC के साथ भ्रष्टाचार के लुमेन। 5.6 - Trypsinize, कदम 5.5 में के रूप में गिनती और सेंट्रीफ्यूज 1 एक्स 10 6 PiPSC। 50 एनजी / एमएल वीईजीएफ़ युक्त ईजीएम -2 मध्यम के 50 μl में कोशिकाओं Resuspend। भ्रष्टाचार के लुमेन में सेल मिश्रण इंजेक्षन।
  16. एन्दोथेलिअल भेदभाव प्रेरित करने के लिए 50 एनजी / एमएल वीईजीएफ़ युक्त ईजीएम -2 मध्यम करने के लिए ऊष्मायन चैम्बर और पूरे संचलन में मध्यम बदलें।
  17. वें वापस करने के लिए सेटिंग बायोरिएक्टर हटोई इनक्यूबेटर। मैन्युअल भ्रष्टाचार पहले 2 घंटा 90 ° हर 30 मिनट के लिए बारी बारी से और फिर 12 घंटे के लिए एक स्थिर संस्कृति रहते हैं।
  18. 5 मिलीग्राम / मिनट और 35 मिलीग्राम / मिनट के लिए चरणबद्ध वृद्धि से प्रवाह परिसंचारी शुरू करो। 5 दिनों के लिए 35 मिलीलीटर में प्रवाह दर / मिनट रखें। हर दूसरे दिन परिसंचारी और चैम्बर मध्यम बदलें।
  19. माउस के लिए आगे ग्राफ्टिंग के लिए इंजीनियर भ्रष्टाचार हार्वेस्ट।

चूहों में डबल वरीयता प्राप्त PiPSC भ्रष्टाचार के 6. कलम बांधने का काम

  1. इस्तेमाल की NOD.CB17-Prkdc SCID / पोत भ्रष्टाचार प्राप्तकर्ताओं के रूप में NcrCrl पुरुष चूहों। 35 जी, और अच्छे स्वास्थ्य की स्थिति में हैं - हमेशा चूहों के बारे में 10 सप्ताह पुराने हैं लगभग 25 तौलना कि सुनिश्चित करते हैं।
  2. Intraperitoneally Hypnorm (25 मिलीग्राम / किग्रा) और Hypnovel (25 मिलीग्राम / किग्रा) का एक संयोजन प्रशासन द्वारा प्राप्तकर्ता माउस anesthetize। संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर वेसिलीन नेत्र मरहम लागू करें। चूहों आराम से मांसपेशियों है और तेजी से साँस ले रहे हैं कि सुनिश्चित करने के द्वारा कुशल anesthetization की पुष्टि करें।
    1. अपनी गर्दन मुंडा और बढ़ाया के साथ एक लापरवाह स्थिति में माउस को ठीक करें। माउस श्वसन तंत्र साफ रहता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एनेस्थेटिक्स के साथ संयोजन में atropine सल्फेट (1.7 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन।
  3. माउस के उरोस्थि को जबड़ा से एक midline चीरा तैयार करें। 5- करने के लिए 10 गुना प्रवर्धन के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, पार्श्व सही लार ग्रंथियों उठा और सही आम मन्या धमनी का पर्दाफाश करने का अधिकार cleidomastoid मांसपेशियों को हटा दें।
  4. धीरे समीपस्थ अंत की ओर बाहर का अंत से सही आम मन्या धमनी को लामबंद करने के लिए संलग्न ऊतकों को हटा दें। एक 8-0 रेशम सीवन के साथ दो बार आम मन्या धमनी के मध्य भाग ligate और दो संबंधों के बीच काटना।
  5. प्रत्येक पोत अंत में autoclavable नायलॉन ट्यूब से बना एक कफ से गुजरती हैं और microhemostat clamps के साथ प्रत्येक के अंत तय कर लो।
  6. एक छोर पर सीवन टाई निकालें और हेपरिन की एक बूंद (100 यू / एमएल) के लागू होते हैं। इसके तत्काल बाद, वें के बाहर का अंत पलटनाई धमनी पूरे कफ शरीर को कवर किया और कफ के लिए एक 8-0 रेशम सीवन के साथ उल्टे पोत को ठीक करने के लिए।
    1. धमनी के दूसरे भाग के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ। खारा समाधान के साथ फ्लश धमनी रक्त के थक्के को हटाने के लिए।
  7. धमनी कफ से अधिक की decellularized पोत सिरों फिसलने और 8-0 रेशम sutures के साथ यह तय करने से कैरोटिड धमनी के दोनों सिरों के बीच एक decellularized पोत भ्रष्टाचार प्रत्यारोपण। भ्रष्टाचार की धड़कन के मूल्यांकन से पहले या तो समाप्त होता है से संवहनी clamps के लिए निकालें।
  8. वापस अपनी मूल स्थिति में सही लार ग्रंथि रखें। एक 6-0 polyglactin सीवन का उपयोग कर एक बाधित सीवन के साथ शल्य स्थान पर त्वचा को बंद करें।
  9. प्रक्रिया पूर्ण होने के बाद यह चेतना शुरू तक लगातार, माउस का महत्वपूर्ण संकेत निरीक्षण करते हैं। गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और फसल पोत ग्राफ्ट से 24 घंटा या बाद में आगे के विश्लेषण के लिए तीन सप्ताह या तो प्राप्तकर्ता चूहों बलिदान।

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Representative Results

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PiPSC के सफल पीढ़ी 4 प्रतिलेखन कारक, OCT4, Sox2, KLF4 और सी-MYC (OSKM) ले जाने के एक linearized pCAG2LMKOSimO प्लाज्मिड के साथ मानव fibroblasts nucleofecting के बाद चार दिनों की पुष्टि की थी। PiPSC fibroblasts (2A चित्रा) की तुलना में जब एक स्पष्ट रूप से अलग फेनोटाइप प्रदर्शित और mRNA (चित्रा 2 बी) और प्रोटीन (चित्रा -2) का स्तर 10 पर 4 reprogramming के कारकों व्यक्त किया। एक PiPSC आधारित संवहनी भ्रष्टाचार की प्रभावकारिता दोनों endothelial और चिकनी पेशी प्रजातियों में अंतर करने के लिए PiPSC की क्षमता पर निर्भर है। यह 3 चित्रा। पोत ग्राफ्ट उत्पन्न करने के लिए उन्हें का उपयोग करने से पहले परिभाषित मीडिया में कोशिकाओं फर्क द्वारा इन विट्रो में PiPSC के इन गुणों की पुष्टि के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है (दोनों जीन (चित्रा 3 ए) में कार्यात्मक endothelial कोशिकाओं में अंतर करने के लिए PiPSC की क्षमता को दर्शाता है और प्रोटीन चित्रा 3 बी-डी) लेवएल्स, endothelial-विशिष्ट मार्करों 10 के आधार पर। इसी तरह, PiPSC भी विशिष्ट मीडिया (चित्रा 3E-एच) 11 के जवाब में चिकनी पेशी वंश में अंतर करने में सक्षम हैं।

पूरे महाधमनी decellularization एसडीएस, कोशिकाओं lyses और cytoplasmic घटकों solubilizes कि एक anionic डिटर्जेंट के साथ इलाज के द्वारा प्राप्त किया गया था। एक हौसले से काटा महाधमनी (चित्रा -4 ए-बी) 22 की तुलना में जब उपचार के 2 घंटे बाद, decellularized महाधमनी एक पारदर्शी अकोशिकीय पाड़ के रूप में दिखाई दिया। चित्रा 4C-एफ में histological मूल्यांकन नहीं बल्कि सामान्य माउस महाधमनी में, नाभिक या decellularized वाहिकाओं में cytoplasmic धुंधला के अभाव दिखाता है। PiPSC व्युत्पन्न endothelial और decellularized aortas भीतर चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के दोहरे बोने के बाद, इंजीनियर संवहनी ग्राफ्ट क्रमशः endothelial और चिकनी पेशी सेल गुण प्रदर्शित करते हैं। डबल-एस के hematoxylin और eosin (एचई) धुंधलाचिकनी मांसपेशी 22α (SM22), चिकनी मांसपेशियों-α actin के लिए सकारात्मक धुंधला (SMA) के द्वारा की पुष्टि के रूप में eeded ग्राफ्ट चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं की एक monolayer की कई परतों के साथ देशी वाहिकाओं (चित्रा 4 जी) के समान एक वास्तुकला का पता चला क्रमश: (चित्रा 4H-एम) 11 CD31 और CD144 मार्करों।

Vivo में ऊतक इंजीनियर जहाजों की प्रत्यक्षता की पुष्टि करने के लिए, डबल वरीयता प्राप्त PiPSC व्युत्पन्न जहाजों चूहों में grafted थे - सामान्य माउस और decellularized धमनियों दोनों नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। बाद के विश्लेषण के चूहों के रूप में जल्दी दिन एक के रूप में स्पष्ट रूप से उच्च मृत्यु दर के साथ प्रस्तुत decellularized वाहिकाओं के साथ grafted है, जबकि PiPSC पोत ग्राफ्ट 3 सप्ताह 11 प्रत्यारोपण (चित्रा 5A) के बाद 60% की जीवित रहने की दर से नवाजा दिखाया। साथ ही, तीन सप्ताह पुरानी PiPSC व्युत्पन्न ग्राफ्ट पूरी तरह से मानव PiPSC व्युत्पन्न endothelial की उपस्थिति के लिए विशेषता थे और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और मेजबान बृहतभक्षककोशिका घुसपैठ (चित्रा 5 ब और तालिका 1) 11। साथ में ले ली, परिणाम PiPSC दोनों संवहनी प्रजातियों में अंतर करने की क्षमता है और इन विवो में देशी जहाजों स्थानापन्न कर सकते हैं कि कार्यात्मक ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं पैदा करने के लिए शक्तिशाली हैं कि संकेत मिलता है।

चित्र 1
Decellularized भ्रष्टाचार बायोरिएक्टर प्रवाह सर्किट के 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा। Decellularized पोत भ्रष्टाचार ऊष्मायन कक्ष में इकट्ठा किया है। एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप स्थिर मध्यम छिड़काव प्रवाह प्रदान करने के लिए ऊष्मायन चैम्बर के अपस्ट्रीम में है। मीडिया जलाशय ऊष्मायन चैम्बर के बहाव पर है। अनुपालन चैम्बर प्रवाह शासन में सुधार है। प्रवाह की दिशा तीर द्वारा संकेत दिया है।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा मानव fibroblasts से PiPSC 2. जनरेशन। मानव fibroblasts या तो चार reprogramming जीन के साथ nucleofected गया (OCT4, Sox2, KLF4 और सी-MYC) या एक खाली वेक्टर (नियंत्रण)। (ए) चरण विपरीत तस्वीर 4 दिनों के बाद पिप्स के morphology दिखा। PiPSC mRNA के (बी) और प्रोटीन (सी) के स्तर पर सभी चार प्रतिलेखन कारक, दोनों व्यक्त किया। दिखाया छवियों के लिए पैमाने बार 50 माइक्रोन कर रहे हैं और डेटा की SEM ± साधन हैं (एन = 3); * पी <0.05, *** पी <0.001। यह आंकड़ा Margariti, ए एट अल से संशोधित किया गया है। 10 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। </ एक>

चित्र तीन
PiPSC दोनों endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं चित्रा 3.। PiPSC या नियंत्रण कोशिकाओं endothelial कोशिकाओं में भेदभाव कर रहे थे। कोशिकाओं को नियंत्रित करने के लिए इसकी तुलना में (ए), endothelial कोशिकाओं PiPSC व्युत्पन्न ऐसे CD31, CD144, काइनेज डालने डोमेन रिसेप्टर (KDR), mRNA पर एन्दोथेलिअल नाइट्रिक ऑक्साइड सिन्थेज़ (एनोस) और वॉन Willebrand कारक (vWF) के रूप में एन्दोथेलिअल-विशिष्ट मार्करों व्यक्त स्तर। (ख) इस पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग प्रोटीन के स्तर पर पुष्टि की गई। (सी) immunofluorescence धुंधला CD144 PiPSC-एन्दोथेलिअल में (VE-cadherin) के सकारात्मक धुंधला संकेत दिया है, लेकिन कोशिकाओं को नियंत्रित नहीं। (डी) प्रवाह cytometric विश्लेषण CD31 और CD144 के PiPSC-endothelial सेल अभिव्यक्ति की पुष्टि की। कोलेजन चतुर्थ वरीयता प्राप्त PiPSC (या नियंत्रण सेल) भी में भेदभाव कर रहे थेचिकनी मांसपेशी कोशिकाएं। (ई, एफ) कोशिकाओं को नियंत्रित करने के विपरीत, PiPSC व्युत्पन्न चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं एसएमए, calponin, SM22, चिकनी पेशी मायोसिन भारी श्रृंखला द्वितीय (SMMHC), सीरम प्रतिक्रिया कारक (एसआरएफ) सहित जीन स्तर पर चिकनी पेशी विशिष्ट मार्करों व्यक्त , myocardin, smoothelin, इलास्टिन और कोलेजन 1A1। (जी) PiPSC व्युत्पन्न कोशिकाओं में SMA, calponin और SM22 की अभिव्यक्ति के स्तर पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करने की पुष्टि की थी। Confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग (एच) immunofluorescence धुंधला calponin और SM22 के लिए एक विशिष्ट चिकनी पेशी मार्कर धुंधला दिखाया। डाटा SEM के ± साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 3); * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001। दिखाया छवियों के लिए पैमाने बार 25 माइक्रोन या 50 माइक्रोन कर रहे हैं। ये आंकड़े Margariti, ए एट अल। 10 और Karamariti, एट अल। 11 ई से संशोधित किया गया है कृपयाइस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
डबल वरीयता प्राप्त PiPSC व्युत्पन्न ऊतक इंजीनियर संवहनी grafts के चित्रा 4 जनरेशन। (ए, बी) माउस वक्ष महाधमनी के Decellularization इसकी संरचना संरक्षित है और अभी भी मची कि एक सामान्य पोत, मूल बढ़ाई 2X की। 50X या 200X: नियंत्रण, मूल बढ़ाई जब की तुलना में decellularized महाधमनी के (सीएफ) वह धुंधला सफल decellularization और कोशिकाओं के पूरी तरह हटाने की पुष्टि की। PiPSC व्युत्पन्न endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (G) वह धुंधला डबल वरीयता प्राप्त वाहिकाओं एक देशी पोत के समान था कि एक वास्तुकला का पता चला। (जम्मू, एम) एन्दोथेलिअल (CD31 और CD144) के लिए सकारात्मक दाग डबल वरीयता प्राप्त PiPSC ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं (SM22 और SMA) Dece विपरीत मार्करोंllularized पोत ग्राफ्ट। (एच, कश्मीर) संवहनी मार्कर के रूप में अच्छी तरह से PiPSC व्युत्पन्न endothelial और औसत दर्जे का है और intimal क्षेत्रों के भीतर चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की विशेषता आकृति विज्ञान और स्थानीयकरण के सहवर्ती अभिव्यक्ति देशी जहाजों के बराबर था। दिखाया छवियों के लिए पैमाने बार 50 माइक्रोन कर रहे हैं। ये आंकड़े Tsai, टी एट अल। 22 और Karamariti, ई एट अल से संशोधित किया गया है। 11 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. डबल वरीयता प्राप्त PiPSC व्युत्पन्न ऊतक इंजीनियर संवहनी ग्राफ्ट विवो में देशी जहाजों प्रतिस्थापन के लिए पेटेंट हैं। PiPSC व्युत्पन्न वाहिकाओं गंभीर संयुक्त इम्यूनो की मन्या धमनी (SCID) चूहों, सामान्य समझौता ज्ञापन में grafted गयाएसई और decellularized धमनियों नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया। PiPSC व्युत्पन्न वाहिकाओं के साथ grafted चूहों की (ए) के विश्लेषण जीवित रहने की दर 3 सप्ताह के बाद सर्जरी में 60% से पता चला है, स्पष्ट रूप से उच्च मृत्यु दर और कम अस्तित्व (20%) के साथ प्रस्तुत decellularized वाहिकाओं के साथ grafted चूहों जबकि। डेटा (एन = 10) का अर्थ है प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) के ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं भी कलम बांधने का काम करने के बाद 3 सप्ताह काटा और वह (छोड़ा पैनल) या मानव CD144 और calponin या माउस CD11b / CD18 (मैक-1) की उपस्थिति के लिए immunofluorescence धुंधला (सही पैनल) के अधीन थे; धुंधला की मात्रा का ठहराव 1 टेबल में संक्षेप है। कहा गया है कि जब तक दिखाया छवियों के लिए मूल बढ़ाई 400X हैं। यह आंकड़ा Karamariti से संशोधित किया गया है, ई एट अल। 11 इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सकारात्मक कोशिकाओं फील्ड (40X) ग्राफ्टिंग से पहले इंजीनियर-पोत इंजीनियर-पोत भ्रष्टाचार (3 सप्ताह)
calponin 72 ± 9 22 ± 11 *
CD144 20 ± 8 5 ± 6 *
मैक-1 0 71 ± 11 *

3 सप्ताह कलम बांधने का काम करने के बाद ऊतक इंजीनियर जहाजों की तालिका 1 विशेषता। PiPSC व्युत्पन्न endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और मेजबान मैक्रोफेज की संख्या मानव calponin साथ immunofluorescence धुंधला निम्नलिखित मात्रा निर्धारित किया गया था, मानव CD144 और माउस मैक-1 क्रमशः। डाटा SEM के ± मतलब का प्रतिनिधित्व करता है (एन = 6); * पी <0.05, कलम बांधने का काम पहले ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं से महत्वपूर्ण अंतर है। इस तालिका में Karamariti, ई एट अल से संशोधित किया गया है। 11

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Discussion

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मौजूदा प्रोटोकॉल कार्यात्मक ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं मानव fibroblasts से PiPSC का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है, जिसमें एक ध्वनि, तेज, सरल, कुशल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने की रणनीति का संकेत है। इस तकनीक को निकट भविष्य में पुनर्योजी चिकित्सा, ऊतक इंजीनियरिंग और संभावित रोगी विशेष सेल थेरेपी के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है। प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण कदम संवहनी बायोरिएक्टर में PiPSC की तैयारी, बाँझ और पूरी तरह से decellularized महाधमनी ग्राफ्ट, scaffolds में PiPSC के सफल बोने और भेदभाव की तैयारी और महाधमनी grafts के बनाए रखने के बाँझपन शामिल हैं।

ऊतक इंजीनियर grafts के सफल पीढ़ी को आरंभ करने के लिए, यह PiPSC की तैयारी के लिए प्रभावी ढंग से किया जाता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एक pCAG2LMKOSimO OSKM प्लाज्मिड के साथ nucleofection के माध्यम से PiPSC में एक मानव तंतुप्रसू सेल लाइन 'reprogrammed' है। survivnucleofection के बाद fibroblasts की अल ऐसी उच्च गुणवत्ता OSKM plasmids के उपयोग के रूप में कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर निर्भर करता है, 500 के बीच लेकर सांद्रता के प्लास्मिड - कोशिकाओं की शुरूआत के बाद विशेष रूप से संवेदनशील के रूप में 1000 एनजी / μl तुरंत nucleofection के बाद fibroblasts की बोने में देरी से बचने अंत में अपेक्षाकृत बड़े प्लास्मिड और महत्वपूर्ण है और बस का उपयोग करने से पहले हौसले से तैयार मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए जो FGF-2 के अलावा। इसके अतिरिक्त, हम यह endothelial और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं में PiPSC और बाद में भेदभाव में कुशल 'reprogramming' सुनिश्चित करने के लिए पारित होने से 9 तक, replicative वार्धक्य से बचने के लिए ऊपर की कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण था पाया। PiPSC की पवित्रता neomycin साथ nucleofected कोशिकाओं के चयन से सुधार किया जा सकता है। pCAG2LMKOSimO प्लाज्मिड का एक शुद्ध आबादी के चयन में परिणाम होगा एक neomycin प्रतिरोधी जीन और तीन दिनों के लिए nucleofection के बाद 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / एक दिन की एक श्रेणी में neomycin के इस प्रकार के अलावा हैPiPSC। चूहों में कलम बांधने का काम के लिए एक कुशल PiPSC पोत इंजीनियर को, हम decellularized aortas की अखंडता और बाँझपन सर्वोच्च प्राथमिकता का माना जाता है। पहले aortas की अखंडता को बनाए रखने और लगातार वे अपेक्षाकृत कमजोर और आकार में काफी छोटा थे, के रूप में जहाजों से निपटने whilst के मैनुअल निपुणता लागू करने के लिए decellularization के बाद, यह आवश्यक था। परिवाहकीय ऊतक और एक द्विध्रुवी विद्युत coagulator का उपयोग कर शाखाओं में बंटी धमनियों की सीलिंग के कुशल हटाने के बाद सक्षम सेल बोने सुनिश्चित करने के लिए और मीडिया के रिसाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण था। किसी भी बिंदु पर, हम सभी सामग्री और उपकरण बायोरिएक्टर (यानी, संदंश, ट्यूब, बोतलें, कक्षों, कैंची, एडेप्टर और कनेक्टर्स) इस प्रकार जीवाणु संक्रमण और सर्जरी से पहले संवहनी ग्राफ्ट की असफलता के जोखिम को कम करने, autoclavable थे उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि यह सुनिश्चित किया ।

मौजूदा प्रोटोकॉल हृदय डीआईएसई में आशाजनक नैदानिक ​​अनुप्रयोगों धारण whilstases, आगे कार्यप्रणाली को बढ़ाने के लिए निकट भविष्य में सुधार किया जाना चाहिए जो कुछ सीमाएं हैं। इस प्रकार अब तक, OSKM प्रतिलेखन कारक nucleofection के माध्यम से मानव fibroblasts में शुरू किए गए थे। इस तकनीक अपेक्षाकृत सरल और सीधा है, यह भी अलग अलग प्रयोगात्मक समय पर चर अभिकर्मक क्षमता में हुई। उल्लेखनीय है कि इस विसंगति के aforementioned neomycin चयन की एक अतिरिक्त कदम शुरू करने से दूर किया जा सकता है। इसी तरह, एक संभावित संक्रमण के बाद कोशिकाओं के अस्तित्व 'reprogramming' की दक्षता बढ़ाने के लिए और बढ़ाने के लिए हो सकता है जो lentivirus के एकीकरण का उपयोग करते हुए मानव fibroblasts में चार कारकों की शुरूआत करने पर विचार कर सकता है। बायोरिएक्टर के संदर्भ में, हम aortas की पूरी decellularization 0.075% एसडीएस का प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है कि मिल गया। इस तकनीक सेल को हटाने के लिए इष्टतम माना जाता था हालांकि अन्य डिटर्जेंट (जैसे, ट्राइटन X-100), यह हालांकि पी कारण हो सकता है की तुलना मेंबाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन 23 की अल्ट्रा संरचनाओं के भीतर otential है परिवर्तन। यह घटना इसलिए जुड़े बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन का विघटन कम करने के लिए और अधिक कुशल decellularization रणनीतियों वारंट। इसके अतिरिक्त, हम भी decellularized aortas के व्यास और दीवार मोटाई उनकी उम्र, तनाव और पृष्ठभूमि के आधार पर, चूहों के बीच भिन्नता है, और इस तरह बायोरिएक्टर भीतर प्रवाह और कतरनी तनाव की गति और PiPSC बोने निम्नलिखित PiPSC के वितरण में संभावित मतभेद का कारण माना जाता है कि । यह सब स्पष्ट किया जाना बना रहता है।

इस प्रोटोकॉल के साथ साथ हृदय रोग के लिए स्टेम सेल थेरेपी में भविष्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए एक आशाजनक संभावित पकड़ कि PiPSC का उपयोग कर कार्यात्मक ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट की पीढ़ी का वर्णन किया। लंघन द्वारा एक और (एन्दोथेलिअल या चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं या तो) के लिए एक दैहिक वंश (fibroblasts) से प्रत्यक्ष reprogramming के इस्तेमाल करता है जो इस प्रक्रिया को pluripotency ब्याज की सुरक्षित और उपयुक्त कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक तरीका हो सकता है। दरअसल, कई प्रोटोकॉल हालांकि अभी भी क्लिनिक में उनके उपयोग के संबंध के साथ मुद्दों के विषय में बढ़ा है, जो सभी के मानव भ्रूण, आईपीएस कोशिकाओं और वयस्क स्टेम कोशिकाओं को 24-26 से स्टेम सेल लाइनों की पीढ़ी का वर्णन करने के लिए प्रकाशित किया गया है। अब यह PiPSC इस प्रकार ट्यूमर गठन की चिंता को दूर करने, SCID चूहों में teratomas विकसित नहीं है कि जाना जाता है। इसके अलावा, कोशिकाओं को उत्पन्न, संस्कृति और 10,11 अंतर करने के लिए एक काफी कम समय लगेगा, और देशी aortas करने के लिए तुलना कर रहे हैं कि सफल और कार्यात्मक ऊतक इंजीनियर वाहिकाओं ग्राफ्ट उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, (त्वचा से जैसे,) fibroblasts के एक विशिष्ट व्यक्ति से प्राप्त किया जा सकता है क्योंकि व्यक्तिगत सेल थेरेपी का प्रयोग रोगियों के उपचार के लिए एक आशाजनक सेल स्रोत के रूप में PiPSC मौजूद। इस प्रोटोकॉल में decellularised पोत प्रणाली एक extracellul के साथ वरीयता प्राप्त कोशिकाओं प्रदान करता है कि एक अधिक biomimetic मॉडल प्रदान करता हैएक देशी महाधमनी 11 की है कि अधिक प्रतिनिधि है कि गिरफ्तारी मैट्रिक्स प्रोटीन। इन महत्वपूर्ण बिंदुओं उसके बाद वरीयता प्राप्त कोशिकाओं और ऊतकों इंजीनियर वाहिकाओं के अस्तित्व, भेदभाव और कार्यक्षमता को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। Sumitran-Holgersson और उनके सहयोगियों द्वारा हाल के एक अध्ययन इस प्रकार निकट भविष्य में मनुष्यों में मौजूदा प्रोटोकॉल की एक translational मूल्य postulating, 27 engraftment करने से पहले एक मृत व्यक्ति से एक पहले से decellularized illiac नस भ्रष्टाचार के एक सफल repopulation का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, decellularized पोत ग्राफ्ट भूमिका और भी ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट में योगदान देने वाले अन्य संवहनी प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार का आकलन किया जा सकता है, जिसमें एक अच्छा मॉडल प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। चूहों में इस मॉडल प्रणाली भविष्य दवा स्क्रीनिंग के लिए और भी संवहनी स्टेम कोशिका जीव विज्ञान में शामिल सेलुलर और आणविक तंत्र elucidating में एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान कर सके। साथ में ले ली, मौजूदा प्रोटोकॉल vasc में अपने आवेदन के लिए होनहार मूल्य रखती हैular ऊतक इंजीनियरिंग और व्यक्तिगत चिकित्सा में एक सफलता।

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Disclosures

लेखकों कोई परस्पर विरोधी वित्तीय हितों की है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Fibroblasts CCL-153 ATCC CCL-153 Prenatal human embryonic fibroblasts
ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) ATCC 30-2004
Fetal Bovine Serum ATCC 30-2020
Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells Life technologies (Gibco) 12660-012
Knockout Serum Replacement Life technologies (Invitrogen) 10828-028
Human Basic FGF-2  Miltenyi Biotech 130-093-837
alpha-MEM medium Life technologies (Invitrogen) 32571093
Human PDGF R&D System 120-HD-001
Gelatin Solution 2% Sigma G1393
Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) Addgene 20866
 PvuI Restriction Enzyme New England Biolabs RO150S
SureClean Plus Bioline BIO-37047
Nucelofection Kit (NHDF Kit) LONZA VPD-1001
Neomycin SIGMA G418
KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy SCHOTT KL 1500 LCD Cold light illumination for stereo microscopy
Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 Nikon SMZ800
Heparin sodium salt Sigma H3393
10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent Severn Biotech CAS 151-21-3
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D8537
Matrigel (10mg/ml) BD A6661
Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7  Jepson Bolton's, Janke&Kunkel S32-102
Masterflex L/S Digital Pump Drive Cole-Parmer WZ-07523-80
Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head Cole-Parmer EW-07519-15
Masterflex L/S large cartridges for pump head Cole-Parmer EW-07519-75
Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft Cole-Parmer  WZ-96410-14 Tubing goes through the peristaltic pump
0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing SILEX N/A Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber 
Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline Ibidi 10829 Adapter connect above two types of tubings
1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK LabSmith T-132-010P Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing
One-Piece Fittings  LabSmith T-132-100 Fix the above tubings through the incubation chamber wall
Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm)  Smiths Medical N/A Tubings insert into two ends of the aorta graft
NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse Charles River
Surgical sutures, 8-0  silk ETHICON W819
Hypnorm Vetapharm Vm21757/4000 Neuroleptanalgesic for use in mice
Hypnovel (Midazolam) Roche 59467-70-8 Induction of anaesthesia
Dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000
Nylon Tubing Portex LTD 800/200/100/200 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff
Electrocoagulator Martin  SN 54.131 Ligation of artery branches on aorta
Bipolar micro hemostat forceps Martin 80-91-12-04 Fixation of vessel ends
Vessel Dilator S&T JFX-7
Vessel Dilator S&T JFL-3dZ
Vessel Dilator S&T D-5aZ
Mini applier  AESCULAP FE572K
Micro hemostats clips AESCULAP FE720K
Surgical sutures, 6-0 VICRYL ETHICON V489

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References

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एक माउस मॉडल में ऊतक इंजीनियर वेसल्स का सृजन और कलम बांधने का काम
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Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (97), e52565, doi:10.3791/52565 (2015).More

Wong, M. M., Hong, X., Karamariti, E., Hu, Y., Xu, Q. Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model. J. Vis. Exp. (97), e52565, doi:10.3791/52565 (2015).

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