Generation och Nagelvävnadstekniska Fartyg i en musmodell
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera vävnadstekniska fartygs transplantat som är funktionella för ympning i möss genom att dubbel sådd delvis inducerade pluripotenta stamceller (PiPSC) – härrör glatta muskelceller och PiPSC – härledda endotelceller på en decellulariserad kärl klätterställning bioreaktor.
Abstract
The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.
Introduction
Byggandet av vaskulära ledningar är en grundläggande strategi för kirurgisk reparation av skadade och skadade fartyg till följd av hjärt-kärlsjukdomar. Hittills transplantat material som används vid kirurgi inkluderar biokompatibla syntetiska polymerer (polytetrafluoretylen [Teflon], expanderad polytetrafluoretylen [ePTFE, Gore-Tex] eller polyetylentereftalat [Dacron]), allografter, autolog vävnad (hjärtsäcken eller saphenusvenen) och xenotransplantat en. Även konstgjorda transplantat (t.ex. Gore-Tex och Dacron) är vanligast, dessa material orsakar troligen många kort- och långsiktiga komplikationer som inkluderar stenos, kalcium nedfall, tromboembolism embolisering och infektioner. Även patienter med biologiska transplantat närvarande med minskad tromboemboliska händelser, de fortfarande stöter begränsningar som sekundärt misslyckande transplantat och förkortad livslängd på grund av förkalkning nedbrytning 2. Därför, trots betydande förbättringar i kirurgisk techniques under åren, forskare och kliniker fortfarande belastas med behovet av att identifiera den perfekta kanalen för kärlsjukdomar. På senare tid har forskningsfältet vaskulär vävnadsteknik genererat ett koncept där celler införlivas i biologiskt nedbrytbara ställningar, med målet att skapa en biomimetisk miljö som sammanfattar en funktionell kärl för lyckad ympning 1. I grund och framgången för de vaskulära konstruktioner beror på tre viktiga komponenter; celler som innehåller byggnadsställningen, dvs en endotelcell inre skikt och ett glatt muskelcellskikt, en byggnadsställning innehållande den lämpliga extracellulära matrisen för att tillhandahålla mekaniska egenskaper jämförbara med den nativa vaskulaturen, och molekyl / cellulär signalering som krävs för att initiera / reglerande reparation.
Långsiktig transplantat öppenhet och hållbar utveckling av de neo-vävnader är starkt beroende av en effektiv cellsådd av byggnadsställningar, thereby rendering beslutet av celltyp av kritisk betydelse. Flera rapporter demonstrera användningen av mogna endotelceller och glatta muskelceller från olika källor för att utveckla ledningar 3-6 med liten diameter. Även lovande, av bristen på tillräckliga autologa fartyg få mogna endotelceller och glatta muskelceller förblir en betydande belastning. På senare tid har stamceller från olika källor har utnyttjats för vaskulära vävnadstekniska tillämpningar. Faktum en mängd olika typer stamcells inklusive embryonala stamceller 7, inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) 8,9, PiPSC 10,11, benmärg-härledda mononukleära celler 12, mesenkymala stamceller 13, endotelceller progenitorceller och vuxenkärlväggs härledd stamcellantigen-1 (Sca-1) + stam / progenitorceller 14,15 har alla visat sig vara kapabel att differentiering till antingen funktionell endotelceller eller glatta muskelceller som svar på definierade media ochodlingsbetingelser. Dessutom obegränsad självförnyelse kapacitet stamcellerna gör dem bättre kandidater till skillnad mogna endotelceller och glatta muskelceller som bara kan dela ett ändligt antal gånger innan de genomgick tillväxtstopp och åldrande.
Valet av byggnadsställningsmaterial för att generera framgångsrik vävnadsutvecklad kärl för ympning beror på flera faktorer, såsom biokompatibilitet, biomekaniska egenskaper, och graden av biologisk nedbrytning. I grund och botten material som används för att skapa byggnadsställningar för ympkvistar ska vara biologiskt nedbrytbara och kommer inte montera onödig mottagande immunsvar. Dessutom måste det omfatta en lämplig porositet och mikrostruktur för cellbindning och efterföljande överlevnad. Hittills de vanligaste materialen som används för byggnadsställningar i vaskulär vävnadsteknik omfattar polymerer av polyglykolsyra, polymjölksyra och poly ε-kaprolakton 16. På senare tid, decellulariserade biologiska material haräven tillämpats med viss framgång. Flera laboratorier har visat att sådd decellulariserad människa, hund eller svin fartyg med autologa celler som en biologisk transplantat som motstod koagulering och intimahyperplasi 17-19. Andra strategier i vaskulär vävnadsteknik inkluderar extracellulära matrixproteiner baserade kärltransplantat t.ex. sådd celler i fibringel 13 och genererar cellblad utan ställningsstöd 20, 21.
Det nuvarande protokollet visar differentieringen av humana PiPSC till funktionell endotel och glatta muskelceller, generering av en bioreaktor som består av en decellulariserad kärl scaffold att hysa funktionella PiPSC-härledda vaskulära celler, och ympning av vävnadstekniska kärlen i allvarlig kombinerad immunbrist (SCID ) möss. PiPSC är en optimal celltyp som ska användas för vävnadsteknik av fartygs transplantat eftersom dessa celler inte bildar tumörer hos möss eller höja etiska ochallo-immunresponser. Vidare har vi visat att strategin för att generera Pips-endotelceller och kärnor-glatta muskelceller är effektiv och reproducerbar 10,11. Därefter utformade vi en decellulariserad kärl för sådd av PiPSC-härledda vaskulära celler att noga efterliknar matrixproteiner som finns inom en infödd kärl, och därmed stärka ympning och överlevnad effekt. Dessutom decellularisering av fartygen före PiPSC sådd förhindrar uppkomsten av inflammatoriska svar monteras immuncelltyper såsom makrofager. Ännu viktigare, innebär detta protokoll inte bara utgör en metod för att generera lovande vaskulära ledningar för översättning till människor, men ger också värdefullt sätt att studera och förstå de molekylära mekanismer som styr kärlvävnadsregenerering genom musmodeller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuvarande protokollet visar ett ljud, snabb, enkel, effektiv och reproducerbar strategi där funktionella vävnadstekniska fartyg kan genereras med PiPSC från humana fibroblaster. Denna teknik representerar ett värdefullt verktyg för regenerativ medicin, vävnadsteknik och potentiellt patientspecifik cellterapi inom den närmaste framtiden. Kritiska åtgärder för att säkerställa effektiviteten av protokollet inbegripa förberedelse av PiPSC, beredning av sterila och fullt decellulariserade aorta transplantat,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by The British Heart Foundation and The Oak Foundation.
Materials
| Human Fibroblasts CCL-153 | ATCC | CCL-153 | Prenatal human embryonic fibroblasts |
| ATCC F-12K Medium (Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium) | ATCC | 30-2004 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 30-2020 | |
| Knockout DMEM medium optimized for embryonic stem cells | Life technologies (Gibco) | 12660-012 | |
| Knockout Serum Replacement | Life technologies (Invitrogen) | 10828-028 | |
| Human Basic FGF-2 | Miltenyi Biotech | 130-093-837 | |
| alpha-MEM medium | Life technologies (Invitrogen) | 32571093 | |
| Human PDGF | R&D System | 120-HD-001 | |
| Gelatin Solution 2% | Sigma | G1393 | |
| Plasmid 20866: pCAG2LMKOSimO (SOX2, OCT4, KLF4, C-MYC) | Addgene | 20866 | |
| PvuI Restriction Enzyme | New England Biolabs | RO150S | |
| SureClean Plus | Bioline | BIO-37047 | |
| Nucelofection Kit (NHDF Kit) | LONZA | VPD-1001 | |
| Neomycin | SIGMA | G418 | Selection of |
| KL 1500 LCD, Illumination for Stereo Microscopy | SCHOTT | KL 1500 LCD | Cold light illumination for stereo microscopy |
| Nikon Zoom Steromicroscope SMZ800 | Nikon | SMZ800 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| 10% SDS Stock Solution Molecular Biology Reagent | Severn Biotech | CAS 151-21-3 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Matrigel (10mg/ml) | BD | A6661 | |
| Shaker IKA Vibrax with Shaking platform VX 7 | Jepson Bolton's, Janke&Kunkel | S32-102 | |
| Masterflex L/S Digital Pump Drive | Cole-Parmer | WZ-07523-80 | |
| Masterflex L/S 6-channel, 6-roller cartridge pump head | Cole-Parmer | EW-07519-15 | |
| Masterflex L/S large cartridges for pump head | Cole-Parmer | EW-07519-75 | |
| Masterflex platinum-cured silicone pump tubing, L/S 14, 25 ft | Cole-Parmer | WZ-96410-14 | Tubing goes through the peristaltic pump |
| 0.5mm ID, 0.8 mm OD Silicone Tubing | SILEX | N/A | Tubings connect incubation chamber, media reservoir and compliance chamber |
| Fitting Reducer 0.5 to 1.6, natural Polypropyline | Ibidi | 10829 | Adapter connect above two types of tubings |
| 1/32" Tubing, ID 0.01" (250µm) Material: PEEK | LabSmith | T-132-010P | Tubing through the incubation chamber wall which connects the graft with outside tubing |
| One-Piece Fittings | LabSmith | T-132-100 | Fix the above tubings through the incubation chamber wall |
| Nylon tubes (OD 0.9mm, ID 0.75mm) | Smiths Medical | N/A | Tubings insert into two ends of the aorta graft |
| NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mouse | Charles River | ||
| Surgical sutures, 8-0 silk | ETHICON | W819 | |
| Hypnorm | Vetapharm | Vm21757/4000 | Neuroleptanalgesic for use in mice |
| Hypnovel (Midazolam) | Roche | 59467-70-8 | Induction of anaesthesia |
| Dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Nylon Tubing | Portex LTD | 800/200/100/200 | 0.65 mm in diameter and 1 mm in length; to make artery cuff |
| Electrocoagulator | Martin | SN 54.131 | Ligation of artery branches on aorta |
| Bipolar micro hemostat forceps | Martin | 80-91-12-04 | Fixation of vessel ends |
| Vessel Dilator | S&T | JFX-7 | |
| Vessel Dilator | S&T | JFL-3dZ | |
| Vessel Dilator | S&T | D-5aZ | |
| Mini applier | AESCULAP | FE572K | |
| Micro hemostats clips | AESCULAP | FE720K | |
| Surgical sutures, 6-0 VICRYL | ETHICON | V489 |
References
- Kurobe, H., Maxfield, M. W., Breuer, C. K., Shinoka, T. Concise Review: Tissue-Engineered Vascular Grafts for Cardiac Surgery: Past, Present, and Future. Stem Cells Transl Med. 1 (7), 566-571 (2012).
- Jonas, R. A., Freed, M. D., Mayer, J. E. Long-term follow-up of patients with synthetic right heart conduits. Circulation. 72, II77-II83 (1985).
- Heureux, N., et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts-from research to clinical practice. Nat Clin Pract Cardiovasc Med. 4, 389-395 (2007).
- Zhang, W. J., Liu, W., Cui, L., Cao, Y. Tissue engineering of blood vessel. J Cell Mol Med. 11, 945-957 (2007).
- Cearbhaill, E. D., et al. Response of mesenchymal stem cells to the biomechanical environment of the endothelium on a flexible tubular silicone substrate. Biomaterials. 29, 1610-1619 (2008).
- Gong, Z., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 22, 1635-1648 (2008).
- Wong, M. M., et al. Over-expression of HSP47 augments mouse embryonic stem cell smooth muscle differentiation and chemotaxis. PLoS One. 9 (1), e86118 (2014).
- Park, S. W., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells into functional CD34+ progenitor cells by combined modulation of the MEK/ERK and BMP4 signaling pathways. Blood. 116, 5762-5772 (2010).
- Samuel, R., et al. Generation of functionally competent and durable engineered blood vessels from human induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 12774-12779 (2013).
- Margariti, A., et al. Reprogramming of fibroblasts into endothelial cells capacble of angiogenesis and reendothelialization in tissue-engineered vessels. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 13793-13798 (2012).
- Karamariti, E., et al. Smooth muscle cells differentiated from reprogrammed embryonic lung fibroblasts through DKK3 signaling are potent for tissue engineering of vascular grafts. Circ Res. 112, 1433-1443 (2013).
- Udelsman, B., et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng Part C Methods. 17 (7), 731-736 (2011).
- Cearbhaill, E. D., Murphy, M., Barry, F., McHugh, P. E., Barron, V. Behavior of human mesenchymal stem cells in fibrin-based vascular tissue engineering constructs. Ann Biomed Eng. 38 (3), 649-657 (2010).
- Wong, M. M., et al. Macrophages control vascular stem/progenitor cell plasticity through tumor necrosis factor-α-mediated nuclear factor-κB activation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (3), 635-643 (2014).
- Wong, M. M., et al. Sirolimus stimulates vascular stem/progenitor cell migration and differentiation into smooth muscle cells via epidermal growth factor receptor/extracellular signal-regulated kinase/β-catenin signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (10), 2397-2406 (2013).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Hung, H. S., Hsu, S. H. Current Advances of stem cell-based approaches to tissue-engineering vascular grafts. OA Tissue Engineering. 1 (1), 2 (2013).
- Quint, C., et al. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (22), 9214-9219 (2011).
- Zhang, X., Xu, Y., Thomas, V., Bellis, S. L., Vohra, Y. K. Engineering an antiplatelet adhesion layer on an electrospun scaffold using porcine endothelial progenitor cells. J Biomed Mater Res A. 97 (2), 145-151 (2011).
- Hibino, N., et al. Evaluation of the use of an induced puripotent stem cell sheet for the construction of tissue-engineered vascular grafts. J Thorac Cardiovasc Surg. 143 (3), 696-703 (2012).
- Zhao, J., et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif Organs. 36 (1), 93-101 (2012).
- Tsai, T., et al. Contribution of stem cells to neointimal formation of decellularized vessel grafts in a novel mouse model. Am J Pathol. 181 (1), 362-373 (2012).
- Kasimir, M. T., et al. Comparison of different decellularization procedures of porcine heart valves. Int J Artif Organs. 26 (5), 421-427 (2003).
- Stephenson, E., et al. Derivation and propagation of human embryonic stem cell lines from frozen embryos in an animal product-free environment. Nature Protocols. 7, 1366-1381 (2012).
- Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature Protocols. 2, 3081-3089 (2007).
- McCall, F. C., et al. Myocardial infarction and intramyocardial injection models in swine. Nature Protocols. 7, 1479-1496 (2012).
- Olausson, M., et al. Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet. 380 (9838), 230-237 (2012).
