Abstract
Både transkripsjons- og post-transkripsjonsregulering ha stor innvirkning på genene uttrykk. Men vanligvis er vedtatt cellebaserte screeningsanalyser fokusere på transkripsjonsregulering, idet i det vesentlige rettet mot identifisering av promotor-målsøkende molekyler. Som et resultat, er post-transkripsjonelle mekanismer som i stor grad avdekket av genekspresjon målrettet medikamentutvikling. Her beskriver vi et cellebasert assay som tar sikte på å undersøke rollen til det 3'-ikke-translatert region (3 'UTR) i modulering av skjebnen til sin mRNA, og ved å identifisere forbindelser i stand til å modifisere det. Forsøket er basert på bruk av et luciferase reporter konstruksjon inneholdende 3'-UTR av et gen av interesse stabilt integrert inn i en sykdomsrelevant cellelinje. Protokollen er delt i to deler, med en opprinnelig vekt på den primære screening med sikte på identifisering av molekyler som påvirker luciferase-aktivitet etter 24 timers behandling. Den andre del av protokollenbeskriver telleren-screening er nødvendig for å diskriminere forbindelser som modulerer luciferaseaktivitet bestemt gjennom 3 'UTR. I tillegg til den detaljerte protokollen og representative resultater, gir vi viktige betraktninger om analysen utvikling og validering av treffet (e) på den endogene målet. Den beskrevne cellebasert reporter genet analysen vil tillate forskere å identifisere molekyler moduler protein nivåer via post-transkripsjonsmekanismer avhengig av en 3 'UTR.
Introduction
I en lang periode transkripsjonen regulering av genekspresjon ble antatt å spille en viktig om ikke eksklusivt rolle i å kontrollere proteinproduksjon. Oppsamling av bevis tyder imidlertid på at post-transkripsjonell regulering bidrar like mye, om ikke mer enn, transkripsjonsregulering for å bestemme cellulær protein overflod 1,2. Post-transkripsjonen kontroll av genuttrykk er mye mer kompleks og forseggjort enn var først trodde. Faktisk har alle de forskjellige stadier av post-transkripsjonen kontroll dukket opp for å bli regulert, inkludert mRNA behandling, lokalisering, omsetning, oversettelse 3 samt den nylig beskrevet reversible RNA metylering 4. Fra en rekke post-transkripsjonelle reguleringsprosesser potensielt påvirket, beskrevet analysen nedenfor fokuserer på de som involverer mRNA 3 'ikke-translatert region (3' UTR). 3 'UTR bredt påvirker mRNA skjebne hovedsakelig via spesifikk interaksjon av RNA-bindende proteins og ikke-kodende RNA til sine regulatoriske sekvenser og / eller sekundære konstruksjoner 5. Derfor vil små molekyler som endrer disse interaksjoner eller forstyrre oppstrøms signaltransduksjonsveiene forskyve balansen som regulerer protein overflod. Denne terapeutiske tilnærmingen er av særlig betydning for humane patologier hvor det foreligger bevis som viser at sykdoms relevante gener er underkastet post-transkripsjonell regulering, som således utgjør et potensielt mål for farmakologisk intervensjon. Derfor kan systemer som åpner for screening av mRNA nivåer 'modulatorer gjennom interferens med post-transkripsjonskontrollmekanismer i en high-throughput formatet bli verdifulle verktøy i identifisering av potensielle nye behandlinger.
Den beskrevne cellebasert reportergen analysen muliggjør identifisering av forbindelser i stand til å modulere mRNA skjebne via mekanismer som er avhengige av den 3 'UTR. Den består av flere hoved components (figur 1), og krever noen innledende skritt for å validere gjennomførbarheten av analysen. Først av alt blir reporter-konstruksjonen er utformet for å omfatte 3'-UTR fra et gen av interesse. 3 'UTR er kondensert til enden av et reportergen, slik som ildflue-luciferase (figur 1). Eventuelle endringer i post-transkripsjonskontrollmekanismer som utøves gjennom satt inn 3 'UTR vil endre stabiliteten og / eller oversettelse effektiviteten av dette kimerisk avskrift, noe som resulterer i varierte luciferase nivåer. Derfor er, forandringer i luciferaseaktivitet tjene som indirekte mål på berørte post-transkripsjonell regulering av genet av interesse. Den andre komponent i systemet er en kontroll reporter konstruksjon, en identisk ekspresjonsplasmid som uttrykker det samme reportergenet, men ikke inneholder noen 3 'UTR. De to rapportør plasmider kan være utformet i laboratoriet ved hjelp av konvensjonelle molekylærbiologi protokoller eller kjøpes fra kommersielle kilder.
Utvelgelsen av en egnet cellelinje er kritisk for analysen konstruksjon. Hvilken cellelinje er den optimale modellen avhenger av mange faktorer som spenner fra kliniske krav som maksimal likhet med patologi å bare praktiske problemer som tilgjengelighet, transfectability, og vekstegenskaper. Viktigere, forut for å fortsette en bør sørge for at sammensmelting av 3 'UTR til reportergenet har en forventet effekt på nivået av det kimære transkript. Fraværet av signifikant forskjell i luciferase-signalet fra 3'-UTR-lageret og styre reporter konstruerer transient transfektert i de valgte cellene ville indikere at det 3'-UTR ikke er funksjonell i denne cellemodell, bekreftelse for leting etter alternative seg. For high-throughput-format, bør de 3 'UTR-bærende og kontroll luciferase reporter-konstruksjonene bli stabilt integrert i den valgte cellelinje. Ved hjelp av en stabilt integrert over transient transfektertcellelinje er å foretrekke av flere årsaker. Dette vil utvide valget av en cellulær modell inklusive vanskelige å transfeksjon av cellelinjer, reduserer variabiliteten i de data som følge av svingninger i transfeksjonseffektivitet, avta kostnadene. Dessuten, ved forbigående transfeksjon celler er svært ofte overbelastet med et DNA-plasmid som fører til metning av systemet. I disse innstillingene en ytterligere økning i reporter uttrykk kan være utfordrende, noe som resulterer i redusert følsomhet overfor potensielle upregulating forbindelser.
Til slutt, når alle assay-komponentene er satt opp, er det avgjørende før flytting til high-throughput-formatet for å bestemme gjennomførbarheten av analysen, dvs. hvis luciferase-aktivitet kan være faktisk opp- og ned-regulert spesielt via den innsatte 3 ' UTR. De beste kontrollene ville være små molekyler som er rapportert å modulere stabilitet eller translatability av mRNA gjennom 3 'UTR av interesse. Hvis det å ha disse erikke er mulig, er surrogat kontroller som imiterer den ønskede effekt akseptert. Disse kan være mirnas eller RNA-bindende proteiner som er kjent for å utøve sine effekter via binding til 3'-UTR av interesse. Evaluering av slike kontroller før den primære screening ikke bare indikerer funksjonaliteten til den utviklede assay, men også gir mulighet for estimering av sitt dynamiske område, følsomhet og ytelse i high-throughput-format.
Ved hjelp av den beskrevne protokollen vi vist en 2000-sammensatte bibliotek 6. Neuroblastom, den vanligste ekstrakraniell fast tumor hos spedbarn, ble anvendt som et biologisk modellen og 3 'UTR av MYCN onkogen, hvis forsterkning forut sterkt negative utfall av nevroblastom, som målgenet 7. Figur 2 beskriver den eksperimentelle oppsettet. Screeningen ble delt i tre forsøk med den satsstørrelse på 27 platene vist i ett løp. Batch av 27 plater inkludert Spectrum Collection bibliotekplater n.1-n.8 + N.25 (første løp), n.9-n.16 + N.25 (andre løp) og n.16-n.24 + N.25 (tredje løp), hver platen vist i triplikat. Dermed ble ett bibliotek plate (N.25) analyseres innen alle tre renner gjøre mulig inter-run sammenligning. Protokollen nedenfor beskriver et enkelt løp av 9 bibliotek plater testet i tre eksemplarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Gjennomstrømningen av slike analysesystemer avhenger av tilgjengelig HTS laboratorieutstyr. Denne protokollen er tilrettelagt av en Tecan Freedom EVO 200 robot som utfører væskehåndtering i 96-brønners format. Miniatyrisering til 384-brønnformat er også mulig. Robotvæskehåndteringssystemet er posisjonert under en laminær strømningshette for å opprettholde aseptiske betingelser under alle eksperimentelle trinn. Hvis ingen væske håndterings automatisering er tilgjengelig, kan protokoll lett tilpasses til lav-throughput-format.
Primær Screening
1. Dag 1: Forberede og Seed Cells
MERK: Seed celler for å gi 80% konfluens ved å analysere luciferaseaktivitet, dvs. 48 timer etter tilsetningen.
- Resuspender trypsinert CHP134-mycn3UTR neuroblastom-celler til en konsentrasjon på 2 x 10 5 celler / ml i RPMI inneholdende 10% FBS og 1% L-glutamin. For 27 plater forberede minst 250 ml cellesuspensjon tar hensyn til væskehåndtering, trau dødvolumer og gjentatte pipetteringstrinn. Hell cellesuspensjonen i sterilt reservoaret og plassere den på robotbordet.
- Plassere 9 strekkode hvite flatbunnede 96-brønners plater og en boks med 200 mL sterile pipettes tips om roboten pulten. Bland cellesuspensjonen ved pipettering før hver dispensasjon skritt for å unngå celler settling under gravitasjon. Dispenser 75 ul celler til hver brønn i platene 9 for å få en endelig tetthet på 1,5 x 10 4 celler pr brønn.
- Dekk platene med lokkene og la dem utenfor inkubatoren i 30 min for å tillate cellene å sedimentere til bunnen av brønnen. Dette vil redusere kanteffekter.
- Gjenta trinn 1,2 og 1,3 to ganger for å forberede et totalt antall på 27 plater.
- Plasserer platene ved 37 ° C og 5% CO2, og inkuber i 24 timer.
2. Dag 2: Unn Celler med bibliotek Forbindelser
ntent "> MERK: Spectrum Collection lite molekyl bibliotek består av 2000 forbindelser arrangert i åtte rader og 10 kolonner i 25 96-brønners plater på konsentrasjon på 10 mM i DMSO Brønnene på den første og siste kolonnene blir stående tom for kontroller. . Forbindelse screeningsanalyser blir typisk utført ved 1-10 uM konsentrasjon av forbindelsen 8. Screening-protokollen beskrevet her løser 2 uM som arbeidskonsentrasjon og 24 timer, hvorved analyse endepunkt.- Tine 9 sammensatte bibliotek plater ved romtemperatur.
- Forbered to trau med steril PBS og PBS-0,5% DMSO løsninger og plassere dem på robotbordet. For hvert bibliotek plate, forberede og merke tilsvarende ett fortynning plate - en polypropylen U-bunn 96-brønns plate med et arbeidsvolum på minst 400 mL. Fyll hver brønn av kolonnene 2 til 11 av utvannings plater med 398 mikroliter sterilt PBS ved hjelp av flytende førers faste tips. Fyll kolonne 1 og 12 med 50 mikroliter sterilt PBSmed 0,5% DMSO for å reprodusere kjøretøyet konsentrasjonen i kontrollbrønnene (0,02%).
- Plassere to bibliotek plater, de tilsvarende merket utvannings plater, to esker med 50 mL sterilt pipettespisser og seks celler plater på robotbordet. Avdekke celler plater.
- Pipetter 2 ul av 10 mM stamløsning fra en av to biblioteksplater i tilsvarende fortynning plate og bland godt. Dette vil resultere i en mellomliggende forbindelser konsentrasjon på 50 uM. Ved å bruke samme sett av tips, dispensere 3 pl av 50 pM fortynning i 3 strekkode hvite 96-brønners plater med celler. Denne fortynningen ordningen resulterer i 2 uM arbeids konsentrasjon av hver testet forbindelse.
MERK: For å unngå unødvendige manipulasjoner med tips, kan du bruke et komplett sett med 96 tips fra begynnelsen, selv om biblioteket plater inneholder bare 80 forbindelser. Dette er mulig siden de første og siste kolonnene i biblioteket platene er tom. - Erstatte pipettespisser og gjenta Step 2.4 for det andre biblioteket plate.
- Dekk cellene plater og returnere dem til inkubatoren i 24 timer.
- Gjenta trinn 02.03 til 02.06 to ganger for de resterende bibliotek plater.
3. Dag 3: Utfør Luciferase analysen
BEMERK: Før utførelse av luciferase-analysen, er det mulig å multiplekse det med en cellelevedyktighet assay basert på reduksjon av resazurin for å oppnå en celle-levedyktighet indeks fra hver brønn 9. Multipleksing luciferase og levedyktighet assay analyser resulterer i en reduksjon av luciferase signal som imidlertid kan ignoreres dersom cellene gir høyt nok nivå av luciferase-aktivitet. Luciferase-aktivitet kan påvises ved en rekke kommersielle og hjemmelagde 10,11 luciferase-assay-reagenser med stabil luminiserende signal.
- Stabilisere den rekonstituerte luciferase-reagens av valget til romtemperatur. Sørg for at volumet er nok for alle har oppgitte plater. For 27 plates 170 ml luciferase reagens vil være nødvendig å ta hensyn til væskehåndtering, trau dødvolum og gjentatte pipetteringstrinn. Hell luciferase reagens i et reservoar og plassere den på robotbordet.
- Fjern ni plater med celler fra inkubatoren, plassere dem på robotbordet, avdekke og vente til likevekt til romtemperatur. Tilsett 50 pl av luciferase-reagens per brønn plate ved plate. Mellom platene, innfører en forsinkelse lik den luminescens lesetid for en plate. Dette vil sikre at alle platene er målt i løpet av lik tidsintervallet fra reagenset tilsetning.
- Etter en 30 min inkubasjon, plasserer den første platen i luminometeret og måle luminescens etter en kort risting trinn. Gjenta for alle platene. Ta opp strekkoden på hver plate, og forbinder det med den tilsvarende datafilen for å unngå feil som følge av et stort antall plater håndteres.
- Gjenta trinn 3,2-3,3 to ganger for de resterende 18 plater med celler. Samle de rester luciferase reagens og lagre det ved -20 ° C.
4. Dag 4: Data Analysis
- Prosess eksperimentelle data ved hjelp av normalisering av alle prøvene til gjennomsnittet av på-plate vehikkelbehandlede kontroller. For hvert bibliotek sammensatte, beregne middelverdien X og SD løpet triplicates.
- Velg opp regulerende og ned regulerende treff ved å sette en terskel på X ± k × SD, hvor gjennomsnittsverdien X og SD er beregnet over all analyse behandlet verdier, og k er en definert konstant.
- Velge en vilkårlig terskel cut-off <20% av bærer-behandlede kontroller når en nedsettelse av luciferase-signalet er sannsynligvis forbundet med forbindelsen toksisitet. Forkaster treff under denne terskelen vil redusere en rekke falske positive treff i telleren-screening.
MERK: I stedet for kontroll baserte normalisering, kan eksperimentelle data behandles påføre Z scorer eller den robuste analog B skjernen 12. I tillegg alternative statistiske tilnærminger for hit utvalg er tilgjengelig 12.
5. Counter-screening
MERK: Forbindelser identifisert i primærskjerm (merket 'hits') er bekreftet og evaluert for spesifisiteten av en teller-screening.
- Kirsebær plukke de utvalgte hits fra alikvotene lagret i enkle 2D strekkode rør og skape ny "hit plater", sparer tilsvarende layout. Ikke glem å forlate gratis stillinger for kontroller.
NB: I fravær av et effektivt cherry-plukking system, kan man teste både kontroll og 3 'UTR-bærende celler i parallell i den primære screening. I dette tilfellet blir bestemt utvalg av forbindelser med effekter avhengig bare av den innførte 3 'UTR være mulig etter den primære screening eliminerer behovet for teller-screening. Imidlertid vil det parallelle screening i to cellelinjer doble assaykostnader. - Etter protokollen for primærscreening (kapittelet "Dag 1: Forberede og Seed Cells"), for hver "hit plate" forberede tre 96-brønners plater av hver CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL stabile celler.
- Etter protokollen for primærscreening (kapittelet "Dag 2: Unn Celler med Bibliotek Forbindelser"), bruker hvert treff plate å behandle tre CHP134-mycn3UTR og tre CHP134-CTRL plater på 2 mikrometer arbeider konsentrasjon.
MERK: Mens telleren skjermen er beskrevet her blir utført i triplikater i enkelt dose på 2 um, kan det være fordelaktig å erstatte de vanlige replikater og teste treff i 3 konsentrasjoner som 10-gangers fortynninger varierende fra 2 pM til 20 nM. Å bruke denne tilnærmingen vil ikke bare tillater å bekrefte dataene fra den primære skjermen, men også for å oppnå innledende dose-responsdata på den primære treff, reduserer falske positiver. I dette tilfelle, bør en annen analyse rørledning være apparaed å behandle de eksperimentelle data og bekrefte treff. - Etter protokollen for primærscreening (kapittelet "Dag 3: Utfør Luciferase analysen"), måle luciferaseaktivitet i alle CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL plater.
- Etter protokollen for primærscreening (kapittelet "Dag 4: Data Analysis"), normal eksperimentelle data fra behandlede brønner til gjennomsnittet av på-plate vehikkelbehandlede kontroller og beregne middelverdien og SD løpet replikater. For hver forbindelse testet, beregne ganger endring av luciferaseaktivitet i CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL celler. Velge vilkårlig fold endrings avskjær av> 1,5 og betydning p-verdier på <0,01.
MERK: I innstillingene beskrevet analyse bestemmende parameter for hit spesifisitet er en betydelig ganger endring av luciferaseaktivitet i CHP134-mycn3UTR vs. CHP134-CTRL celler. Ved behov kan man også vurdere sammensatte toksisitet ved å utføre samtidig en celle levedyktighet analysen på setes forbindelser. Dette kan være spesielt fordelaktig hvis de primære treff er kontra screenet på en doseresponsanalyse. For en enkelt dose, viser vår erfaring en sterk korrelasjon av redusert luciferaseaktivitet med redusert celleviabilitet 6. Derfor, redusert luciferaseaktivitet i målceller, så vel som kontrollceller kan betraktes som en indikator på forbindelsen toksisitet ved den testede konsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den beskrevne metode, vist vi en 2000-forbindelse bibliotek for potensielle modulatorer av post-transkripsjonelle kontrollmekanismer som utøves gjennom 3 'UTR av MYCN genet. Figur 3 viser resultatene av den primære screening eksemplifisert ved et enkelt bibliotek plate. Luciferase signal vist som prosentandel av bærer-behandlede kontroller ble oppnådd ved å måle luciferaseaktiviteten i triplikate plater av CHP134-mycn3UTR celler behandlet med forbindelser av et enkelt bibliotek plate. Som ventet er de fleste forbindelser ikke hadde noen effekt på luciferase-aktivitet som indikert ved verdier nær 100% baseline. Hits (klare firkanter) ble valgt å sette en terskel på X ± 2 SD, hvor gjennomsnittsverdien X og SD er beregnet over all analyseverdier. Forbindelser som reduserer luciferase-aktivitet under 20% (den som er merket med stjerne) bør fjernes fra betraktning som den detekterte inhibering mest sannsynlig resulterer fra pronounced cellulær toksisitet av det sammensatte.
Figur 4 viser noen få representative eksempler på data oppnådd i telleren-screening av omtrent 100-forbindelser. Som kan bedømmes fra normalisert luciferase signal i CHP134 CTRL-celler, forbindelse V ved 2 uM konsentrasjon har ingen virkning på cellelevedyktighet, mens forbindelsen X viser noen cytotoksisk aktivitet. Begge forbindelser W og X har imidlertid forårsake MYCN 3 'UTR-spesifikke oppregulering av luciferaseaktivitet, som antydet med brette endring forskjell og t-test. Sammensatte Y 2 mikrometer konsentrasjon ser ut til å gå på akkord levedyktighet CHP134 celler; i form av spesifisitet er det ingen forskjell i luciferaseaktivitet i CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL celler. Endelig er den økning i luciferase-aktivitet påvist i den primære screening for forbindelse Z ikke helt avhengig av MYCN 3 'UTR, siden en tilsvarende oppregulering er observert i CHP134 CTRL-celler. Vi oppdaget ikke noen hit som resulterer i MYCN 3 'UTR-spesifikke nedregulering av luciferase-aktivitet.
Fig. 1: Komponenter av cellebasert reporter gene assay viser Den øvre panel skjematisk diagram av MYCN genet. Den MYCN transkripsjon (NM_005378.4) er trukket til skala. Bokser viser eksoner med skyggefulle områder som tilsvarer de CDS, linjene representerer introner. Reporteren konstruerer Luc-CTRL og Luc-3UTR-MYCN er skjematisk representert under. CMV, cytomegalovirus; SV40, simianvirus 40. CHP134 neuroblastom cellelinjen ble valgt til å produsere stabilt transfekterte cellene ved hjelp av de nevnte plasmider. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Hver enkelt sammensatt bibliotek plate ble brukt til å behandle tredoble plater av CHP134-mycn3UTR celler Outline av primærscreening: Figur 2.. Luciferase-aktivitet ble målt etter 24 timers behandling.
Figur 3: Plate-brønn spredningsdiagram av normaliserte verdier som representerer en enkelt 96-brønners plate fra den primære screening CHP134-mycn3UTR celler som vokser i 96-brønners plater ble behandlet med bibliotek forbindelser ved 2 uM konsentrasjon.. Hvert punkt tilsvarer luciferase-aktivitet påvist for en enkelt forbindelse etter 24 timers behandling og normalisert til den midlere luciferase signalet detektert i vehikkelbehandlede kontroller i løpet av den samme plate. Datapunkter vises følge forbindelser stilling i en 96-brønns plate (10 forbindelsene i kolonnene 2-10 fra rå A tilG). Bety over tre replikater ± SD vises. Treffene vises som klare firkanter. Et treff kjennetegnet ved redusert luciferase-aktivitet under 20% er merket med stjerne.
Figur 4:. Representative eksempler på kontra screening CHP134-mycn3UTR og CHP134-CTRL stabile celler ble behandlet parallelt med forbindelser forhåndsvalgt i primærscreening. Luciferase-analysen ble utført etter 24 timers behandling ved 2 uM konsentrasjon. Grafen viser representative resultater for fire utvalgte forbindelser betegnet W, X, Y og Z. Hver linje svarer til luciferase-aktivitet påvist for en enkelt forbindelse, og normaliseres til den midlere luciferase signal av bærer-behandlede kontroller i de angitte stabile celler. Brett endring forskjell og statistisk signifikans i den tosidige t-test vises, ** p <0.01,*** P <0,001.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
- Schwanhäusser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Tebaldi, T., et al. Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells. BMC Genomics. 13 (1), 220 (2012).
- Mitchell, S. F., Parker, R. Principles and properties of eukaryotic mRNPs. Mol. Cell. 54 (4), 547-558 (2014).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m6A RNA methylation. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3’ untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biol. 9 (5), 563-576 (2012).
- Sidarovich, V., Adami, V., Quattrone, A. A Cell-Based High-Throughput Screen Addressing 3’ UTR-Dependent Regulation of the MYCN Gene. Mol. Biotechnol. 56 (7), 631-643 (2014).
- Cheung, N. -K. V., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 13 (6), 397-411 (2013).
- Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br. J. Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
- Herbst, J., et al. Multiplexing a high-throughput liability assay to leverage efficiencies. Assay Drug Dev. Techn. 7 (3), 294-303 (2009).
- van Olst, E. S. iebring-, et al. Affordable luciferase reporter assay for cell-based high-throughput screening. J. Biomol. Screen. 18 (4), 453-461 (2013).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat. Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Hitti, E., et al. A versatile ribosomal protein promoter-based reporter system for selective assessment of RNA stability and post-transcriptional control. RNA. 16 (6), 1245-1255 (2010).
- Oikonomou, P., Goodarzi, H., Tavazoie, S. Systematic identification of regulatory elements in conserved 3’ UTRs of human transcripts. Cell Rep. 7 (1), 281-292 (2014).
- Gandin, V., et al. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J. Vis. Exp. (87), (2014).
- Conne, B., Stutz, A., Vassalli, J. D. The 3’ untranslated region of messenger RNA: A molecular “hotspot” for pathology. Nat. Med. 6 (6), 637-641 (2000).
- Cheneval, D., Kastelic, T., Fuerst, P., Parker, C. N. A review of methods to monitor the modulation of mRNA stability: a novel approach to drug discovery and therapeutic intervention. J. Biomol. Screen. 15 (6), 609-622 (2010).
- Pascale, A., Govoni, S. The complex world of post-transcriptional mechanisms: is their deregulation a common link for diseases? Focus on ELAV-like RNA-binding proteins. Cell. Mol. Life Sci. 69 (4), 501-517 (2012).
- Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. Impaired pre-mRNA processing and altered architecture of 3’ untranslated regions contribute to the development of human disorders. Int. J. Mol. Sci. 14 (8), 15681-15694 (2013).
- Bhattacharyya, A., Trotta, C. R., Peltz, S. W. Mining the GEMS--a novel platform technology targeting post-transcriptional control mechanisms. Drug Discov. Today. 12 (13-14), 553-560 (2007).
- Peltz, S. W., Welch, E. M., Trotta, C. R., Davis, T., Jacobson, A. Targeting post-transcriptional control for drug discovery. RNA Biol. 6 (3), 329-334 (2009).
