Abstract
Sia trascrizionale e regolazione post-trascrizionale hanno un profondo impatto sulla espressione dei geni. Tuttavia, i saggi di screening basati su cellule comunemente adottati concentrarsi sulla regolazione trascrizionale, essendo essenzialmente finalizzata alla identificazione di molecole promotore-targeting. Come risultato, meccanismi post-trascrizionali sono ampiamente privi di espressione genica sviluppo di farmaci mirati. Qui si descrive un saggio basato su cellule finalizzata a studiare il ruolo di 'regione non tradotta (3' UTR 3) nella modulazione del destino del suo mRNA, e ad identificare composti in grado di modificarlo. Il saggio si basa sull'impiego di un costrutto reporter di luciferasi contenente la 3 'UTR di un gene di interesse stabilmente integrati in una linea cellulare malattie rilevanti. Il protocollo è diviso in due parti, con la messa a fuoco iniziale sul screening primario finalizzato alla identificazione di molecole che influenzano l'attività della luciferasi dopo 24 ore di trattamento. La seconda parte del protocollodescrive the-counter di screening necessario per discriminare i composti modulanti attività luciferasi in particolare attraverso UTR 3 '. Oltre al protocollo dettagliato e risultati rappresentativi, forniamo importanti considerazioni circa lo sviluppo del test e la validazione del colpo (s) sul bersaglio endogena. Il reporter assay gene cell-based descritto permetterà agli scienziati di identificare molecole che modulano i livelli di proteina attraverso meccanismi post-trascrizionali dipendenti da una 'UTR 3.
Introduction
Per un lungo periodo di regolazione trascrizionale dell'espressione genica è stato pensato per svolgere un importante ruolo, se non esclusivo controllo della produzione di proteine. Accumulando prove, tuttavia, indica che regolazione post-trascrizionale contribuisce tanto quanto, se non di più, regolazione trascrizionale di determinare proteina cellulare abbondanza 1,2. Controllo post-trascrizionale dell'espressione genica è molto più complesso ed elaborato di quanto non fosse in primo pensiero. In realtà, tutte le varie fasi di controllo post-trascrizionale sono emerse da disciplinare, tra cui l'elaborazione mRNA, localizzazione, fatturato, traduzione 3, nonché il nuovo descritto reversibile RNA metilazione 4. Da una serie di processi di regolazione post-trascrizionali potenzialmente interessati, il saggio di seguito descritto si concentra su quelli che coinvolgono 'regione non tradotta (3' del mRNA 3 UTR). 3 'UTR colpisce ampiamente mRNA destino principalmente attraverso specifica interazione tra RNA-binding proteins e RNA non codificanti per le sue sequenze di regolazione e / o strutture secondarie 5. Perciò, piccole molecole che modificano queste interazioni o interferiscono con a monte trasduzione del segnale sarà spostare l'equilibrio che regola la proteina abbondanza. Questo approccio terapeutico è particolarmente importante per le patologie umani per i quali esistono evidenze che dimostrano che geni malattia rilevanti sono sottoposte a regolazione post-trascrizionale, che rappresenta quindi un potenziale bersaglio per l'intervento farmacologico. Pertanto, i sistemi che consentono per lo screening dei modulatori livelli di mRNA 'attraverso l'interferenza con i meccanismi di controllo post-trascrizionale in un formato ad alta velocità possono diventare strumenti utili all'identificazione di potenziali trattamenti innovativi.
Il saggio basato su cellule gene reporter descritto consente l'identificazione di composti capaci di modulare mRNA destino attraverso meccanismi dipendenti dalla sua 3 'UTR. Si compone di diverse parti principali componenti (Figura 1) e richiede pochi passi preliminari per convalidare la fattibilità del test. Prima di tutto, il costrutto giornalista è progettato per includere UTR 3 'da un gene di interesse. Il 3 'UTR si fonde alla fine di un gene reporter luciferasi di lucciola come (Figura 1). Eventuali cambiamenti di meccanismi di controllo post-trascrizionali esercitate attraverso l'inserimento 3 'UTR altereranno la stabilità e / o l'efficienza della traduzione di questa trascrizione chimerico, causando diversi livelli luciferasi. Pertanto, le variazioni di attività luciferasica servono come misura indiretta della colpita regolazione post-trascrizionale del gene di interesse. Il secondo componente del sistema è un costrutto di controllo giornalista, un plasmide di espressione identica che esprime lo stesso gene reporter, ma non contiene alcun 3 'UTR. I due plasmidi reporter possono essere progettati in laboratorio utilizzando protocolli di biologia molecolare convenzionali o acquistati da fonti commerciali.
La selezione di una linea cellulare appropriata è fondamentale per la costruzione dosaggio. Quale linea cellulare è il modello ottimale dipende da numerosi fattori che vanno dai requisiti clinici come somiglianza massima alla patologia a questioni solo pratici come caratteristiche disponibilità, transfectability, e la crescita. È importante sottolineare che, prima di procedere si deve fare in modo che la fusione del 3 'UTR al gene reporter ha un effetto previsto sul livello di trascrizione chimerico. L'assenza di una significativa differenza di segnale luciferasi dal 3 'UTR-cuscinetto e controllo giornalista costruisce trasfettate nelle celle selezionate indicherebbe che il 3' UTR non è funzionale in questo modello cellulare, spingendo per la ricerca di quelli alternativi. Per il formato ad alta velocità, le 3 'UTR portante e controllo costrutti reporter luciferasi dovrebbero essere stabilmente integrati nella linea cellulare selezionata. Utilizzando un stabilmente integrato su transitoriamente trasfettatelinea cellulare è preferibile per diverse ragioni. Questo amplierà la scelta di un modello di cellulare, incluse le linee di cellule di difficile trasfezione, diminuire la variabilità dei dati derivanti dalle fluttuazioni di efficienza di trasfezione, abbasserà i costi. Inoltre, su cellule trasfezione transiente sono molto spesso sovraccarico di un plasmide di DNA che porta alla saturazione del sistema. In queste impostazioni un ulteriore aumento dell'espressione giornalista potrebbe essere difficile, con conseguente diminuzione della sensibilità verso i potenziali composti upregulating.
Infine, quando tutti i componenti del dosaggio sono impostati, è fondamentale prima di passare al formato high-throughput per determinare la fattibilità del test, vale a dire, se l'attività luciferasi può essere davvero up- e down-regolato specificamente tramite inserito 3 ' UTR. I migliori controlli sarebbero piccole molecole segnalati per modulare la stabilità o traducibilità dell'mRNA attraverso UTR 3 'di interesse. Se avere questi ènon è possibile, si accettano controlli surrogate imitano l'effetto desiderato. Questi potrebbero essere miRNA o RNA-binding proteins noti per esercitare i loro effetti attraverso il legame al 3 'UTR di interesse. La valutazione di tali controlli prima della proiezione principale indica non solo la funzionalità del test sviluppato, ma consente anche per la stima della sua gamma dinamica, sensibilità e prestazioni nel formato ad alta produttività.
Utilizzando il protocollo descritto abbiamo proiettato una biblioteca di 2.000 composti 6. Neuroblastoma, il tumore solido extracranico più comune dell'infanzia, è stato utilizzato come modello biologico e la 3 'UTR dell'oncogene MYCN, la cui amplificazione predice fortemente esito negativo di neuroblastoma, come gene bersaglio 7. Figura 2 ne illustra lo schema sperimentale. La proiezione è stata divisa in tre corse con la dimensione del lotto di 27 lastre proiettati in una corsa. Il lotto di 27 piatti inclusi biblioteca Spectrum CollectionPiastre n.1-n.8 + n.25 (prima esecuzione),-n.16 n.9 + n.25 (seconda manche) e n.16, n.24 + n.25 (terza pista), ciascun Piastra proiettato in triplice copia. Così, una piastra biblioteca (n.25) è stato analizzato in tutti i tre piste che rendono possibile il confronto inter-run. Il protocollo che segue descrive una singola esecuzione di 9 dischi biblioteca testati in triplice copia.
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Protocol
NOTA: La portata di tali sistemi di dosaggio dipende dalla disposizione apparecchiature di laboratorio HTS. Questo protocollo è facilitato da una EVO 200 robot Tecan Freedom, che svolge gestione dei liquidi in formato 96-bene. La miniaturizzazione a 384 pozzetti è anche possibile. Il sistema di gestione dei liquidi robotizzato è posizionata sotto una cappa a flusso laminare per mantenere condizioni di asetticità durante tutte le fasi sperimentali. Se no automazione-liquido trattamento è disponibile, il protocollo può essere facilmente adattato in formato a bassa velocità.
Screening primario
1. Giorno 1: Preparare e Celle Seed
NOTA: cellule seme di resa 80% di confluenza al momento di saggiare l'attività luciferasica, cioè 48 ore dopo la semina.
- Risospendere tripsinizzate cellule di neuroblastoma CHP134-mycn3UTR ad una concentrazione di 2 x 10 5 cellule / ml in RPMI contenente 10% FBS e 1% di L-glutammina. Per 27 piastre preparare almeno 250 ml di sospensione cellulare tenendo conto di gestione dei liquidi, Trogoli volumi morti e fasi di pipettamento ripetuti. Versare la sospensione cellulare nel serbatoio sterile e posizionarlo sulla scrivania robot.
- Collocare 9 piastre a 96 pozzetti a barre bianche a fondo piatto e una scatola di 200 microlitri puntali sterili sulla scrivania robot. Mescolare la sospensione cellulare pipettando prima di ogni passo dispensa per evitare cellule sedimentazione per gravità. Dispensare 75 ml di cellule in ogni pozzetto di 9 dischi per ottenere una densità finale di 1,5 × 10 4 cellule per bene.
- Coprire le piastre con i coperchi e lasciarli all'esterno del incubatore per 30 minuti per permettere alle cellule di sedimentare sul fondo del pozzo. Questo ridurrà al minimo gli effetti di bordo.
- Ripetere le fasi 1.2 e 1.3 due volte per preparare un numero totale di 27 piastre.
- Porre le piastre a 37 ° C e 5% di CO 2 e incubare per 24 ore.
2. Giorno 2: Trattare le Celle con Biblioteca Compounds
S copi "> NOTA: La piccola biblioteca molecola di Spectrum Collection si compone di 2.000 composti disposti in 8 righe e 10 colonne in 25 piastre da 96 pozzetti alla concentrazione di 10 mM in DMSO I pozzi del primo e ultime colonne vengono lasciati vuoti per i controlli. test di screening. Compound sono tipicamente eseguiti a 1-10 micron concentrazione del composto 8. Il protocollo di screening descritto qui corregge 2 micron come la concentrazione di lavoro e 24 ore come il punto finale del test.- Scongelare 9 piastre biblioteca composto a temperatura ambiente.
- Preparare due vasche con PBS sterile e soluzioni% DMSO-0.5 PBS e metterli sulla scrivania robot. Per ogni piastra biblioteca, preparare e etichettare conseguenza una piastra di diluizione - un polipropilene U-bottom piastra a 96 pozzetti con un volume di lavoro di almeno 400 microlitri. Riempire ogni pozzetto di colonne da 2 a 11 piastre di diluizione con 398 ml di PBS sterile con punte fisse del conduttore liquido. Fill colonne 1 e 12, con 50 ml di PBS sterilecon 0,5% DMSO per riprodurre la concentrazione veicolo nei pozzetti di controllo (0,02%).
- Mettere due piastre di libreria, le piastre di diluizione corrispondentemente etichettati, due scatole di 50 microlitri puntali sterili e sei celle piastre sulla scrivania robot. Scoprire cellule piatti.
- Dispensare 2 ml di soluzione di MM 10 stock da una delle due piastre di libreria nella piastra di diluizione corrispondente e mescolare bene. Questo si tradurrà in una concentrazione intermedia composti di 50 pM. Utilizzando lo stesso set di punte, a meno di 3 ml di diluizione 50 micron di 3 piastre da 96 pozzetti bianche codice a barre con le cellule. Questa diluizione risultati schema a 2 micron concentrazione di ogni lavoro testati composto.
NOTA: Per evitare manipolazioni inutili con le punte, utilizzare un set completo di 96 consigli fin dall'inizio, anche se i piatti della biblioteca contengono solo 80 composti. Questo è possibile poiché il primo e l'ultimo colonne delle piastre di libreria sono vuoti. - Sostituire i puntali e ripetere Step 2.4 per la seconda piastra libreria.
- Coprire le piastre cellule e restituirli per l'incubatore per 24 ore.
- Ripetere i passaggi 2,3-2,6 altre due volte per le piastre di libreria rimanenti.
3. Giorno 3: Eseguire Luciferase Assay
NOTA: Prima di eseguire il saggio luciferasi, è possibile multiplex con un test di vitalità cellulare basato sulla riduzione dei resazurina per ottenere un indice di vitalità cellulare da ciascun pozzetto 9. Multiplexing luciferasi e dosaggio redditività saggi determina una riduzione del segnale di luciferasi che, tuttavia, può essere ignorato se le cellule forniscono livello sufficientemente alto di attività luciferasica. Attività luciferasi può essere rilevato da una varietà di 10,11 luciferasi reagenti commerciali e fatti in casa con segnale stabile luminescenti.
- Equilibrare il reagente ricostituito luciferasi di scelta a temperatura ambiente. Assicurarsi che il volume è sufficiente per tutti i piatti analizzati. Per 27 piastras 170 ml di reattivo luciferasi sarà richiesto tenendo conto di gestione dei liquidi, Trogoli volume morto e fasi di pipettamento ripetuti. Versare il reagente luciferasi in un serbatoio e posizionarlo sulla scrivania robot.
- Rimuovere 9 piatti con le cellule dal termostato, metterli sulla scrivania robot, scoprire e attendere fino riportati a temperatura ambiente. Aggiungere 50 ml di reagente luciferasi per piastra bene da piatto. Tra le piastre, introdurre un ritardo pari al tempo di lettura luminescenza di una piastra. Ciò assicurerà che tutte le piastre vengono misurate entro l'intervallo di tempo pari dell'aggiunta del reagente.
- Dopo 30 min di incubazione, posizionare il primo piatto in luminometro e misurare luminescenza dopo una breve fase di agitazione. Ripetere l'operazione per tutte le piastre. Registrare il codice a barre di ciascuna piastra e associarlo al file di dati corrispondente per evitare errori derivanti da un gran numero di piatti trattati.
- Ripetere i passaggi 3,2-3,3 due volte per i restanti 18 piatti con le cellule. Raccogliere il residuo reattivo luciferasi e conservarlo a -20 ° C.
4. Giorno 4: Analisi dei dati
- Processo dati sperimentali utilizzando la normalizzazione di tutti i campioni alla media di sulla piastra controlli trattati con veicolo. Per ogni composto biblioteca, calcolare il valore medio X e SD su triplica.
- Selezionare up-regolazione e down-regolazione colpi fissando una soglia di X ± k × SD, dove la X valore medio e deviazione standard vengono calcolate su tutti i valori di analisi elaborati, e k è una costante definita.
- Selezionare una soglia arbitraria cut-off <20% dei controlli trattati con veicolo quando una riduzione del segnale di luciferasi è probabilmente associata a tossicità composto. Scartando i colpi di sotto di questa soglia ridurrà notevolmente il numero di colpi falsi positivi del contro-screening.
NOTA: Invece di normalizzazione a base di controllo, dati sperimentali possono essere elaborati applicando Z punteggio o la sua robusta analogico B snucleo 12. Inoltre, approcci statistici alternativi per la selezione hit sono disponibili 12.
5. Counter-proiezione
NOTA: composti identificati nella schermata principale (classificati come 'hits') sono confermate e valutate per la specificità da un contro-screening.
- Cherry raccogliere i successi selezionati dalle aliquote conservato in provette con codice a barre 2D singoli e creare nuovo "hit piatti", salvare il layout corrispondente. Non dimenticate di lasciare posizioni libere per i controlli.
NOTA: In mancanza di un efficiente sistema di cherry-picking, si potrebbe verificare sia il controllo e 3 'UTR cellule-cuscinetto in parallelo nel screening primario. In questo caso, specifica selezione di composti con effetti dipendenti solo sulla introdotta 3 'UTR sarà possibile dopo la proiezione primaria eliminando la necessità di contro-screening. Tuttavia, la proiezione parallelo due linee cellulari raddoppierà dosaggioi costi. - Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione "Giorno 1: Preparare e Cells Seed"), per ogni "hit piastra" preparare tre piastre da 96 pozzetti di ciascuna CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL cellule stabili.
- Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione "Giorno 2: Trattare celle con Biblioteca Compounds"), utilizzare ogni piastra colpo per il trattamento di tre CHP134-mycn3UTR e tre piastre CHP134-CTRL a 2 micron concentrazione di lavoro.
NOTA: Mentre il contatore schermo qui descritto viene eseguito in triplicato alla dose singola di 2 mM, potrebbe essere vantaggioso per sostituire i replicati standard e verificare i risultati in 3 concentrazioni diluizioni di 10 volte da 2 mM a 20 nM. L'applicazione di questo approccio non solo consente di confermare i dati della schermata principale, ma anche di ottenere dati preliminari dose-risposta sui risultati primari, minimizzando tassi di falsi-positivi. In questo caso, una differente tubazione analisi dovrebbe essere applied elaborare i dati sperimentali e confermare i colpi. - Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione "Giorno 3: Eseguire Luciferase Assay"), misurare l'attività luciferasi in tutte le piastre CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL.
- Seguendo il protocollo per lo screening primario (sezione "Giorno 4: Analisi dei dati"), normalizzare i dati sperimentali provenienti da pozzi trattati alla media di sulla piastra comandi del veicolo trattati e calcolare la media e SD su repliche. Per ogni composto testato, calcolare la variazione piega di attività luciferasi in CHP134-mycn3UTR vs. cellule CHP134-CTRL. Selezionare Cambia volte arbitrari cut-off di> 1.5 e significatività p-valori <0,01.
NOTA: Nelle impostazioni descritte nel parametro determinante per il successo specificità è un cambiamento significativo di attività volte luciferasi in CHP134-mycn3UTR vs. cellule CHP134-CTRL. Se necessario, si potrebbe anche valutare la tossicità composto eseguendo contemporaneamente un test di vitalità cellulare in seComposti zionato. Questo potrebbe essere particolarmente utile se i colpi principali sono contro-proiettati in un'analisi dose-risposta. Per una singola dose, la nostra esperienza indica una forte correlazione tra l'attività luciferasi ridotta con diminuita vitalità cellulare 6. Pertanto, diminuita attività della luciferasi in cellule bersaglio così come cellule di controllo può essere considerato come un indicatore della tossicità composti, alle concentrazioni testate.
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Representative Results
Utilizzando l'approccio descritto, abbiamo proiettato una biblioteca 2.000 composti per potenziali modulatori di meccanismi di controllo post-trascrizionale esercitata attraverso la 3 'UTR del gene MYCN. La figura 3 illustra i risultati dello screening primario esemplificato da una singola piastra di libreria. Segnale luciferasi visualizzato come percentuale dei controlli trattati con veicolo è stata ottenuta misurando l'attività luciferasica in triplicato in piastre di cellule CHP134-mycn3UTR trattati con composti di una singola piastra di libreria. Come previsto, la maggior parte dei composti non ha avuto effetto sulla attività luciferasica, come indicato da valori prossimi al valore di riferimento 100%. I colpi (quadrati chiari) sono stati selezionati fissando una soglia di X ± 2 SD, dove la X valore medio e deviazione standard vengono calcolate su tutti i valori di analisi. Composti ridurre l'attività della luciferasi di sotto del 20% (quella contrassegnata con asterisco) devono essere rimossi dalla considerazione l'inibizione rilevato molto probabilmente deriva da pronounced tossicità cellulare del composto.
La figura 4 illustra alcuni esempi rappresentativi di dati ottenuti nel contro-proiezione di circa 100 composti. Come può essere giudicato dal segnale luciferasi normalizzato in cellule CHP134-CTRL, compound W a 2 micron concentrazione non ha effetti sulla vitalità cellulare, mentre composto X mostra qualche attività citotossica. Entrambi i composti W e X, tuttavia, causano MYCN 3 'UTR-specifica up-regolazione dell'attività luciferasica, come indicato dalla piega differenza cambiamento e t-test. Compound Y a 2 concentrazione uM sembra compromettere la vitalità delle cellule CHP134; in termini di specificità non vi è alcuna differenza di attività luciferasi in CHP134-mycn3UTR e cellule CHP134-CTRL. Infine, l'aumento dell'attività luciferasica rilevata nello screening primario per compound Z non è veramente dipende MYCN 3 'UTR, poiché un up-regulation equivalente è osservata in cellule CHP134-CTRL. Non abbiamo rilevato alcuna hit conseguente MYCN 3 'down-regolazione dell'attività luciferasi-specifica UTR.
Figura 1:. Componenti del dosaggio gene reporter base cellulare Il pannello superiore mostra diagramma schematico del gene MYCN. La trascrizione MYCN (NM_005378.4) è in scala. Scatole rappresentano le esoni con le regioni ombreggiate corrispondenti ai CDS, linee rappresentano introni. Il reporter costruisce Luc-CTRL e Luc-3UTR-MYCN sono schematicamente rappresentati di seguito. CMV, citomegalovirus; SV40, il virus delle scimmie 40. La linea di cellule di neuroblastoma CHP134 è stato scelto per la produzione di cellule stabilmente trasfettate con i plasmidi di cui sopra. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Schema dello screening preliminare Ogni piastra singola libreria composto è usato per trattare lastre triplicato di cellule CHP134-mycn3UTR. L'attività della luciferasi è stata misurata dopo 24 ore di trattamento.
Figura 3:. Plate-bene scatter plot dei valori normalizzati rappresenta una singola piastra a 96 pozzetti dal screening primario cellule CHP134-mycn3UTR crescono in piastre da 96 pozzetti sono stati trattati con composti biblioteca a 2 concentrazione micron. Ogni punto corrisponde ad attività luciferasica rilevato per un singolo composto dopo 24 ore di trattamento e normalizzato al segnale luciferasi medio rilevato nei controlli trattati con veicolo all'interno della stessa piastra. I punti dei dati vengono visualizzati in seguito alla posizione di composti all'interno di una piastra a 96 pozzetti (10 composti in colonne 2-10 da crudo a AG). Media oltre tre repliche ± è mostrato SD. I colpi vengono visualizzati come quadrati chiari. Un colpo caratterizzato da attività luciferasi ridotta al di sotto del 20% è contrassegnato con l'asterisco.
Figura 4:. Esempi rappresentativi di contro-proiezione CHP134-mycn3UTR e CHP134-CTRL cellule stabili sono stati trattati in parallelo con composti pre-selezionati nello screening primario. Il saggio luciferasi è stata eseguita dopo 24 ore di trattamento a 2 concentrazione micron. Il grafico mostra i risultati rappresentativi dei quattro composti scelti designate W, X, Y e Z. Ogni barra corrisponde ad attività luciferasica rilevato per un singolo composto e normalizzato al segnale medio luciferasi dei controlli trattati con veicolo nelle cellule stabili indicati. Piegare differenza cambiamento e la significatività statistica nel t-test a due code vengono visualizzati, ** p <0.01,*** P <0.001.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
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