Abstract
Tanto transcripcional y post-transcripcional regulación tienen un profundo impacto en los genes de expresión. Sin embargo, los ensayos de cribado basados en células comúnmente adoptadas se centran en la regulación transcripcional, siendo destinado esencialmente a la identificación de moléculas promotoras de metas. Como resultado, los mecanismos post-transcripcionales se descubren en gran medida por el desarrollo de fármacos dirigidos expresión génica. Aquí se describe un ensayo basado en células destinado a investigar el papel de la 'región no traducida (3' UTR del 3) en la modulación de la suerte de su ARNm, y en la identificación de compuestos capaces de modificarla. El ensayo se basa en el uso de un constructo informador de luciferasa que contiene el 3 'UTR de un gen de interés integrado de manera estable en una línea celular relevante para la enfermedad. El protocolo se divide en dos partes, con el foco inicial en el cribado primario dirigido a la identificación de moléculas que afectan a la actividad de luciferasa después de 24 h de tratamiento. La segunda parte del protocolodescribe el contador de detección necesario discriminar compuestos que modulan la actividad de la luciferasa específicamente a través de la UTR 3 '. Además del protocolo detallado y resultados representativos, proporcionamos consideraciones importantes sobre el desarrollo del ensayo y la validación de la exitosa (s) en la diana endógeno. El ensayo de gen indicador basado en células descrito permitirá a los científicos identificar moléculas que modulan los niveles de proteína a través de post-transcripcional mecanismos que dependen de un 'UTR 3.
Introduction
Durante un largo período de regulación transcripcional de la expresión génica se cree que desempeñan un importante papel exclusivo, si no en el control de la producción de proteínas. La acumulación de pruebas, sin embargo, indica que la regulación post-transcripcional contribuye tanto como, si no más, que la regulación transcripcional para determinar la abundancia de proteínas celulares 1,2. El control post-transcripcional de la expresión génica es mucho más compleja y elaborada que estaba en primer pensamiento. De hecho, todas las diversas etapas de control post-transcripcional han surgido para ser regulada, incluyendo el procesamiento de ARNm, la localización, la rotación, la traducción 3, así como la metilación reversible de ARN recientemente descrita 4. Desde un número de procesos de regulación post-transcripcional potencialmente afectado, el ensayo descrito a continuación se centra en aquellos que involucran 'región no traducida (3' UTR del mRNA 3). 3 'UTR afecta ampliamente ARNm destino principalmente a través de la interacción específica de pr ARN vinculanteoteins y ARNs no codificantes a sus secuencias reguladoras y / o estructuras secundarias 5. Por lo tanto, las pequeñas moléculas que alteran estas interacciones o interfieren con las vías de transducción de señales de aguas arriba se desplazará el equilibrio que regula la abundancia de proteínas. Este enfoque terapéutico es de particular importancia para las patologías humanas para las que existan pruebas que muestran que los genes relevantes de la enfermedad son sometidos a la regulación post-transcripcional, lo que representa, pues, un objetivo potencial para la intervención farmacológica. Por lo tanto, los sistemas que permiten la detección de moduladores de los niveles de mRNA 'a través de la interferencia con los mecanismos de control post-transcripcional en un formato de alto rendimiento pueden llegar a ser herramientas valiosas en la identificación de nuevos tratamientos potenciales.
El ensayo de gen indicador basado en células descrito permite la identificación de compuestos capaces de modular mRNA destino a través de mecanismos dependientes de su extremo 3 'UTR. Consiste en varias c directorOMPONENTES (Figura 1) y requiere algunos pasos preliminares para validar la viabilidad del ensayo. En primer lugar, el constructo indicador está diseñado para incluir la UTR 3 'de un gen de interés. La 3 'UTR se fusiona con el extremo de un gen informador tal como luciferasa de luciérnaga (Figura 1). Cualquier cambio en los mecanismos de control post-transcripcional ejercidas a través de la insertado 3 'UTR se alterar la estabilidad y / o eficacia de traducción de esta transcripción quimérico, resultando en niveles variados de luciferasa. Por lo tanto, los cambios en la actividad de luciferasa sirven como medida indirecta de la regulación post-transcripcional afectada del gen de interés. El segundo componente del sistema es un constructo indicador de control, un plásmido de expresión idéntica que expresa el mismo gen informador, pero que no contiene ningún 3 'UTR. Los dos plásmidos informadores pueden ser diseñados en el laboratorio usando protocolos de biología molecular convencionales o adquirirse de fuentes comerciales.
La selección de una línea celular apropiada es fundamental para la construcción de ensayo. ¿Qué línea celular es el modelo óptimo depende de numerosos factores que van desde los requisitos clínicos como semejanza máxima a la patología a cuestiones prácticas, como acaba de características disponibilidad, transfectability y crecimiento. Es importante destacar que, antes de proceder uno debe asegurarse de que la fusión de 3 'UTR del gen reportero tiene un efecto esperado en el nivel de la transcripción quimérico. La ausencia de diferencia significativa en la señal de luciferasa a partir de la 3 'UTR de soporte y control reportero construcciones transfectadas transitoriamente en las células seleccionadas indicaría que el 3' UTR no es funcional en este modelo celular, lo que provocó para la búsqueda de los alternativos. Para el formato de alto rendimiento, los 3 'UTR-cojinete y el control de luciferasa reportero construcciones deben integrarse de manera estable en la línea celular seleccionada. El uso de un integrado de forma estable sobre transfectadas transitoriamentelínea celular es preferible por varias razones. Esto ampliará la elección de un modelo celular incluyendo líneas de células difíciles de transfectar, disminuir la variabilidad en los datos derivados de las fluctuaciones en la eficiencia de la transfección, disminuir los costes. Por otra parte, sobre las células de transfección transitoria son muy a menudo sobrecargados con un plásmido de ADN que conduce a la saturación del sistema. En estas configuraciones un aumento adicional en la expresión reportero podría ser un reto, lo que resulta en una disminución de la sensibilidad hacia compuestos potenciales upregulating.
Finalmente, cuando todos los componentes del ensayo se configuran, es fundamental antes de pasar al formato de alto rendimiento para determinar la viabilidad de la prueba, es decir, si la actividad de la luciferasa puede ser de hecho arriba y hacia abajo reguladas específicamente a través de la insertado 3 ' UTR. Los mejores controles serían pequeñas moléculas informado de modular la estabilidad o la traducibilidad del ARNm a través de UTR 3 'de interés. Si tener estos esno es posible, se aceptan los controles de sustitución que imitan el efecto deseado. Estos podrían ser miRNAs o proteínas de unión al ARN conocidos para ejercer sus efectos mediante la unión a la 3 'UTR de interés. Evaluación de dichos controles antes de la proyección primaria no sólo indica la funcionalidad del ensayo desarrollado, sino que también permite para la estimación de su rango dinámico, la sensibilidad y el rendimiento en el formato de alto rendimiento.
Utilizando el protocolo descrito que exhibió una biblioteca 2000-compuesto 6. El neuroblastoma, el tumor sólido extracraneal más frecuente de la infancia, se utilizó como modelo biológico y el 3 'UTR del oncogén MYCN, cuya amplificación predice fuertemente resultado adverso de neuroblastoma, como un gen diana 7. La figura 2 describe el diseño experimental. La proyección se dividió en tres carreras con el tamaño del lote de 27 placas proyectadas en una carrera. El lote de 27 placas de biblioteca incluye Spectrum CollectionPlacas n.1-n.8 + n.25 (primera pista), n.9-n.16 + n.25 (segundo plazo) y n.16-n.24 + n.25 (tercera pista), cada placa proyectó por triplicado. Por lo tanto, una placa de biblioteca (n.25) se ensayó en las tres carreras que hacen posible la comparación inter-run. El protocolo a continuación describe una sola corrida de 9 placas de bibliotecas analizadas por triplicado.
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Protocol
NOTA: El rendimiento de tales sistemas de ensayo depende del equipo de laboratorio HTS disponible. Este protocolo es facilitado por un Tecan Freedom EVO 200 robot, que lleva a cabo el manejo de líquidos en formato de 96 pocillos. La miniaturización al formato de 384 pocillos también es posible. El sistema de manipulación de líquidos robótico se coloca bajo una campana de flujo laminar a fin de mantener condiciones asépticas durante todos los pasos experimentales. Si no incluye la automatización de manejo de líquidos está disponible, el protocolo se puede adaptar fácilmente al formato de bajo rendimiento.
Proyección Primaria
1. Día 1: Preparar y células de semillas
NOTA: Sembrar las células para producir 80% de confluencia en el momento de ensayar la actividad de la luciferasa, es decir, 48 hr después de la siembra.
- Resuspender tripsinizaron células de neuroblastoma CHP134-mycn3UTR a una concentración de 2 × 10 5 células / ml en RPMI que contiene 10% de FBS y 1% de L-glutamina. Durante 27 placas de preparar al menos 250 ml de suspensión celular teniendo en cuenta el manejo de líquidos, comederos volúmenes muertos y pasos de pipeteo repetidas. Verter la suspensión de células en el depósito estéril y colóquelo en el escritorio robot.
- Coloque 9 blancos de fondo plano placas de 96 pocillos con código de barras y una caja de 200 l puntas de pipeta estériles sobre el escritorio robot. Mezclar la suspensión celular con la pipeta antes de cada paso dispensación para evitar las células de sedimentación por gravedad. Dispensar 75 l de células en cada pocillo de placas 9 para obtener una densidad final de 1,5 × 10 4 células por pocillo.
- Se cubren las placas con las tapas y se dejan fuera de la incubadora durante 30 minutos para permitir que las células se sedimentan en el fondo del pozo. Esto minimizará los efectos de borde.
- Repetir los pasos 1.2 y 1.3 dos veces con el fin de preparar un número total de 27 placas.
- Coloque las placas a 37 ° C y 5% de CO 2 y se incuba durante 24 horas.
2. Día 2: Tratar las células con compuestos de la biblioteca
ntent "> NOTA: La biblioteca de moléculas pequeñas Spectrum colección consta de 2.000 compuestos dispuestas en 8 filas y 10 columnas en 25 placas de 96 pocillos a la concentración de 10 mM en DMSO Los pozos en las primeras y últimas columnas se dejan vacíos para los controles. ensayos de cribado. Compuesto se realizan típicamente a una concentración de compuesto 1-10 mu M 8. El protocolo de selección descrito aquí fija 2 mu M como la concentración de trabajo y 24 hr como el punto final del ensayo.- Descongele 9 placas de biblioteca compuesto a temperatura ambiente.
- Preparar dos cubetas con soluciones% DMSO 0,5 PBS PBS estéril y y colocarlos en el escritorio robot. Para cada placa de biblioteca, preparar y etiquetar en consecuencia una placa de dilución - un polipropileno placa de 96 pocillos de fondo en U con un volumen de trabajo de al menos 400 l. Llenar cada pocillo de las columnas 2 a 11 de placas de dilución con 398 l de PBS estéril utilizando puntas fijas del controlador de líquido. Llenar las columnas 1 y 12 con 50 l de PBS estérilcon 0,5% de DMSO a fin de reproducir la concentración del vehículo en los pocillos de control (0,02%).
- Coloque dos placas de la biblioteca, las placas de dilución correspondiente etiquetados, dos cajas de 50 l puntas de pipeta estéril y seis placas de células en el escritorio robot. Destape placas células.
- Pipetear 2 l de la solución madre 10 mM de una de dos placas de la biblioteca en la placa de dilución correspondiente y mezclar bien. Esto dará lugar a una concentración de compuestos intermedios de 50 mM. Utilizando el mismo conjunto de consejos, prescindir 3 l de la dilución 50 mM en 3 blancos placas de 96 pocillos con código de barras con las células. Esta dilución sistema tiene como resultado en 2 mM concentración de cada compuesto de trabajo probados.
NOTA: Para evitar manipulaciones innecesarias con los consejos, utilice un conjunto completo de 96 puntas desde el principio, a pesar de que las placas de la biblioteca contienen sólo 80 compuestos. Esto es posible ya que la primera y la última columna de las placas de la biblioteca están vacías. - Reemplace las puntas de pipeta y repetir Step 2.4 para la segunda placa de biblioteca.
- Cubra las placas de células y devolverlos a la incubadora durante 24 horas.
- Repita los pasos 2.3 a 2.6 veces más de dos de las placas de la biblioteca restantes.
3. Día 3: Realizar ensayo de luciferasa
NOTA: Antes de realizar el ensayo de luciferasa, es posible multiplexar con un ensayo de viabilidad celular basado en la reducción de la resazurina a fin de obtener un índice de viabilidad celular de cada pocillo 9. Multiplexación luciferasa y ensayo de viabilidad ensayos como resultado una reducción de la señal de luciferasa que, sin embargo, puede ser ignorada si las células proporcionan nivel suficientemente alto de actividad de luciferasa. La actividad de luciferasa se puede detectar mediante una variedad de reactivos de ensayo de luciferasa 10,11 comerciales y caseras con señal luminiscente estable.
- Equilibrar el reactivo de luciferasa reconstituido de elección a temperatura ambiente. Asegúrese de que el volumen es suficiente para todas las placas ensayadas. Para 27 de placaSe requerirá s 170 ml de reactivo de luciferasa teniendo en cuenta el manejo de líquidos, comederos volumen muerto y pasos de pipeteo repetidas. Verter el reactivo de luciferasa en un depósito y colocarlo en el escritorio robot.
- Retire 9 placas con células de la incubadora, colocarlos en el escritorio robot, descubrir y esperar hasta alcanzar la temperatura ambiente. Añadir 50 l de reactivo de luciferasa por plato bien por plato. Entre las placas, introducir un retardo igual al tiempo de lectura de la luminiscencia de una placa. Esto asegurará que todas las placas se miden en intervalos iguales de tiempo desde la adición del reactivo.
- Después de una incubación de 30 min, colocar la primera placa en el luminómetro y medir la luminiscencia después de un breve paso agitación. Repita para todas las placas. Registre el código de barras de cada placa y asociarlo al archivo de datos correspondiente para evitar errores que surgen a partir de un gran número de placas manipulados.
- Repita los pasos 3.2 a 3.3 veces para los 18 restantes placas con células. Recoger el reactivo luciferasa restante y almacenarlo a -20 ° C.
4. Día 4: Análisis de datos
- Proceso de los datos experimentales usando la normalización de todas las muestras a la media de los controles tratados con vehículo en forma de placa. Para cada compuesto biblioteca, calcular el valor medio X y SD en triplicado.
- Seleccione un máximo de regulación y abajo de la regulación éxitos estableciendo un umbral de X ± k × SD, donde la x valor medio y SD se calculan sobre todos los valores de ensayo procesada, y k es una constante definida.
- Seleccione un umbral arbitrario de corte <20% de los controles tratados con vehículo cuando una reducción de la señal de luciferasa está muy probablemente relacionados con la toxicidad del compuesto. Descartando los accesos por debajo de este umbral se reducirá significativamente un número de golpes falsos positivos en la lucha contra el cribado.
NOTA: En lugar de normalización basado en el control, los datos experimentales pueden ser procesados aplicando puntuación Z o su robusta analógica B snúcleo 12. Además, los enfoques estadísticos alternativos para la selección hit están disponibles 12.
5. Counter-screening
NOTA: Los compuestos identificados en la pantalla principal (etiquetados "hits") se confirman y se evaluó la especificidad por una contra-selección.
- Cereza recoger los éxitos seleccionados de las alícuotas almacenados en tubos con códigos de barras 2D individuales y crear nuevo "hit placas", el ahorro de la disposición correspondiente. No te olvides de dejar posiciones libres para los controles.
NOTA: En la ausencia de un sistema de cherry-picking eficiente, se podría probar tanto el control y 3 'UTR células que llevan en paralelo en el cribado primario. En este caso, la selección específica de compuestos con efectos dependen únicamente de los introducido 3 'UTR será posible después de la proyección primaria eliminando la necesidad de la lucha contra el cribado. Sin embargo, la proyección paralela en dos líneas celulares se duplicará el ensayocostes. - Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección "Día 1: Preparar y células de semillas"), para cada "golpe plato" preparar tres placas de 96 pocillos de cada células estables CHP134-mycn3UTR y CHP134-CTRL.
- Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección "Día 2: tratar las células con Biblioteca Compuestos"), utilice cada placa éxito para tratar tres CHP134-mycn3UTR y tres placas CHP134-CTRL a 2 mM concentración de trabajo.
NOTA: Mientras que la pantalla del contador descrito aquí se realiza por triplicado a la dosis única de 2 M, podría ser beneficioso para sustituir las réplicas estándar y probar los hits en 3 concentraciones de 10 diluciones que van de 2 M a 20 nM. La aplicación de este enfoque no sólo permitiría para confirmar los datos de la pantalla primaria, sino también para obtener datos de dosis-respuesta preliminar sobre los accesos primarios, minimizar las tasas de falsos positivos. En este caso, un análisis de tuberías diferente debe ser aplied para procesar los datos experimentales y confirmar los resultados. - Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección "Día 3: Realizar ensayo de luciferasa"), medir la actividad luciferasa en todas las placas CHP134-mycn3UTR y CHP134-CTRL.
- Siguiendo el protocolo para la detección primaria (sección "Día 4: Análisis de datos"), normalizar los datos experimentales de los pocillos tratados con la media de los controles tratados con vehículo en la placa y el cálculo de la media y la SD sobre repeticiones. Para cada compuesto ensayado, calcular las veces el cambio de la actividad luciferasa en CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Seleccione veces el cambio arbitrario cortes de de> 1,5 y significación valores de p de <0,01.
NOTA: En la configuración de ensayo descritos el parámetro determinante de la especificidad de golpe es un doble cambio significativo de la actividad luciferasa en CHP134-mycn3UTR vs. células CHP134-CTRL. Si es necesario, también se podría evaluar la toxicidad compuesto realizando simultáneamente un ensayo de viabilidad celular en el SEcompuestos seleccionada. Esto podría ser especialmente beneficioso si los accesos primarios son contra-examinados en un análisis de respuesta a la dosis. Para una dosis única, nuestra experiencia indica una fuerte correlación de la reducción de la actividad de luciferasa con una disminución de la viabilidad celular 6. Por lo tanto, la disminución de la actividad de luciferasa en las células diana así como células de control se puede considerar como un indicador de la toxicidad del compuesto a la concentración ensayada.
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Representative Results
Utilizando el enfoque descrito, que exhibió una biblioteca 2000-compuesto de moduladores potenciales de los mecanismos de control post-transcripcional ejercida a través de la 3 'UTR del gen MYCN. La Figura 3 representa los resultados de la criba primaria ejemplificado por una sola placa biblioteca. Señal de luciferasa se muestra como porcentaje de controles tratados con vehículo se obtuvo mediante la medición de la actividad de luciferasa en placas por triplicado de células CHP134-mycn3UTR tratados con compuestos de una sola placa biblioteca. Como se esperaba, la mayoría de los compuestos no tuvo efecto sobre la actividad de luciferasa como se indica por valores cercanos a la línea de base 100%. Los éxitos (cuadrados claros) fueron seleccionados establecer un umbral de X ± 2 SD, donde la x valor medio y SD se calculan sobre todos los valores de ensayo. Los compuestos que reducen la actividad de luciferasa por debajo del 20% (el marcado con asterisco) deben ser retirados de la consideración como la inhibición detectado más probablemente el resultado de pronouCNED toxicidad celular del compuesto.
La Figura 4 ilustra algunos ejemplos representativos de los datos obtenidos en el contador-de detección de alrededor de 100 compuestos. Como se puede juzgar por la señal de luciferasa normalizada en las células CHP134-CTRL, compuesto W a 2 mM concentración no tiene ningún efecto sobre la viabilidad celular, mientras que el compuesto X muestra alguna actividad citotóxica. Ambos compuestos W y X, sin embargo, causan MYCN 3 'UTR específico sobre regulación de la actividad de luciferasa, como se indica por la diferencia de cambio veces y t-test. Y Compuesto por 2 mM concentración parece comprometer la viabilidad de las células CHP134; en términos de especificidad no hay diferencia en la actividad de luciferasa en células CHP134-CTRL CHP134-mycn3UTR y. Finalmente, el aumento de la actividad de luciferasa detectada en el cribado primario para el compuesto Z no depende realmente de MYCN 3 'UTR, ya que una regulación equivalente se observó en las células CHP134-CTRL. No se detectó ningún golpe que resulta en MYCN 3 'UTR-específica baja regulación de la actividad de la luciferasa.
Figura 1:. Los componentes del ensayo de gen indicador basado en células El panel superior muestra diagrama esquemático del gen MYCN. La transcripción MYCN (NM_005378.4) está dibujado a escala. Cajas representan los exones con regiones sombreadas corresponden a los CDS, líneas representan los intrones. El reportero construye Luc-CTRL y Luc-3UTR-MYCN se representan esquemáticamente a continuación. CMV, citomegalovirus; SV40, virus de simio 40. La línea celular de neuroblastoma CHP134 fue elegido para producir células transfectadas de manera estable utilizando los plásmidos mencionados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Esquema del cribado primario Cada placa biblioteca compuesto solo se utiliza para tratar las placas por triplicado de células CHP134-mycn3UTR. La actividad de luciferasa se midió después de 24 horas de tratamiento.
Figura 3:.-Plate bien diagrama de dispersión de valores normalizados que representa una sola placa de 96 pocillos de la criba primaria células CHP134-mycn3UTR que crecen en placas de 96 pocillos se trataron con compuestos de la biblioteca en la concentración 2 mM. Cada punto corresponde a la actividad de luciferasa detectada para un único compuesto después de 24 h de tratamiento y se normalizó a la señal de luciferasa media detectada en los controles tratados con vehículo dentro de la misma placa. Se muestran los puntos de datos después de la posición compuestos dentro de una placa de 96 pocillos (10 compuestos en las columnas 2-10 de la A a la primaG). La media de más de tres repeticiones ± SD se muestra. Los accesos se muestran como cuadrados claros. Un golpe que se caracteriza por la disminución de la actividad de luciferasa por debajo del 20% se marca con asterisco.
Figura 4:. Ejemplos representativos de células estables contra-detección CHP134-mycn3UTR y CHP134-CTRL fueron tratados en paralelo con compuestos preseleccionados en el cribado primario. El ensayo de luciferasa se realizó después de 24 h de tratamiento en una concentración de 2 mM. El gráfico muestra los resultados representativos de los cuatro compuestos seleccionados designados W, X, Y, y Z. Cada barra corresponde a la actividad de luciferasa detectada para un solo compuesto y se normalizó a la señal de luciferasa media de los controles tratados con vehículo en las células estables indicados. Dobla diferencia de cambio y la significación estadística de la prueba t de dos colas se muestran, ** p <0,01,*** P <0,001.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Culture plate 96-well White | PerkinElmer | 6005688 | |
| StorPlate 96-well U bottom (dilution plate) | PerkinElmer | 6008190 | |
| 100 ml disposable trough for reagents | Tecan | 10 613 048 | |
| 300 ml disposable robotic reservoir | VWR | PB12001301 | |
| Robot tips DITI 50 μl Sterile | Tecan | 30038607 | |
| Robot tips DITI 200 μl Sterile | Tecan | 30038617 | |
| Matrix 1.4 ml 2D Barcoded w, Flat Bottom Tubes | Thermo Scientific | 3711 | |
| ONE-Glo Luciferase Assay System | Promega | E6120 | |
| RPMI | Lonza | BE12-918F | |
| PBS-1x, w/o Ca2+, Mg2+ | Lonza | BE17-516F | |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | BE17-605E | |
| FBS | Lonza | DE14-801F | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| The Spectrum collection (compound library) | MicroSource Discovery Systems | N/A | |
| Tecan Freedom EVO200 robot | Tecan | N/A | |
| Tecan F200 multiplate reader | Tecan | N/A |
References
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