Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Засохшей крови пятна - подготовка и обработки для использования в Immunoassays и молекулярных методов

Published: March 13, 2015 doi: 10.3791/52619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Virology, National Reference Centre for Hepatitis C, Essen University Hospital, University of Duisburg-Essen

Summary

Подготовка и обработка засохшей крови пятна (DBS) для их окончательного анализа по-прежнему плохо стандартизированы для большинства диагностических приложений. Чтобы преодолеть этот недостаток, всеобъемлющий поэтапный протокол предложил и впоследствии оценивается с точки зрения ее эффективности для обнаружения маркеров вирусных инфекций.

Abstract

Идея сбора крови на карте бумаги и впоследствии с помощью засохшей крови пятна (DBS) для диагностических целей, возникли столетие назад. С тех пор DBS тестирования для десятилетий остается преимущественно ориентированным на диагностике инфекционных заболеваний, особенно в условиях ограниченных ресурсов или систематического скрининг новорожденных для унаследованных метаболических расстройств и только недавно имеют целый ряд начали появляться новые и инновационные DBS приложений. На протяжении многих лет, предварительно аналитических переменных только ненадлежащим образом рассматривались в области тестирования DBS и даже сегодня, за исключением новорожденных скрининг, весь предварительно аналитический этап, который включает в себя подготовку и обработку DBS для их окончательный анализ не были стандартизированы. Учитывая вышесказанное, всеобъемлющий шаг за шагом протокол, который охватывает Аль основных этапов, предлагается, то есть, сбор крови; подготовка пятна крови; Сушка пятна крови; Хранение и транспортировка DBS; Элюирующий DBS и, наконец, анализ элюаты DBS. Эффективность этого протокола впервые проводилась с 1762 спаренных сыворотка/DBS пар для обнаружения маркеров вирус гепатита B, вируса гепатита С и вирусом иммунодефицита человека инфекций на автоматизированной аналитической платформы. В качестве второго шага протокол был использован во время экспериментального исследования, которое проводилось на активных потребителей наркотиков в городах Германии Берлин и Эссен.

Introduction

Идея использования крови, собранные на карте бумажные из целлюлозы приписывается Ивар христианских Bang (1869-1918), отец современной клинической микроанализ1, 2. В 1913 году Bang определяется глюкозы из элюаты засохшей крови пятна (DBS)3 и, позднее, также исполнил азота измерений методом Кьельдаля с эта Бумага фильтровальная техника2. Впоследствии несколько следователи сообщили об использовании БД для серологических тестирования для диагностики сифилиса2. Как рано как в 1924, Чепмен обобщены преимущества DBS тестирования когда он особенно подчеркнул четырех пунктов, которые по-прежнему актуальны сегодня: (1) по сравнению с обычными венепункции, требуется меньше объем крови, и этот факт был самым важным в педиатрии Диагностика; (2) крови коллекции простых, не инвазивных и недорогой; (3 риск бактериального загрязнения или гемолиз является минимальным; и (4) DBS могут быть сохранены для длительных периодов с почти не ухудшение аналитов2, 4. Помимо его использования в тестирование на сифилис далее раннего применения метода DBS включали, например, обнаружение антител против кори, эпидемического паротита, полиовирусом, вирус парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (RSV) в 1953 году2, Идентификация шигеллы в фекалиях сушат на фильтровальную бумагу и отправлены по почте из Индонезии в Лейден в Нидерландах, а также выявления антител к Schistosoma в DBS в эндемичных районах и проанализированы более чем на три месяца позже5 . В 1963 году пятьдесят лет спустя после взрыва в оригинальной коммуникации2, 6, Гатри наконец опубликовал его известный метод диагностики фенилкетонурия из БД, получены на пятке укол от новорожденных7, 8.

Хотя с того времени DBS были расценены как часто применяется метод для сбора, хранения, транспортировки и анализа различных жидкостей человеческого организма5, их использование в диагностике по-прежнему преимущественно сосредоточены на диагноз инфекции, особенно в условиях ограниченных ресурсов и систематического скрининга новорожденных для унаследованных метаболических расстройств на протяжении десятилетий9, 10. С 2005 года однако, целый ряд новых и новаторских DBS приложений начали возникать. Это привело к почти экспоненциальное увеличение числа соответствующих научных публикаций по DBS от 50 до почти 450 ежегодно в настоящее время. Среди новых приложений в таких разнообразных областях, как токсико - и фармакокинетические исследования, метаболические профили, терапевтического мониторинга лекарственных препаратов, судебная токсикология или контроля загрязнения окружающей среды10, 11.

Испытания БД таким образом, сделала триумфальное шествие через клинической лабораторной диагностики в течение последних 100 лет2. Как в клинической химии12однако, в марте этого года предварительно аналитических переменных не рассматривались должным образом на протяжении многих лет. Действительно даже сегодня, после таких выдающихся мероприятий, как CDC в фильтровальную бумагу оценки проекта13 или разработке национального стандарта для сбора крови на фильтровальной бумаге в рамках новорожденных, скрининг14, предварительно аналитический этап по-прежнему во многом недооценивается в большинстве других областей, в которых DBS тестирование является прикладной5, 10.

Учитывая вышесказанное, для подготовки и обработки DBS в следующем сообщении предлагается всеобъемлющий поэтапный протокол14-16 для использования в иммуноанализа и молекулярных методов, которая охватывает все основные шаги,: (1) Сбор крови; (2) подготовка пятна крови; (3) высыхания пятна крови; (4) для хранения и транспортировки; (5) элюции DBS; и наконец (6) анализ элюаты DBS. Сначала оценивать эффективность протокола с 1762 спаренных сыворотка/DBS пар для выявления гепатита B вирус (HBV) поверхностный антиген (HBsAg), антитела к ГВ основных антигена (анти HBc), антитела гепатита в поверхностный антиген (анти HBs), HBV ДНК, антитела вирус гепатита С (HCV) (анти HCV) РНК ВГС и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1-p24-антиген/анти-ВИЧ 1/2 с использованием чувствительных качественные нуклеиновых кислот или полностью автоматизированная платформа тестов. 17. в качестве второго шага, протокол был использован в экспериментальное исследование «наркотики и хронические инфекционные заболевания» («DRUCK исследование») который был проведен по института Роберта Коха-в тесном сотрудничестве с национальным центром ссылки для гепатита С на активных инъекционных наркотиков в городах Германии Берлин и Эссен18.

Protocol

Поскольку протокол предназначен для использования в медицинской диагностике, его применение должно следовать принципам Хельсинкской декларации19. Для первой части результатов, представленных в этой связи, как отдельное соглашение пациентами и одобрения Комитета по этике казалось необязательным по двум причинам: (1) «при поступлении» в больницу Университета Эссен, «каждый пациент предоставляет письменное согласие все необходимые биохимические, бактериологического и вирусологических расследования.» 17 (2) «все образцы, используемые в оценке DBS тестирования были отправлены в институте вирусологии в процессе обычной клинической диагностики. Таким образом ни один из образцов была собрана специально для целей исследования, была выполнена не одного дополнительного венепункции и ни один из материалов был протестирован для любых параметров, кроме тех, которые требуются врачи в ходе нормального Диагностические работы вверх.» 17 исследование «Наркотики и хронические инфекционные заболевания» (DRUCK исследование»)18, в котором DBS тестирования наконец использовался в немецких городах Берлине и Эссен оценить людей, которые активно потребляют инъекционные наркотики, был одобрен Федеральный комиссар для данных Защита и свободе информации (Берлин, Германия), а также как Комитетом по этике медицинского университета Шарите (Берлин, Германия).

1. Сбор крови

  1. Венепункции14, 15, 20, 21
    1. Наденьте перчатки одноразовые латекса и очистить площадь участка предполагаемой пункции (предпочтительно средний локтевого вен в локтевой ямки) с соответствующим дезинфицирующим средством, например, 70% изопропиловый спирт.
    2. Примените жгут 4 – 6 дюймов выше предполагаемого прокол сайт раздуваться Вены. Руководство иглы в Вену пациента и, после того, как она находится в месте, аккуратно заполнить связанные крови трубки, который содержит ЭДТА как антикоагулянт.
    3. Как только завершится венепункции, выпуск жгут и снять иглу. Затем нажмите сухой марлевый тампон на сайте прокол, который впоследствии может быть проведен в месте повязкой.
  2. Прокола кожи (рис. 1A)13-15, 20, 22, 23
    1. Наденьте перчатки одноразовые латекса.
    2. До прокола кожи пациент должен теплые руки. Палец является массируемую anterogradely обогащения, приток крови к в пункционная сайта.
    3. Очистите кожу ладонной стороне кончика дистальной фаланги третьего или четвертого пальца руки не писать с подходящей дезинфицирующего средства, например, 70% изопропиловый спирт. Прокол кожи путем однократного использования безопасности Ланцет. Палец должен проводиться в таком положении, что гравитация облегчает сбор крови на кончик пальца.
    4. Когда коллекция капиллярной крови методом прокола кожи является полным, повязку на кончик пальца.

2. Подготовка пятна крови

  1. Подготовка из крови, собранные венепункции15
    1. Месте собраны анти коагулируют (ЭДТА) весь венозной крови на фильтр карты как можно скорее. Не готовить пятна засохшей крови, более чем на 24 часа после венепункции.
    2. Собрать всю информацию, необходимую для идентификации пациента на карточку фильтра. Одна карта должна быть заметили только с кровью одного человека.
    3. Наденьте перчатки одноразовые латекса.
    4. Аккуратно перевернуть пробирка 2 – 4 раза и впоследствии открыть пробку осторожно.
    5. Аспирационная 50 мкл целом венозной крови с помощью пипетки с одноразовый наконечник. Передачи крови в центр одного круга без касатьться фильтровальной бумаги непосредственно с кончика пипетки. Попробуйте полностью насыщают круг.
    6. Повторите эту процедуру, чтобы заполнить все требуемые круги карты.
  2. Подготовка из крови, собранные кожи пункции (цифры 1B и 1 C)13-16, 23
    1. Протрите первой капли крови с марлевой, потому что он может содержать избыточной ткани жидкости. Массаж палец снова, чтобы увеличить приток крови в месте прокола. Перевести следующие падение в один из кругов карточку фильтра не касаясь поверхности непосредственно с пальца. Позволит кровь, чтобы быть выдержаны в текстуру фильтра капиллярных сил только.
    2. Пусть следующее большое падение формы капиллярной крови на кончик пальца и собирают его в следующий круг. Продолжите эту процедуру, пока не будут заполнены все необходимые круги или останавливает поток крови.
    3. Не сжать или «молочный» палец чрезмерно если поток крови не достаточно, чтобы заполнить все требуемые круги карточку фильтра. Если поток крови останавливается место повязку на кончик пальца. Выполните второй прокол кожи на другой палец, если больше крови необходимо для рассмотрения.

3. Сушка пятна крови

  1. Сухие пятна крови, поставить фильтр карты на чистое бумажное полотенце в кабинете биологической безопасности и дайте им высохнуть, предпочтительно O/N (но для по крайней мере 4 часов), на RT в отсутствие любого внешнего источника тепла. Когда процесс сушки является полным, пятна крови имеют равномерно темно коричневого цвета и не красный областях видны больше (рис. 1 d)13, 15, 16.

4. Хранение и транспортировка засохшей крови пятна (DBS)

Примечание: Обработка пятна крови может быть прервано после высыхания. Фильтр карты теперь может быть хранимой13-16, 23.

  1. Для хранения поставьте фильтр бумага карты в единый, газ непроницаемый молнию мешок, содержащий 1-2 Влагопоглащающие пакетики для защиты от влаги (Рисунок 1E) образцы. При необходимости добавьте карту Индикатор влажности.
  2. Перевести этот мешок в холодильнике при температуре-20 ° c или ниже как можно скорее. Если морозильных камер не доступны в полевых условиях, хранения при температуре-4 ° C или даже при температуре возможна до 14 дней.
  3. Перевозка замороженных образцов DBS на сухой лед. Для фильтра карты изначально храниться при комнатной температуре используйте систему тройной упаковке, которая состоит из молнии пробе как внутренний контейнера(ов), а также внутренний и внешний конверт. Нет содержания маркировки требуются на внешний конверт для отправки по почте, но символ международного биологической должны быть прикреплены к основной внутренний контейнер16.
  4. Исключите фильтр карты из дальнейшей обработки если осушитель пакеты или дополнительные влажность индикатор карты изменяется в розовый цвет.

5. элюции засохшей крови пятна,13, 15, 16, 23

  1. Выбивать одно пятно с устройством одноразового использования 6 мм от каждого пропитанной кровью круг карточку фильтра класса 903 (Рисунок 1F). Передача всех ударил засохшей крови пятна от одного пациента один колодец 12-ну пластины.
  2. Заполните и фосфат амортизированное saline, содержащие азид натрия 20 анимации и 0,08% 0,05% (рис. 1 g). Адаптировать объем дополнительного буфера минимальные соответствующие требованиям анализа используется для последующего анализа элюаты пятна засохшей крови.
  3. Повторите эти шаги для получения второй серии СПОТ элюаты засохшей крови для того, чтобы выполнять молекулярного анализа.
  4. Наденьте пластину культуры клеток шейкере лаборатории и пусть кулаками засохшей крови пятна осторожно элюировать минимум 4 hr или, предпочтительно, O/N (рис. 1 H).
  5. На следующий день, пятна, почти свободный от крови и гемолитические supernatants создали (Рисунок 1I). Передать эти элюаты microcentrifuge трубы. Затем при условии их центрифугированием на 2 мин на 10500 x g (Рисунок 1J) освободить supernatants от любого мусора, которые сформированы во время элюции (рис. 1 K).

6. анализ элюаты

  1. Центрифугировали элюаты теперь готовы быть использованы для анализа предполагаемых. Расследовать элюаты маркеров вирус гепатита в, вирус гепатита С и ВИЧ-инфекции, используя имеющиеся наборы и строго следуйте указаниям соответствующих производителей (рис. 1 Л).

Figure 1
Рис. 1. Графический обзор протокола предлагается в этой связи для подготовки и обработки засохшей крови пятен использоваться в иммуноанализа и молекулярных методов. Целом венозной крови и капиллярной крови, полученные путем венепункции или прокол кожи, стрельчатые (A) может служить образцы для анализа пятно засохшей крови. После передачи крови в кругах карточку фильтра класса 903 (B, C) образцы должны быть просушены предпочтительно O/N при температуре окружающего воздуха в биологической безопасности кабинета формы пятна равномерно коричневого цвета без каких-либо interspersion красный районы (D). При сушке пятна крови является полным и хранения необходимо, фильтр карты могут быть упакованы в газа непроницаемый zipper мешки, содержащие 1 – 2 Влагопоглащающие пакетики (E). Дальнейшие лабораторная обработка DBS составляют поколение штампов устройство одноместное размещение 6 мм от центра кругов (F, G), элюирование кулаками в буфере на основе PBS для минимум 4 hr или, предпочтительно, O/N на шейкере (H ), восстановление элюаты, (я) и, наконец, центрифугирование лабораторной чашки (J), чтобы освободить DBS элюаты от любого мусора, которые могли бы возникла во время процесса элюции (K). Впоследствии DBS элюаты готовы для анализа, которые были выполнены полностью автоматизированная платформа (L) для того, чтобы обнаружить серологических маркеров инфекции ВГВ, ВГС и ВИЧ, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Representative Results

Эффективность протокола предложил для подготовки и обработки DBS впервые оценивалась путем анализа 1762 спаренных сыворотка/DBS пар для маркеров ВГВ, ВГС и ВИЧ-инфекции. 17. для этой цели, DBS были подготовлены от 100 мкл целом венозной крови (см. пункты 2.1.1 – 2.1.6 протокола предыдущего) и были этого eluted с 1000 мкл PBS-основе буферизировать, каждый, (см. пункты 5.1 – 5.5 вышеупомянутого протокола) для завершения процесса для всех семи параметров в двух отдельных операций. Такой подход без тщательной оптимизации элюции условий для каждого единого аналита представляется неизбежным потому что пропускная способность довольно высокий образец ожидалось в сравнительно короткое время в ходе предстоящей поля исследования «наркотики и хронический Инфекционные болезни» («DRUCK исследование»).

Все измерения придерживаться рекомендаций производителя в ходе анализа DBS, но пришлось изменить в отношении определения HBsAg и анти HBs компенсировать эффект гемолиз или в результате разрежения. С порогового значения 0,05 МЕ/мл, HBsAg тестирование DBS элюаты приводят к курсу ложных срабатываний 14,7% (52 из 354) по сравнению с сыворотка примеры (рисунок 2A). Приемник операционных характерным (ROC) анализ25, 26 данных указывается, что увеличение порога до 0,15 МЕ/мл приведет к идеальное разделение HBsAg-срабатываний от HBsAg негативы (0,986 [чувствительность], 0,000 [1-специфика], Рисунок 2B). С другой стороны с производства 10 МЕ/л для количественного определения анти HBs антител, что показатель ложно отрицательные измерений 14,2% (47 из 331) был записан (рис. 2 c). Следовательно после анализа РПЦ снова, это отсечения был снижен до 1,5 МЕ/л для достижения оптимального дискриминации значений (0.917 [чувствительность], 0,007 [1-специфика], Рисунок 2D).

Figure 2
Рисунок 2. HBsAg и анти HBs тестирование в DBS элюаты (с изменениями от17). ROC-руководствуясь увеличение порогового значения для количественного определения HBsAg от 0,05 МЕ/мл (A) до 0,15 МЕ/мл (B) снижена скорость ложно положительных результатов от 14,7% до 0%. Аналогичным образом ROC-анализ концентраций анти HBs предложил сокращение соответствующих порога от 10 МЕ/л (C) до 1,5 МЕ/л (D), тем самым полностью устраняя ложь негативы, которые первоначально приходилось 14,2% всех определений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Результаты анализов спаренных сыворотка/DBS кратко излагаются в таблице 117. Нет не специфика был записан в ходе тестирования для любой из семи аналитов DBS.

Когда на наличие HBsAg, т. е. серологические параметра key острые и хронические инфекции HBV, были расследованы DBS элюаты Аналитическая чувствительность 98,6% было определено. Концентрации HBsAg в двух ложно отрицательных sera были 749 МЕ/мл и 6 МЕ/мл, соответственно. Антител анти-HBc успешно были обнаружены в 176 из 204 (i. e 86,3%) DBS элюаты. Двадцать два из 28 образцов, которые не были обнаружены путем измерений, возникла из Co-зараженных ВИЧ лиц. Таким образом если ВИЧ-инфицированных были исключены из расчета, чувствительность 97,1% было достигнуто для извлечения антител анти HBc от eluted сушеные целом венозной крови. Аналогичные замечания верно для определения антител анти HBs. Даже после корректировки порогового значения assay до 1,5 МЕ/л произошло девять противоречивые сыворотки DBS результаты. В пациентов, не совместно инфицированных ВИЧ были найдены 11 – 26 МЕ/л в сыворотке анти HBs, которые являются слишком низкими для обнаружения после элюции засохшей крови.

Антитела анти-HCV свидетельствуют либо инфекции, острые или хронические или решены. Только четыре (i. e. 2,2%) анти HCV ложно отрицательные результаты были определены от элюаты DBS и далее серологических и молекулярного анализа четко продемонстрировали, что соответствующие sera очень вероятно были взяты из пациентов, которых инфекции давно решена.

Обнаружение антител анти-ВИЧ в DBS элюатов с полностью автоматизированной системой был полностью плавный процесс, который произвел Аналитическая чувствительность 100%.

«Концентрация среднее HBV ДНК из цельной крови элюаты была выполнена на 100 образцов (концентрация ДНК: 1,573,898 МЕ/мл, диапазон: < 357 - > 17,860,000 МЕ/мл) и дали значение 93,0%. Таким образом семь образцов с низкой в сыворотке HBV ДНК между 409 и 3,643 МЕ/мл не были обнаружены, DBS тестирования. Из 100 сера, которые доказали быть РНК ВГС позитивные (концентрация РНК ВГС: 1,415,944 МЕ/мл, диапазон: 2,479 - > 7,692,000 МЕ/мл), соответствующий аликвоты цельной крови были доступны. Сравнительное исследование привело к аналитической чувствительности 100% для определения РНК ВГС с DBS элюаты.» 17

Чтобы проверить изложенные протокол для подготовки и обработки DBS в полевых условиях, он был использован в тесном сотрудничестве с института Роберта Коха-(Берлин, Германия) во время экспериментального этапа исследования «Наркотики и хронические инфекционные заболевания», который был проведено активных потребителей наркотиков в городах Германии Берлин и Эссен18. Все 534 участников поступил (433 мужчин и 101 женщин) прошли забора капиллярной крови как подробно описывается в разделах 2.2.1-2.2.3 Протокола предыдущего, и DBS опять же, этого eluted путем добавления 1000 мкл буфера на основе PBS.

Два лица были диагностированы хронически инфицированных ВГВ, и 39 показал серологических шаблон решена HBV-инфекции. Кроме того 15 участников были позитивными для анти HBs (статус после вакцинации) и восемь были признаны позитивным для анти HBc одиночку. Анти ВГС среди участников составлял 57,3% (N = 193) в Берлине и 73,0% (N = 144) в Эссене. От антител позитивных образцов 65% (N = 125) и 62% (N = 89) также были viremic. Двадцать пять из 534 лица оказались позитивными на анти-ВИЧ. Девятнадцать из инфекций были уже известны, и 24 из этих лиц были сочетанной с ВГС.

Результаты, полученные путем тестирования DBS были тщательно по сравнению с анамнестических данных участников исследования статуса сообщенные HBV и HCV. Это сравнение в сочетании с результатами тестирования в сочетании сыворотка/DBS пар привело к незначительные изменения алгоритма тестирования для основного этапа «DRUCK исследование», которая будет поступать активных потребителей наркотиков в шести дополнительных крупных немецких городах: «лица инфицированных ВИЧ всегда будет проверяться на наличие ДНК HBV. Участники, чьи DBS элюаты являются позитивными для анти HBc или анти HBs должны подвергаться венепункции во время второй консультации для того, чтобы обязательно уточнить их статус анти HBc/анти HBs и, наконец, будут проверяться все DBS элюаты для РНК ВГС независимо от результатов тестирования анти HCV.» 17

Параметры Спаренные сера/DBS элюаты (N) Противоречивые результаты (N) Причина расхождений между тестирования сыворотки и DBS элюаты
ГВ
HBsAg 299 2 Два больных с хронической инфекцией HBV. Оба были под противовирусное лечение и один из них был совместно инфицированы ВИЧ. HBsAg концентрации в сыворотке крови: 749 МЕ/мл и 6 МЕ/мл, соответственно.
Анти HBc 305 28 В сыворотке крови двадцать два пациентов был решен ВГВ. Шесть человек показал серологических вывод «анти HBc один». Двадцать два из пациентов были сочетанной с ВИЧ. От «сопоставителей ГВ», 20 были оценены как «Анти HBs позитив только «DBS тестирования и, таким образом, были ошибочно классифицированы как «состояние после вакцинации».
Анти HBs 310 9 Четыре не совместно инфицированных ВИЧ пациентов имели концентрации в сыворотке крови анти HBs 11 ‑ 26 МЕ/л, которые являются слишком низкими для обнаружения антител после элюции засохшей крови пятен.
HBV ДНК 150 7 Соответствующие sera были получены из семи пациентов с низкой сыворотке HBV ДНК от 409 МЕ/мл до 3,643 МЕ/мл.
ГЕПАТИТ С
Анти HCV 339 4 Эти четыре сера была взята из пациентов, с издавна решены HCV инфекции.
HCV РНК 150 0 –
ВИЧ
ВИЧ 1-p24/анти-ВИЧ 1/2 209 0 –

Таблица 1: Результаты, полученные из 1762 DBS, которые были подготовлены и обработаны от всей венозной крови после протокол, предложенных в этой связи, по сравнению с выводами в образцах сыворотки спаренных как ссылка.

Discussion

DBS были использованы для 100 лет2 но, удивительно, есть еще нет общего консенсуса об их подготовке и обработке. На сегодняшний день, достаточно стандартизации этого важного предварительного аналитического этапа только был достигнут в области обследования новорожденных14, тогда как для всех других приложений DBS тестирование5, 16, 23существует целый ряд различных протоколов. Для преодоления этой замечательной неоднородности, всеобъемлющий шаг за шагом инструкции для подготовки и обработки DBS использоваться в иммуноанализа и молекулярных методов представлена в этой связи и оценивается с точки зрения ее эффективности для обнаружения маркеров инфекции ВГВ, ВГС и ВИЧ. После обсуждения прежде всего акцент на различные этапы предлагаемый протокол.

В истории DBS тестирования многих различных фильтровальная бумага карты были используется2 , но сегодня только два коммерческих источников утвержденных FDA как класс II медицинские приборы для сбора крови5, 16. Эти системы карточка фильтра очень равномерное и имеют очень похожие характеристики поглощения, так что аналитические результаты, полученные от капиллярной крови, приготовленные на любой из них не отличается более чем на 4%-5%28. Не удивительно, Masciotra и коллегами29 поэтому обнаружено РНК ВИЧ-1 одинаково хорошо с качественного анализа после элюции от крови коллекции карт из разных источников. Учитывая эти данные, он может быть практически исключены что любых несоответствий, наблюдается при тестировании сочетании сыворотка/DBS пар для маркеров ВГВ, ВГС и ВИЧ инфекции17 было вызвано выбор фильтра карты только. Однако когда необходима точная количественная оценка аналита, источник исходный вариант больше не может быть незначительным и более изощренные методы, например, перфорированные DBS (PDBS) как метод для microsampling30 или подготовки сушеная сыворотка пятен (DSS)31 , возможно, придется применять вместо обычных DBS тестирования10.

Поскольку только небольшое количество крови используются для тестирования баз данных (одна капля капиллярной крови состоит из примерно 50 мкл)5, 16, колебания в объеме образца имеют решающее значение и, по общему признанию, по крайней мере некоторые из расхождений между серологических результатов и участника самостоятельно HBV и HCV статус, записанный во время пилотирование «Исследование DRUCK» объясняются этой переменной. Самым важным фактором для минимизации объема образца «колебания», несомненно, правильная техника сбора капиллярной крови, что может быть достигнуто только путем тщательного и непрерывной подготовки технического персонала22. Кроме того, в качестве меры контроля качества все лаборатории, работа с БД должен уже инициировали процедуры для выявления и впоследствии исключая DBS образцы, которые должны рассматриваться как неудовлетворительное или недопустимый16.

Исследования, проведенные главным образом в контексте ВИЧ32 и33 обследования новорожденных показали, что высокая влажность может привести к деградации аналитов, но до сих пор не достигнут консенсус в вопросе о как долго DBS должен быть воздушно-сухой . Интервал по крайней мере 4 hr или предпочтительно O/N предлагается в этой связи, которая таким образом принял условия, которые были использованы в подавляющем большинстве всех соответствующих публикаций32, 34 данные о хранении DBS впоследствии использоваться для HBV и HCV тестирование являются противоречивыми. В 1981 году, Вилла и коллег35, который применил современных аналитических методов, сообщили, что хранения на RT не затрагивает результаты анализов ГВ в течение весь период наблюдений 180 дней, если титры антител были > 1/1000, но что DBS После 15 дней, когда титры в сыворотке были лишь 1/100 стал граница положительных или даже отрицательным. Для хранения от-20 ° C или 4 ° C не привели в существенном улучшении. Напротив исследование, проведенное тридцать лет позже36 испытания реплицирует HBV-положительных образца, и авторы нашли что анти HBc, а антител анти HBs были стабильными до 183 дней на RT, тогда как HBsAg при тех же условиях стала ложно отрицательные уже после 63 дней. Что касается обнаружения HBV ДНК от DBS элюаты, концентрацию вирусной нуклеиновой кислоты был стабильным, по крайней мере за семь дней на37 37 ° C или оказался «резистентность» к хранения на RT на срок до трех недель38. Тестирование на наличие антител анти HCV, используя два коммерчески доступных третьего поколения, предоставленные иммуноанализа39 точные результаты в течение 117 дней, с использованием образцов DBS температуре-20 ° C, 2-8 ° C и 20-25 ° C, соответственно. Хранения при температуре-20 ° C, однако, привели к низкой вариации оптических плотностей. Применяя четвертого поколения анти HCV ELISA, т.е. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, в контексте DBS, тестирование, Larrat и др. 40 наблюдается резкое снижение аналитической специфика после хранения образцов баз данных для более чем трех дней на RT. С другой стороны были получены точные результаты тестирования с тот же комплект, используя образцы, сданный Брандау и коллег4160 дней в различных условиях (-20 ° C, 2-8 ° C и 22-26 ° C). Замечания на снижение концентрации РНК ВГС в БД при различных условиях хранения варьируются от без существенного изменения в РТ на срок до одного года42 десятикратное изменение после четырех недель при температуре43. Принимая этот довольно противоречивые данные о стабильности HBV и HCV антигены, нуклеиновых кислот и антител в расчет, представляется разумным втягивается в предлагаемом протоколе к консенсусу, который был определен ранее для хранения образцов DBS использоваться для ВИЧ тестирование15, 30: для краткосрочных осаждения (до двух недель) антигены, нуклеиновой кислоты вируса и антител рассматриваются как стабильной на RT, тогда как на замороженных условий оптимального хранения для более длительных периодов.

Как правило, три параметра должны учитываться при проектировании элюции протокол: (1) Элюирующий буфер; (2 продолжительность и температура элюции; и (3) объем элюции23. В подавляющем большинстве всех соответствующих публикаций фосфат амортизированное saline (PBS) был использован для элюирующие DBS, и большинство авторов добавил белка, например, бычьим сывороточным альбумином (БСА) или Tween-20, ПАВ, с целью улучшения анализа сигнала путем стабилизации белки, как они идут в раствор и одновременно блокировки неспецифической привязки сайтов23. Лишь в нескольких докладах, которые непосредственно сравнить различные элюции буферов в контексте DBS тестирования, доступны. Виллар и др. 36, например, записанная почти эквивалент элюции потенциала для всех буферов, но PBS/BSA 0,5% привело к в наименьший уровень неспецифической реактивности. Очень аналогичное замечание было высказано Крум и коллег44 при применении образца растворитель объектиивные генетики систем ОВОС для Элюирование антител анти HCV из БД. Поскольку риск деградации образца является чрезвычайно низким, в первые часы после подготовки БД (см. выше), было решено для инкубации пятна O/N при комнатной температуре и поддержать процесс элюции смешивая нежный-над конца. Этот подход имеет то преимущество, что образцы перфорированные из предыдущих день могут быть непосредственно переданы рутинной диагностики рано следующим утром23. Объем буфера должны быть адаптированы к минимальным требованиям соответствующих анализов, используется для последующего анализа с целью снизить коэффициент разрежения. Однако тщательной оптимизации элюции условий для каждого единого аналита не удалось в предыдущей оценке, потому что высокая производительность гарантируется в сравнительно короткое время во время «DRUCK исследование»17. Следовательно довольно неблагоприятных объем 1000 мкл буфера на основе PBS была использована для завершения процесса весь элюции для всех параметров в двух отдельных операций.

Этот подход одной стороны не «полностью в системе анти HBc/anti-HBs для тех лиц, инфицированных ВИЧ, из-за низкой антитела концентрации; ... и она требует молекулярные биологические процедуры с оптимальным Аналитическая чувствительность в отношении HBV ДНК и РНК ВГС испытаний.» 17 с другой стороны, высокая элюции объем оказался никоим образом неблагоприятное для определения HBsAg, анти HCV и анти-ВИЧ, наборы, используемые при оценке. «Определение HBsAg положительных материалы из цельной крови элюаты удалось с чувствительностью 98,6% аналогично высокой степени как и в предыдущих исследований, которые частично использованы гораздо меньший объем элюции 100 мкл, 250 мкл, или 600 мкл или 500 мкл»17 ,36, 45, 46. Чувствительность 97,8%, определяется в ходе расследования 179 сыворотка/DBS пар для антител анти HCV соответствует результаты уже существующих сообщает24, 44, 47, 48, 49, который работал с Томом элюции, который был ниже ПДК от 5 до 10. «Кроме того, протоколы для обнаружения анти ВГС надлежащим образом оптимизирована..., устанавливая их собственных точек отсчета»,17, 24, 48, 49 «или путем увеличения объемов образца от 20 мкл до 100 мкл.» 17, 49 наконец, аналитическая специфичность и чувствительность (100%), установленные для обнаружения анти-ВИЧ были равными или превосходит характеристики производительности других immunoassays, специально адаптированных к DBS тестирования50, 51 «или поэтапный процедура с комбинированным использованием несколько анти-ВИЧ тестов»17,52. «Они, действительно, также превысил рекорд производительности assay который были специально разработаны и оптимизированы для обнаружения антител анти-ВИЧ в DBS элюаты (Q-предотвращение ВИЧ 1 + 2 Комплект DBS).» 17, 53  

Вместе взятые, всеобъемлющий шаг за шагом протокол, представленный в этой связи оказался осуществимым и удобный инструмент для подготовки и обработки DBS и таким образом, можно надежно в диагностической вирусологии. Это позволяет подходы с использованием автоматизации 54 и из-за его отличные ходовые характеристики имеет потенциал, чтобы служить своего рода учредительств камень для будущего консенсуса общепринятых протокола в глобальной области DBS тестирования в лаборатории медицины.

Disclosures

В прошлом RSR получил гонорар для доставки лекции и финансовую поддержку для его научной работы от Abbott диагностики. НГ и ом заявляют, что они имеют не конфликтующие интересы.

Acknowledgments

Это сообщение основано на ранее опубликованные в17 вирусологии журнал в режиме открытого доступа на условиях лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) с BioMed Central как результаты Лицензиата. Авторы с благодарностью признаем плодотворное сотрудничество в рамках эксперимента в исследовании «Наркотики и хронические инфекционные заболевания» («DRUCK исследование») с U. Маркус, W. Цай, W. Чжан и р. Циммерманн от института Роберта Коха-(Берлин, Германия) и благодарны S. Moyrer для принимая фотографии собраны в Рисунок 1 а также D. F. Whybrew, К.т.н., (Гёттинген, Германия) для исправления рукопись. Они также выражают свою признательность за умелое технической помощи J. Акерман, э. Bayrambasi, U. Бюттнера, S. Dziubek, I. Jakobsche, б. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Меткалф, J. Piejek, S. Саар, м. Шретер и K. Seidel. Это исследование было частично поддерживается Грант немецкого министерства здравоохранения Национальный справочный центр для гепатита с.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Latex rubber gloves Hartmann #4049500041515
70% isopropyl alcohol Bode Chemie #9768050
Mulifly safety cannula Sarstedt #85.1638
EDTA blood collection tube Sarstedt #02.1066.001
Adhesive bandage Hartmann #2994163
Dry gauze pad Hartmann #143213
Singel-use safety lancet Owen Mumford #3802421
Filter paper card Whatman/sigmaaldrich #10534612 Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips Starlab #S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag Flexico #20219
Mini desiccant bag Tropack #-
Disposable Punch pfmmedical #48601 6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps Servoprax #H7301
12 Well Cell Culture Plate Greiner #665180
PBS Buffer Gibco #14190-136
Tween 20 Applichem #A1389.0500
Sodium Azide Merck #66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf #30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative) Abbott #6C3642
ARCHITECT anti-HBc II Abbott #8L4425
ARCHITECT anti-HBs Abbott #7C1825
ARCHITECT anti-HCV Abbott #6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Abbott #4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit Roche #6374891001
artus HBV LC PCR Kit Qiagen #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD Siemens Healthcare #2554311

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, V. Ivar Christian Bang (1869 - 1918), founder of modern clinical microchemistry. Clin Chem. 32 (1), 213-215 (1986).
  2. Hannon, W. H., Therell, B. L. Overview of the history and applications of dried blood spot samples. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 3-15 (2014).
  3. Bang, I., Bergmann, J. F. Der Blutzucker. , Wiesbaden. Available from: https://archive.org/details/derblutzucker00bang (1913).
  4. Chapman, O. D. The complement-fixation test for syphilis. Use of patient's whole blood dried on filter paper. Arch Derm Syphilol. 9 (5), Available from: http://archderm.jamanetwork.com/article.aspx?articleid=495323 607-611 (1924).
  5. Smit, P. W., Elliott, I., Peeling, R. W., Mabey, D., Newton, P. N. An overview of the clinical use of filter paper in the diagnosis of tropical diseases. Am J Trop Med Hyg. 90 (2), 195-210 (2014).
  6. Kuehn, B. M. After 50 years, newborn screening continues to yield public health gains. JAMA. 309 (12), 1215-1217 (2013).
  7. Guthrie, R. Blood Screening for Phenylketonuria. JAMA. 178 (8), Available from: http://jama.jamanetwork.com/article.aspx?articleid=332184 863 (1961).
  8. Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
  9. Snijdewind, I. J., van Kampen, J. J., Fraaij, P. L., vander Ende, M. E., Osterhaus, A. D., Gruters, R. A. Current and future applications of dried blood spots in viral disease management. Antiviral Res. 93 (3), 309-321 (2012).
  10. Demirev, P. A. Dried blood spots: analysis and applications. Anal Chem. 85 (2), 779-789 (2013).
  11. Li, W., Lee, M. S. Preface. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. VIII-IX (2014).
  12. Guder, W. G., Narayanan, S., Wisser, H., Zawta, B. Diagnostic Samples: From the Patient to the Laboratory. The Impact of Preanalytical Variables on the Quality of Laboratory Results. , 4th edition, Wiley-VHC. Weinheim. (2009).
  13. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1632S-1636S (2001).
  14. NBS01-A6. Blood Collection on Filter Paper for Newborn Screening Programs; Approved Standard-Sixth Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available at: http://shop.clsi.org/c.1253739/site/Sample_pdf/NBS01A6_sample.pdf (2013).
  15. WHO manual for HIV drug resistance testing using dried blood spot specimens. , World Health Organisation (WHO). Available at: http://www.who.int/hiv/pub/drugresistance/dried_blood_spots/en/ (2012).
  16. Mei, J., Lee, M. S. Dried blood spots sample collection, storage, and transportation. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 21-31 (2014).
  17. Ross, R. S., et al. Detection of infections with hepatitis B virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus by analyses of dried blood spots. Performance characteristics of the ARCHITECT system and two commercial assays for nucleic acid amplification. Virol J. 10 (72), (2013).
  18. Zimmermann, R. DRUCK-Studie – Drogen und chronische Infektionskrankheiten in Deutschland. Ergebnisse der Pilotierung eines Sero- und Verhaltenssurveys bei i. v. Drogengebrauchern. Epidemiol Bull. 33, Available from: http://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Archiv/2012/Ausgaben/33_12.pdf?__blob=publicationFile 335-339 (2012).
  19. World Medical Association, Declaration of Helsinki. Ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  20. Young, D. S., Bermes, E. W., et al. Specimen collection and processing; sources of biological variation. Tietz textbook of clinical chemistry. Burtis, C. A., Ashwood, E. R. 58, 2nd edition, W. B. Saunders Company. Philadelphia. 58-101 (1994).
  21. H3-A6. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available from: http://shop.clsi.org/site/Sample_pdf/H3A6_sample.pdf (2007).
  22. H04-A6. Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available from: http://shop.clsi.org/site/Sample_pdf/H04-A6.pdf (2008).
  23. McDade, T. W. Development and validation of assay protocols for use with dried blood spot samples. Am J Hum Biol. 26 (1), 1-9 (2014).
  24. Judd, A., et al. Evaluation of a modified commercial assay in detecting antibody to hepatitis C virus in oral fluids and dried blood spots. J Med Virol. 71 (1), 49-55 (2003).
  25. Zweig, M. H., Campbell, G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin Chem. 39 (4), 561-577 (1993).
  26. Greiner, M., Pfeiffer, D., Smith, R. D. Principles and practical application of the receiver-operating characteristic analysis for diagnostic tests. Prev Vet Med. 45 (1-2), 23-24 (2000).
  27. Clopper, C. J., Pearson, E. S. The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of the binominal. Biometrika. 26 (4), Available from: http://www.bios.unc.edu/~mhudgens/bios/662/2007fall/clopper.pdf 404-413 (1934).
  28. Mei, J. V., Zobel, S. D., Hall, E. M., De Jesús, V. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Performance properties of filter paper devices for whole blood collection. Bioanalysis. 2 (8), 1403-1410 (2010).
  29. Masciotra, S., et al. Evaluation of blood collection filter papers for HIV-1 DNA PCR. J Clin Virol. 55 (2), 101-106 (2012).
  30. Li, F., Zulkoski, J., Fast, D., Michael, S. Perforated dried blood spots: a novel format for accurate microsampling. Bioanalysis. 3 (20), 2321-2333 (2011).
  31. Li, Y., Henion, J., Abbott, R., Wang, P. The use of a membrane filtration device to form dried plasma spots for the quantitative determination of guanfacine in whole blood. Rapid Commun Mass Spectrom. 26 (10), 1208-1212 (2012).
  32. Basavaraju, S. V., Pitman, J. P. Dried blood spots for use in HIV-related epidemiological studies in resource-limited settings. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 76-94 (2014).
  33. Chace, D. H., Spitzer, A. R., De Jesus, V. R. Applications of dried blood spots in newborn and metabolic screening. Dried blood spots for use in HIV-related epidemiological studies in resource-limited settings. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 53-75 (2014).
  34. Gakhar, H., Holodniy, M. Use of dried blood spot samples in HCV-, HBV-, and influenza-related epidemiological studies. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 95-113 (2014).
  35. Villa, E., Cartolari, R., Bellentani, S., Rivasi, P., Casolo, G., Manenti, F. Hepatitis B virus markers on dried blood spots. A new tool for epidemiological research. J Clin Pathol. 34 (7), 809-812 (1981).
  36. Villar, L. M., de Oliveira, J. C., Cruz, H. M., Yoshida, C. F. T., Lampe, E., Lewis-Ximenez, L. L. Assessment of dried blood spot samples as a simple method for detection of hepatitis B virus markers. J Med Virol. 83 (9), 1529-1510 (2011).
  37. Lira, R., et al. Use of dried blood samples for monitoring hepatitis B virus infection. Virol J. 6 (1), 153 (2009).
  38. Jardi, R., et al. Usefulness of dried blood samples for quantification and molecular characterization of HBV-DNA. Hepatology. 40 (1), 133-139 (2004).
  39. Marques, B. L., et al. Dried blood spot samples: optimization of commercial EIAs for hepatitis C antibody detection and stability under different storage conditions. J Med Virol. 84 (10), 1600-1607 (2012).
  40. Larrat, S., et al. Performance of an antigen–antibody combined assay for hepatitis C virus testing without venipuncture. J Clin Virol. 55 (3), 220-225 (2012).
  41. Brandao, C. P., et al. Simultaneous detection of hepatitis C virus antigen and antibodies in dried blood spots. J Clin Virol. 57 (2), 98-102 (2013).
  42. Bennett, S., et al. Detection of hepatitis C virus RNA in dried blood spots. J Clin Virol. 54 (2), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22418454 106-109 (2012).
  43. Abe, K., Konomi, N. Hepatitis C virus RNA in dried serum spotted onto filter paper is stable at room temperature. J Clin Microbiol. 36 (10), 3070-3072 (1998).
  44. Croom, H. A., et al. Commercial enzyme immunoassay adapted for the detection of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spots. J Clin Virol. 36 (1), 68-71 (2006).
  45. Mendy, M., et al. Hepatitis B surface antigenaemia and alpha-foetoprotein detection from dried blood spots: applications to field-based studies and to clinical care in hepatitis B virus endemic areas. J Viral Hepat. 12 (6), 642-647 (2005).
  46. Komas, N. P., Baï-Sepou, S., Manirakiza, A., Léal, J., Béré, A., Le Faou, A. The prevalence of hepatitis B virus markers in a cohort of students in Bangui, Central African Republic. BMC Infect Dis. 10, 226 (2010).
  47. Parker, S. P., Cubitt, W. D., Ades, A. E. A method for the detection and confirmation of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spots. J Virol Methods. 68 (2), 199-205 (1997).
  48. McCarron, B., et al. Hepatitis C antibody detection in dried blood spots. J Viral Hepat. 6 (6), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10607263 453-456 (1999).
  49. Tuaillon, E., et al. Dried blood spot for hepatitis C virus serology and molecular testing. Hepatolog. 51 (3), 752-758 (2010).
  50. Solomon, S. S., et al. Dried blood spots (DBS): a valuable tool for HIV surveillance in developing/tropical countries. Int J STD AIDS. 13 (1), 25-28 (2002).
  51. Lakshmi, V., Sudha, T., Bhanurekha, M., Dandona, L. Evaluation of the Murex HIV Ag/Ab Combination assay when used with dried blood spots. Clin Microbiol Infect. 13 (11), 1136-1110 (2007).
  52. Sarge-Njie, R., et al. Evaluation of the dried blood spot filter paper technology and five testing strategies of HIV-1 and HIV-2 infections in West Africa. Scand J Infect Dis. 38 (11-12), 1050-1056 (2006).
  53. de Castro, A. C., Borges, L. G. dosA., de Souza, R. daS., Grudzinski, M., D’Azevedo, P. A. Evaluation of the human immunodeficiency virus type 1 and 2 antibodies detection in dried whole blood spots (DBS) samples. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 50 (3), 151-156 (2006).
  54. Fan, L., Wan, K., Kavetskaia, O., Wu, H. Automation in dried blood spot sample collection, processing, and analysis for quantitative bioanalysis in pharmaceutical industry. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 229-234 (2014).

Tags

Молекулярная биология выпуск 97 сушеные крови пятна фильтровальная бумага карты хранение образцов инфекционные заболевания вирус гепатита в вирус гепатита С вирус иммунодефицита человека
Засохшей крови пятна - подготовка и обработки для использования в Immunoassays и молекулярных методов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grüner, N., Stambouli, O.,… More

Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques. J. Vis. Exp. (97), e52619, doi:10.3791/52619 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter