Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות

Published: March 13, 2015 doi: 10.3791/52619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Virology, National Reference Centre for Hepatitis C, Essen University Hospital, University of Duisburg-Essen

Summary

הכנת ועיבוד של כתמי דם מיובשים (DBS) לניתוח הסופי שלהם מתוקננים עדיין גרוע עבור מרבית היישומים אבחון. כדי להתגבר על זה חסרון, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף הציע, לאחר מכן הערכה לגבי יעילותו לזיהוי סמנים של זיהומים וירליים.

Abstract

הרעיון של איסוף דם על כרטיס נייר ולאחר מכן באמצעות נקודות דם יבש (DBS) למטרות אבחון מקורו לפני מאה שנה. מאז, DBS בדיקות במשך עשרות שנים התאפיין בעיקר ממוקדת על האבחון של מחלות זיהומיות במיוחד בהגדרות משאב מוגבל או שיטתית ההקרנה של ילודים עבור הפרעות מטבוליות תורשתיות ורק לאחרונה יש מגוון רחב של חדשים וחדשניים DBS יישומים החלה להסתמן. במשך שנים רבות, משתנים מראש אנליטי נחשבו רק באופן בלתי הולם בתחום של בדיקות DBS, אפילו היום, למעט היילוד הקרנה, שלב טרום אנליטי כולו, אשר כוללת ההכנה ועיבוד של DBS עבור שלהם ניתוח סופי אינה אחידה. לאור רקע זה, פרוטוקול צעד אחר צעד מקיף, אשר מכסה al השלבים החיוניים, הוא הציע, קרי, אוסף של דם; הכנת כתמי דם; ייבוש של כתמי דם; אחסון והובלה של DBS; • תנאי של DBS, ולבסוף ניתוח של DBS eluates. היעילות של פרוטוקול זה הוערך קודם עם זוגות 1,762 בשילוב סרום/DBS לזיהוי סמנים של וירוס הפטיטיס B, הפטיטיס C וירוס זיהומים וירוס הכשל החיסוני האנושי על פלטפורמת אנליטי אוטומטית. בשלב השני, הפרוטוקול היה מנוצל במהלך מחקר פיילוט, אשר נערך על המשתמשים פעילים בערים הגרמנית ברלין, אסן.

Introduction

הרעיון של שימוש בדם הנאסף על כרטיס נייר המיוצר מצלולוזה המיוחס איוור הנוצרית באנג (1869 – 1918), אביו של microanalysis קליניים מודרניים1, 2. בשנת 1913, באנג נקבע גלוקוז מן eluates של דם יבש כתמים (DBS)3 , ולאחר מכן גם לבצע מדידות חנקן בשיטת סטריליזציה עם טכניקה זו נייר סינון2. כתוצאה מכך, מספר חוקרים דיווחו על שימוש DBS בדיקה סרולוגית לאבחון עגבת2. כפי מוקדם כמו 1924, צ'פמן לסכם את היתרונות של בדיקות DBS כאשר הוא במיוחד הדגיש ארבעה פריטים, אשר עדיין תקפות היום: (1) venipuncture בהשוואה לקונבנציונלי, פחות נפח הדם נדרש, עובדה זו היה חשוב ביותר ברפואת ילדים אבחון; (2) איסוף דם הוא פשוט, שאינו פולשני, וזולה; (3) את הסיכון של זיהום חיידקי או המוליזה הוא מינימלי; DBS (4) יכול להישמר במשך תקופות ארוכות עם כמעט ללא התדרדרות של analytes2, 4. מלבד השימוש בו בדיקות לסיפיליס, יישומים מוקדם נוסף של הטכניקה DBS כלול, למשל, זיהוי נוגדנים נגד חצבת, חזרת, poliovirus, parainfluenza וירוס, וירוס נשימתי syncytial (RSV) 19532, זיהוי שיגלה בצואה יבש על גבי נייר סינון ונשלח בדואר רגיל מאינדונזיה ליידן בהולנד, כמו גם את הזיהוי של נוגדנים עלקת הבילהרציה ב DBS שצולמו באזורים אנדמיים וניתח יותר משלושה חודשים מאוחר יותר5 . בשנת 1963, כחמישים שנה לאחר באנג של המקורי תקשורת2, 6, גאת'רי סוף סוף לאור השיטה המפורסמת שלו לאבחון של פנילקטונוריה מ- DBS מתקבל על ידי שמוק העקב ילודים7, 8.

אמנם מאותו זמן ואילך, DBS נחשבו כמו שיטה ישימה כלל איסוף, אחסון, שינוע, וניתוח מגוון של נוזלי הגוף האנושי5, השימוש בתוכנית האבחון עדיין נותרה התמקדו בעיקר האבחנה של דלקות במיוחד הגדרות משאב מוגבל של ההקרנה שיטתית של ילודים עבור הפרעות מטבוליות תורשתיות במשך עשרות שנים9, 10. מאז 2005, עם זאת, מגוון יישומים DBS חדשים וחדשניים החלו להסתמן. כתוצאה מכך גידול מעריכי כמעט מספר בהתאמה פרסומים מדעיים-DBS מ כ-50 450-כמעט מדי שנה בזמן הנוכחי. בין היישומים המתעוררים הם בתחומים מגוונים כגון: toxico - ו לימודי פרמוקוקינטיים, פרופיל מטבולי, סמים טיפולית ניטור, טוקסיקולוגיה משפטית או זיהום סביבתי שליטה10, 11.

DBS בדיקות, ובכך, הפך מצעד הניצחון דרך לאבחון קליני מעבדתי במהלך 100 שנים2. כמו כימיה קלינית, רפואית12, עם זאת, במהלך חודש מרץ הזה משתנים מראש אנליטית לא שלמאחה נחשבו במשך שנים רבות. אכן, אפילו היום, לאחר פעילויות כגון הנודע של ה-CDC נייר סינון הערכת פרויקט13 או ניסוח ברמה הלאומית לאיסוף דם על נייר סינון במסגרת של היילוד הקרנת14, שלב טרום אנליטית הוא עדיין במידה רבה שאינטליגנציה רוב השדות האחרים, בהם בדיקות DBS הוא יישומית5, 10.

לאור רקע זה, פרוטוקולים מקיפה שלב אחר שלב14-16 עבור שימוש ב- immunoassays וב -טכניקות מולקולריות, אשר מכסה את כל השלבים החיוניים, הוא הציע הכנה ועיבוד DBS בתקשורת הבאות: (1) אוסף של דם; (2) הכנת כתמי דם; (3) ייבוש של כתמי דם; (4) אחסון והובלה (5) • תנאי של DBS; סוף סוף (6) ניתוחים של DBS eluates. היעילות של הפרוטוקול הוערך קודם עם זוגות 1,762 בשילוב סרום/DBS לזיהוי צהבת B וירוס (HBV) האנטיגנים (HBsAg), נוגדנים ל- HBV core אנטיגן (anti-HBc) נוגדנים אנטיגן פני השטח HBV (anti-HBs), HBV DNA, נוגדנים לנגיף הפטיטיס C (בזכות) (בזכות), בזכות RNA, וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) 1-p24-אנטיגן/אנטי-HIV 1/2 באמצעות פלטפורמה אוטומטית לחלוטין או חומצת גרעין איכותי רגיש בדיקות. 17. בשלב השני, הפרוטוקול היה מנוצל מחקר פיילוט "סמים, כרונית המחלות הזיהומיות" ("מחקר דרוק") אשר נערך על ידי רוברט קוך-המכון בשיתוף פעולה הדוק עם המרכז הארצי בהפניה הפטיטיס c על פעיל משתמשי סמים בערים גרמניות של ברלין, אסן18.

Protocol

מאז הפרוטוקול מיועד לשימוש בתוכנית האבחון הרפואי, היישום שלה לציית לעקרונות הצהרת הלסינקי19. את החלק הראשון של התוצאות שהוצגו תקשורת זו, הן הסכם נפרד על ידי המטופלים והן אישור על-ידי ועדת האתיקה שנראה שניתן לוויתור משתי סיבות: (1) "עם הקבלה" לבית חולים אוניברסיטת אסן, "כל מטופל מספק הסכמה בכתב כל צורך לחקירות הביוכימי בקטריולוגית, virological." 17 (2) "כל דוגמאות בשימוש בכל רחבי הערכת DBS בדיקות נשלחו המכון של וירולוגיה בתהליך אבחון קליני שגרתי. לפיכך, אף אחת מהדוגמאות נאסף במיוחד לצורך המחקר, venipuncture נוספים לא בוצעה, אף אחד מהחומרים נבדקה עבור כל פרמטר מאלה הנדרש על-ידי הרופאים במהלך רגיל אבחון עבודה-up". 17 המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות" (דרוק ללמוד")18, בו DBS בדיקות סוף סוף שימש את הערים הגרמניות של ברלין, אסן להעריך אנשים אשר פעיל להזריק סמים, אושרה על ידי הנציב הפדראלי עבור נתונים הגנה וחופש המידע (ברלין, גרמניה), כמו גם על ידי ועדת האתיקה של צ'אריטה באוניברסיטה הרפואית, (ברלין, גרמניה).

1. אוסף של דם

  1. Venipuncture14, 15, 20, 21
    1. ללבוש כפפות גומי לטקס חד פעמיות, ולנקות את האזור המיועד החדירה (רצוי את החציון cubital הווריד ב הפוסות antecubital) חומר חיטוי מתאים, למשל, אלכוהול איזופרופיל 70%.
    2. החל עורקים 4-6 ס מ מעל החדירה בשם כדי distend הורידים. להנחות את המחט לתוך הווריד החולה ולמלא, ברגע זה במקום, בעדינות את הצינור מחובר דם, המכילה EDTA בתור נוגדת קרישה.
    3. ברגע venipuncture תושלם, לשחרר את חוסם העורקים ולסגת את המחט. לאחר מכן, הקש כרית יבשה גאזה על החדירה, אשר לאחר מכן ניתן לקיים במקום על ידי תחבושת.
  2. ניקוב עור (איור 1 א')13-15, 20, 22, 23
    1. לשים על זוג כפפות גומי לטקס חד פעמיות.
    2. לפני ניקוב עור, המטופל צריך לחמם את הידיים שלו. האצבע הוא המטופל anterogradely enrich לדם לזרום לכיוון ניקוב באתר.
    3. לנקות את העור של הצד פאלמאר של פלנקס דיסטלי הקצה של האצבע השלישית או הרביעית של היד סטן עם חומר חיטוי מתאים, למשל, אלכוהול איזופרופיל 70%. לנקב את העור על ידי מנתחים בטיחות לשימוש יחיד. האצבע יוחזקו במצב כזה כי כוח המשיכה מקלה על האוסף של דם על קצה האצבע.
    4. השלמת אוסף של נימי דם על ידי ניקוב עור, להניח תחבושת על קצה האצבע.

2. הכנת כתמי דם

  1. הכנה של הדם הנאסף על-ידי venipuncture15
    1. במקום (EDTA) שנאספו התקרש נגד דם ורידי לגמרי על הקלפים מסנן בהקדם האפשרי. לא להכין כתמי דם יבשים יותר מ- 24 שעות לאחר venipuncture.
    2. את כל המידע הדרוש לצורך הזיהוי של המטופל על הכרטיס מסנן. כרטיס אחד צריך הבחין רק עם הדם של אדם יחיד.
    3. . תלבש כפפות חד פעמיות גומי לייטקס
    4. היפוך בעדינות את הצינור אוסף דם 2 – 4 פעמים, לאחר מכן לפתוח את הפקק בזהירות.
    5. האחות µl 50 של דם ורידי שלם באמצעות פיפטה עם טיפ חד פעמיות. להעביר את הדם במרכז מעגל אחד בלי לגעת נייר הסינון ישירות עם קצה פיפטה. מנסה באופן מלא להרוות את המעגל.
    6. חזור על הליך זה כדי למלא את כל הנדרש עיגולים של הכרטיס.
  2. הכנה של הדם הנאסף על ידי העור לנקב (דמויות 1B ו- 1 C)13-16, 23
    1. תנגב את טיפת הדם עם כרית גזה הראשון כי זה עשוי להכיל רקמת עודף נוזלים. עיסוי את האצבע שוב כדי להגביר את זרימת הדם החדירה. העברת הטיפה הבאה לאחד החוגים של כרטיס מסנן מבלי לגעת במשטח ישירות עם קצה האצבע. לאפשר לדם להיות שנספג לתוך המרקם של המסנן על-ידי כוחות נימי בלבד.
    2. תן משלוח גדול הבאה של נימי דם טופס בקצה האצבע ולאסוף אותו במעגל הבא. המשך הליך זה עד כל החוגים הדרושים מלאים או מפסיקה זרימת הדם.
    3. אל תלחץ או "לחלוב" את האצבע יתר על המידה אם זרימת הדם אינה מספיקה כדי למלא את כל העיגולים הנדרש של הכרטיס מסנן. אם זרימת הדם נפסק להניח תחבושת על קצה האצבע. לבצע ניקוב העור השני על אצבע נוספת אם עוד דם יש צורך בבדיקה.

3. ייבוש של כתמי דם

  1. כדי לייבש את כתמי דם, לשים את המסנן כרטיסים על נייר נקי המגבת בארון הבטיחות הביולוגי ולתת להם יבשה, רצוי O/N (אבל לפחות 4 שעות), ב- RT, בהעדר כל מקור חיצוני של חום. כאשר תהליך הייבוש, כתמי דם יש צבע חום כהה אחיד אין אזורים אדומים גלויים יותר (איור 1D)13, 15, 16.

4. אחסון והובלה של כתמי דם מיובשים (DBS)

הערה: עיבוד של הדם יכול להיות מופרע לאחר הייבוש. הקלפים מסנן עכשיו יכול להיות מאוחסנת13-16, 23.

  1. לאחסון, לשים את כרטיס נייר סינון בשקית רוכסן גז-אטום בודד, המכיל 1-2 שקיות סופג לחות כדי להגן על דגימות מפני לחות (איור 1E). לחלופין, הוסף כרטיס אינדיקטור לחות.
  2. להעביר את התיק הזה מקפיא עם טמפרטורת-20 ° C או נמוך ככל האפשר. אם מקפיאים אינם זמינים תחת תנאי המגרש, אחסון ב-4 ° C או אפילו בטמפרטורת החדר הוא ריאלי עד 14 ימים.
  3. תחבורה דגימות DBS קפוא בקרח יבש. עבור כרטיסי מסנן בתחילה לשמור בטמפרטורת החדר, השתמש מערכת אריזה משולשת, אשר מורכב של רוכסן bag(s) את container(s) הפנימית, וכן הפנימית של מעטפה החיצוני. ללא סימונים תוכן נדרש על המעטפה החיצונית למשלוח בדואר רגיל, אבל חייב להיות מוצמדת הסמל הבינלאומי הביולוגי המיכל הפנימי הראשי16.
  4. אל תכלול את הקלפים מסנן עיבוד נוסף אם את ערכות סופג לחות ו/או את הכרטיס אינדיקטור לחות נוספים משתנה צבע ורוד.

5. • תנאי של דם יבש יבחין13, 15, 16, 23

  1. אגרוף החוצה במקום אחד עם התקן לשימוש יחיד 6 מ מ מ כל מעגל צמאת דם של הכרטיס מסנן 903 כיתה (איור 1F). העברת כל אגרוף כתמי דם מיובשים מחולה בודד כדי באר אחת של צלחת 12-. טוב.
  2. למלא את הבאר עם תמיסת מלח באגירה פוספט המכילה 0.05% Tween 20 ו- 0.08% אזיד הנתרן (איור 1 ג'י). להתאים את עוצמת הקול של מאגר נוסף לדרישות המתאימות מינימלי של וזמינותו משמש לאחר מכן ניתוח של eluates נקודות דם יבש.
  3. חזור על שלבים אלה כדי לקבל סדרה שניה של eluates ספוט דם יבש על מנת לבצע ניתוח מולקולרית.
  4. לשים את הצלחת תרבות תא מטרף מעבדה ולתת את כתמי דם מיובשים מנוקב בעדינות elute לקבוצות של 4 שעה או, עדיף, O/N (איור 1 H).
  5. למחרת, המקומות הם כמעט ללא דם, supernatants היילוד יצרו (איור 1I). להעביר את eluates האלה microcentrifuge צינורות. לאחר מכן, מעמיד אותם בפני צנטריפוגה למשך 2 דקות ב g 10,500 x (איור 1J) כדי לשחרר את supernatants מפני כל פסולת שנפער במהלך • תנאי (איור 1 K).

6. ניתוח של Eluates

  1. Centrifuged eluates מוכנים כעת לשמש עבור הניתוחים המיועד. לחקור את eluates עבור סמנים של וירוס הפטיטיס B, הפטיטיס C וירוס הידבקות ב- HIV באמצעות ערכות זמינים מסחרית ובצע את ההוראות היצרנים המתאימים היטב (איור 1 L).

Figure 1
איור 1. סיכום גרפי של הפרוטוקול המוצע תקשורת זו הכנה ועיבוד של כתמי דם מיובשים לשמש immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות. דם כל ורידים, נימי דם מתקבל על-ידי venipuncture או ניקוב של העור על ידי מנתחים (א) עשויה לשמש דגימות לבדיקה ספוט דם יבש. לאחר העברת הדם החוגים של כרטיס מסנן 903 כיתה (B, C), הדגימות צריך להיות מיובש רצוי O/N בטמפרטורת הסביבה בבטיחות הביולוגי בארון כדי טופס כתמים של צבע חום אחיד ללא כל interspersion של אדום אזורים (D). בעת הייבוש של הדם מציע, אחסון הצורך, הקלפים מסנן יכול להיות ארוז בתוך שקיות רוכסן גז-אטום המכיל 1-2 שקיות סופג לחות (E). עיבוד מעבדה נוספות DBS מהווים את הדור של אגרופים על ידי מכשיר אחד 6 מ מ מן המרכז של העיגולים (F, G), • תנאי של העקיצות ב מאגר מבוסס-PBS לקבוצות של 4 שעה או, עדיף, O/N במטרף (H ), ההתאוששות של eluates (אני), ולבסוף צנטריפוגה גביעים מעבדה (J) כדי לשחרר את eluates DBS מפני כל פסולת שמקורה עלול במהלך התהליך • תנאי (K). לאחר מכן, eluates DBS מוכנים עבור ניתוחים, אשר נערכו על ידי פלטפורמה אוטומטית לחלוטין (L) על מנת לזהות סמנים סרולוגית של HBV, בזכות ו- HIV זיהומים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Representative Results

היעילות של הפרוטוקול הציע הכנה, עיבוד של DBS הוערך לראשונה על-ידי ניתוח 1,762 בשילוב סרום/DBS זוגות עבור סמני דלקת HBV, בזכות ו- HIV. 17. למטרה זו, DBS הוכנו מ 100 µl דם מהוורידים לגמרי (cf. נקודות 2.1.1 – 2.1.6 בפרוטוקול הקודם), היו eluted עם 1,000 µl של PBS מבוססי מאגר, כל אחד, (cf. נקודות 5.1 – 5.5 לפרוטוקול הנ ל) כדי להשלים את התהליך עבור כל הפרמטרים שבע שתי פעולות נפרדות. גישה כזו בלי אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד נראה בלתי נמנע כי תפוקה גבוהה למדי מדגם היה צפוי תוך זמן קצר יחסית במהלך המחקר השדה הקרובה "סמים, כרונית מחלות זיהומיות"("מחקר דרוק").

כל המדידות דבקה המלצות היצרן במהלך ניתוח DBS, אבל היה צריך להיות שונה ביחס האישושים HBsAg ו- anti-HBs לפצות גם את ההשפעה של המוליזה או התוצאה של דילול. עם ערך ניתוק של 0.05 IU/ml, HBsAg בדיקה של eluates DBS להוביל בשיעור של false-תוצאות חיוביות של 14.7% (52 מתוך 354) בהשוואה ל הסרום דגימות (איור 2 א). מקלט ההפעלה אופיינית (ROC) ניתוח25, 26 של הנתונים ציינו כי גידול של הסף כדי 0.15 IU/ml כתוצאה פרידה אידיאלי של תוצאות חיוביות-HBsAg HBsAg שלילי (פרטית 0.986 [רגישות], 0.000 [1-ירידה לפרטים], איור 2B). מצד שני, עם ניתוק של 10 IU/l על כימות של anti-HBs נוגדנים שיעור של מדידות שווא-שלילי של 14.2% (47 מתוך 331) היה מוקלט (איור 2C). לפיכך, בעקבות ניתוח ROC שוב, זה ניתוק הונמך אל 1.5 IU/l כדי להשיג על אפליה אופטימלית של ערכים (0.917 [רגישות], 0.007 [1-ירידה לפרטים], איור דו-ממדי).

Figure 2
איור 2- HBsAg ו anti-HBs בדיקות eluates DBS (שונה מ-17). העלייה מונחה ROC של הערך ניתוק על כימות HBsAg מ 0.05 IU/ml (א) כדי 0.15 IU/ml (ב) מופחת הקצב של תוצאות חיוביות שגויות של 14.7% ל- 0%. באופן דומה, ROC ניתוח של anti-HBs ריכוזים הציע ירידה של סף בהתאמה מ 10 IU/l (C) ל 1.5 IU/l (D), ובכך לחלוטין סילוק חסימות יתר, אשר היוו בתחילה 14.2% האישושים כל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. 

התוצאות של הבדיקות בשילוב סרום/DBS מסוכמים בטבלה 117. אין ללא ירידה לפרטים הוקלט במהלך DBS בדיקה עבור כל אחד analytes 7.

כאשר DBS eluates נחקרו לנוכחות של HBsAg, א א הפרמטר מפתח סרולוגית לזיהום אקוטי וכרוני עם HBV, רגישות אנליטית של 98.6% נקבע. HBsAg ריכוזים ב sera שקרית-שלילי שני היו 749 IU/ml ו 6 IU/ml, בהתאמה. נוגדנים anti-HBc אותרו בהצלחה 176 מתוך 204 (א e 86.3%) DBS eluates. . עשרים ושתיים מתוך 28 דגימות אשר לא אותרו על ידי המדידות שמקורם יחידים שיתוף נגועים בנגיף ה-HIV לפיכך, אם אנשים HIV חיובי לא נכללו בחישוב, רגישות של 97.1% הושג לאחזור נוגדנים anti-HBc מדם ורידי לגמרי יבש eluted. דומות תצפיות שנערך לגבי הקביעה של נוגדנים anti-HBs. אפילו לאחר השינוי של הערך ניתוק של וזמינותו כדי 1.5 IU/l, 9 תוצאות DBS סרום discrepant אירעה. החולים לא שותף נגוע ב- HIV, נמצאו ריכוזים anti-HBs סרום של 11-26 IU/l אשר היו נמוך מדי כדי לאפשר זיהוי לאחר • תנאי של הדם היבש.

בזכות נוגדנים מעידים על או זיהום אקוטי או כרוני או נפתרה. רק ארבע תוצאות בזכות התחזות-שלילי (א א 2.2%) נקבעו מ- DBS eluates והפגינו עוד ניתוחים סרולוגית ומולקולרית בבירור sera המתאימים מאוד בטח צולמו מחולים, זיהומים אשר היה מזמן נפתר.

זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates עם מערכת אוטומטית לחלוטין היה תהליך חלקים לחלוטין אשר הניב של רגישות אנליטית של 100%.

"רשע HBV DNA ריכוז של דם מלא eluates בוצעה 100 דגימות (כלומר DNA ריכוז: 1,573,898 IU/ml, טווח: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) ונכנעתי ערך של 93.0%. לפיכך, שבע דגימות עם סרום נמוך ריכוזים HBV DNA בין 409 3,643 IU/ml לא זוהו ע DBS בדיקות. של sera 100 אשר הוכיחה להיות בזכות RNA חיוביות (כלומר RNA בזכות ריכוז: 1,415,944 IU/ml, טווח: 2,479 - > 7,692,000 IU/ml), המקביל aliquots דם היו זמינות. החקירה השוואתי כתוצאה רגישות אנליטית של 100% עבור בזכות RNA האישושים מ- DBS eluates." 17

כדי לבדוק פרוטוקול מחולקת לרמות עבור הכנת ועיבוד DBS בתנאי שדה, היא שימשה בשיתוף פעולה הדוק עם רוברט קוך-המכון (ברלין, גרמניה) במהלך שלב פיילוט של המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות", אשר היה ניצח על המשתמשים פעילים בערים גרמניות של ברלין, אסן18. כל 534 המשתתפים נרשם (433 גברים ונשים 101) עברה נימי דם הדגימה כמתואר בפירוט בסעיפים 2.2.1 – 2.2.3 של פרוטוקול הקודמים, ו DBS היו, eluted שוב, על ידי תוספת של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS.

שני אנשים אובחנו באופן כרוני נגוע HBV, 39 הראה את התבנית סרולוגית לזיהום HBV נפתרה. יתר על כן, משתתפים 15 היו חיוביים עבור anti-HBs (מעמד לאחר החיסון), שמונה נמצאו חיוביים עבור anti-HBc לבד. בזכות השכיחות בין המשתתפים היה 57.3% (N = 193) בברלין וב 73.0% (N = 144) ב Essen. מ. יבויחה הנוגדן דגימות 65% (N = 125), 62% (N = 89) היו גם viremic. עשרים וחמש אנשים 534 חיובית ל- HIV אנטי. 19 של דלקות כבר היו ידועות, 24 אנשים אלה היו שיתוף נגועים בזכות.

התוצאות המתקבלות על-ידי בדיקת DBS הושוו בזהירות עם נתונים anamnestic של המשתתפים במחקר לגבי המצב HBV ו בזכות דיווח עצמי. השוואה זו בשילוב עם תוצאות בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות הוביל שינויים מזעריים של אלגוריתם הבדיקה עבור השלב העיקרי של "דרוק המחקר", אשר יכולים? להכליל את משתמשי סמים פעילים שש ערים גרמניות גדולות נוספות: "יחידים נגוע ב- HIV ייבדק תמיד נוכחות של HBV DNA. המשתתפים אשר eluates DBS הן חיוביות anti-HBc או anti-HBs צריך יהיה נתון venipuncture בפגישת ייעוץ השני להבהרת בהחלט מצב anti-HBc/anti-HBs שלהם, בסופו של דבר, כל eluates DBS יוקרן עבור בזכות RNA משנה התוצאות של בדיקות בזכות". 17

פרמטרים סרה בשילוב/DBS eluates (N) תוצאות discrepant (N) סיבת אי-ההתאמות בין בדיקת סרום ו DBS eluates
HBV
HBsAg 299 2 שני חולים עם דלקת כרונית של HBV. שניהם היו תחת טיפול אנטי-ויראלי, אחד מהם היה שיתוף נגועים ב- HIV. ריכוזי HBsAg בסרום: 749 IU/ml ו- 6 IU/ml, בהתאמה.
Anti-HBc 305 28 בנסיוב, עשרים ושתיים חולים היה זיהום HBV נפתרה. שישה הוכיחו את מציאת סרולוגית "anti-HBc לבד". עשרים ושתיים של המטופלים היו שיתוף נגועים ב- HIV. מ- "מפענחים HBV," עשרים היו העריך כמו "anti-HBs חיובי לבד' על-ידי בדיקת DBS ו, לכן, באופן כוזב סווגו"מצב לאחר החיסון".
Anti-HBs. 310 9 ארבעת המטופלים לא שותף נגוע ב- HIV היה סרום anti-HBs ריכוזי אלקטרוני 11 26 IU/l, אשר היו נמוך מדי כדי לאפשר זיהוי נוגדנים לאחר • תנאי נקודות דם יבש.
HBV DNA 150 7 שרה בהתאמה היה הושגו מן שבעה חולים עם ריכוזים HBV DNA בסרום נמוכה ועד 409 IU/ml 3,643 IU/ml.
בזכות
בזכות 339 4 אלה ארבעה סרה שנלקח חולים, עם זמן מאז נפתרה בזכות זיהומים.
בזכות ה-RNA 150 0 –
HIV
HIV 1-p24/HIV נגד 1/2 209 0 –

טבלה 1: התוצאות המתקבלות מ- DBS 1,762, אשר היו מוכנים ומעובדים מפני הבאות דם ורידי כל הפרוטוקול המוצע תקשורת זו, לעומת הממצאים בדגימות בשילוב סרום כנקודת התייחסות.

Discussion

DBS שימשו במשך 100 שנים2 , אבל, למרבה ההפתעה, יש עדיין אין הסכמה כללית לגבי הכנה ועיבוד שלהם. עד כה, האחדה מספיקות של שלב טרום אנליטי חשוב זה רק הושגה בתחום של היילוד ההקרנה14, ואילו במגוון של פרוטוקולים שונים קיימת עבור כל היישומים האחרים של DBS בדיקה5, 16, 23. כדי להתגבר על הטרוגניות המדהימה הזו, הוא הוראה צעד אחר צעד מקיפים להכנה של עיבוד DBS כדי להיות מנוצל immunoassays ועל ידי טכניקות מולקולריות שהוצגו בתקשורת זו, ביחס יעילותו זיהוי סמנים של HBV, בזכות דלקות HIV. מוקד הדיון הבא מושם בעיקר על השלבים השונים של הפרוטוקול המוצע.

בהיסטוריה של DBS בדיקות רבות נייר סינון שונות כרטיסי היו בשימוש2 אבל רק היום שני מקורות מסחריים אושרו על ידי ה-FDA כמו class II ומכשור רפואי עבור הדם אוסף5, 16. מערכות אלו כרטיס מסנן מאוד אחידה, יש מאפיינים דומים מאוד הקליטה כך התוצאות האנליטיות המתקבל נימי דם שהוכנו על אף אחד מהם לא שונות על ידי יותר מ- 4% – 5%28. באופן לא מפתיע, Masciotra ועמיתים29 ולכן זוהה RNA HIV-1 מידה עם assay איכותי לאחר • תנאי מן הדם אוסף קלפים ממקורות שונים. לאור נתונים אלה, זה יכול להיות כמעט לא נכלל כי כל אחד הסתירות הקיימות בעת בדיקות בשילוב סרום/DBS זוגות של סמני של HBV, בזכות, HIV זיהומים17 נגרם על ידי הבחירה של הכרטיס מסנן לבד. עם זאת, כאשר כימות מדויק של analyte הכרחי, וריאציית המקור-כדי-מקור עשויים להיות לא זניח וניקב טכניקות מתוחכמות יותר, למשל, DBS (PDBS) כשיטה microsampling30 או הכנה המקומות סרום מיובשים (DSS)31 ייתכן שתחול במקום DBS הקונבנציונלית בדיקות10.

מאז רק כמויות קטנות של דם משמשים DBS בדיקות (טיפה אחת של דם קפילרי מורכב µl כ-50)5, 16, וריאציות באמצעי האחסון מדגם מכריעים ובבית, אמנם, לפחות לחלק בין תוצאות סרולוגית של המשתתף דיווח עצמי HBV ומצב בזכות שנרשם במהלך הטיס "המחקר דרוק" הם לייחס משתנה זה. הגורם החשוב ביותר יחיד עבור מזעור "תנודות" של אמצעי האחסון מדגם הוא ללא ספק טכניקה נכונה של אוסף נימי דם, אשר יכולה להיות מושגת רק על ידי הכשרה זהיר ומתמשכת של הסגל הטכני22. יתרה מזאת, כאמצעי של בקרת איכות, כל המעבדות עובד עם DBS צריך כבר יזמו הנהלים לזיהוי, לאחר מכן למעט דגימות DBS צריך להיחשב חוקיים משביע רצון או16.

מחקרים שנערכו בעיקר בהקשר של HIV32 ו ההקרנה היילוד33 הראו כי לחות גבוהה עלולה להוביל הפירוק של analytes, אבל עד כה אין הסכמה הושגה לגבי שאלת כמה זמן DBS צריך להיות אוויר יבש . מרווח זמן לפחות 4 שעה או רצוי O/N מוצע זה תקשורת, שאימצו לכן את התנאים שבהם נהגו ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית32, 34 נתונים על אחסון של DBS, לאחר מכן ניתן להשתמש עבור HBV ו בזכות בדיקות מתנגשים. בשנת 1981, וילה ועמיתים35, מי שנרשם עכשוויים בשיטות אנליטיות, דיווחו כי אחסון ב- RT לא השפיע על התוצאות של HBV ניתוחים במהלך כל תצפית של 180 ימים אם היו נוגדנים titers > 1/1000, אבל זה DBS הפכה גבולי-חיובית או שלילית אפילו לאחר 15 ימים כאשר titers בנסיוב היו רק 1/100. אחסון-20 ° C או 4 ° C לא לגרום לשיפור משמעותי. לעומת זאת, במחקר שנערך שלושים שנה מאוחר יותר36 נבדק ושכפול של מדגם HBV חיובי, ומצא המחברים את anti-HBc כמו גם נוגדנים anti-HBs היו יציבים עד 183 ימים ב- RT, ואילו HBsAg מתחת לאותם התנאים הפך false-שלילי כבר אחרי 63 ימים. לגבי זיהוי HBV DNA מ- DBS eluates, ריכוז חומצות גרעין נגיפיות הייתה יציבה לפחות שבעה ימים ב- 37 ° C37 או הוכיח להיות "עמיד" אחסון ב- RT עד שלושה שבועות38. בדיקת נוגדנים בזכות באמצעות שני דור שלישי זמינים מסחרית immunoassays39 סיפק תוצאות מדויקות עבור תקופה של 117 ימים באמצעות דגימות DBS המאוחסנים ב-20 ° C, 2-8 ° C ו- 20 – 25 ° C, בהתאמה. אחסון ב-20 ° C, עם זאת, הביא הווריאציה הנמוך של צפיפות אופטית. החלת אנטי-בזכות של הדור הרביעי, אליסה, קרי, Monolisa בזכות-Ag-Ab-ULTRA, בהקשר של DBS בדיקות, Larrat. et al. 40 נצפתה ירידה חדה בירידה לפרטים אנליטי לאחר אחסון דגימות DBS במשך יותר משלושה ימים-RT. מצד שני, התקבלו תוצאות בדיקה מדויקת עם ערכת אותו ניצול דגימות שהופקדו למשך 60 ימים בתנאים שונים (-20 ° C, 2-8 ° C ו- 22 – 26 ° C) על ידי Brandao ועמיתים41. תצפיות על הירידה של RNA בזכות ריכוזים ב DBS בתנאים אחסון שונים בטווח של אין שינוי משמעותי ב RT עבור שנה אחת עד42 עד שינוי tenfold לאחר ארבעה שבועות-טמפרטורת הסביבה43. לוקחים את הנתונים הסותרים מעדיף על היציבות של HBV ו אנטיגנים בזכות, חומצות גרעין, נוגדנים בחשבון, נראה סביר לסגת בפרוטוקול המוצע להחלטה, אשר הוגדרה קודם לכן עבור האחסון של דגימות DBS שישמש עבור HIV בדיקות15, 30: עבור התצהיר לטווח קצר (עד שבועיים) אנטיגנים, חומצת גרעין נגיפיות, נוגדנים הם נחשבים יציבה-RT, ואילו האופטימלי אחסון לתקופות ארוכות על התנאים קפוא.

ככלל, שלושה פרמטרים שיש לשקול בעת תכנון פרוטוקול • תנאי: (1) המאגר • תנאי; (2) משך זמן וטמפרטורה של • תנאי; (3) • תנאי האחסון23. ברוב המכריע של כל הפרסומים רלוונטית באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) שימש eluting DBS, והוסיף הסופרים חלבון, למשל, אלבומין שור (BSA) או Tween 20, חומרים פעילי, שטח-על מנת לשפר את האות assay על-ידי ייצוב חלבונים, כמו שהם הולכים לתוך פתרון, מחייב שאינם ספציפיים בו זמנית חסימת אתרים23. רק כמה דוחות, אשר ישירות להשוות מאגרים שונים • תנאי בהקשר של בדיקות DBS, הינם זמינים. Villar. et al. 36, למשל, נרשם כמעט שוות ערך • תנאי קיבולות למאגרי כל שימוש, אלא PBS/BSA 0.5%, גרמו ברמה הנמוכה ביותר של תגובתיות שאינם ספציפיים. אבחנה דומה מאוד נעשתה על ידי כרום ועמיתים44 בשעת החלת את diluent הדגימה של rLAV גנטיקה מערכות EIA עבור • תנאי של נוגדנים בזכות מ- DBS. מאז הסיכון של מדגם השפלה היא מאוד נמוכה בשעות הראשונות לאחר הכנת DBS (ראה לעיל), הוחלט דגירה המקומות O/N בטמפרטורת החדר, כדי לתמוך בתהליך • תנאי על ידי ערבוב מעל קצה-עדין. גישה זו יש יתרון כי דגימות אגרוף הקודם יום ישירות יועברו שגרתית אבחון מוקדם הבא בבוקר23. צריך להיות מותאם היקף המאגר • תנאי הדרישות המתאימות מינימלי של מבחני המשמש ניתוחים הבאים על מנת לשמור את הגורם לדילול נמוך ככל האפשר. עם זאת, אופטימיזציה זהירה של התנאים • תנאי עבור כל analyte יחיד איננה אפשרית בהערכה הקודמת כי תפוקה גבוהה לדוגמה היה צריך להיות מובטחות תוך זמן קצר יחסית במהלך ה "דרוק לימוד"17. כתוצאה מכך, נפח שלילי למדי של 1,000 µl של מאגר מבוסס-PBS שימש כדי להשלים את התהליך כולו • תנאי עבור כל הפרמטרים של שתי פעולות נפרדות.

גישה זו אחד מצד אחד נכשל "לחלוטין במערכת anti-HBc/anti-HBs עבור אותם אנשים נגועים בנגיף ה-HIV עקב ריכוז נוגדן נמוכה; . זה נדרש הליכים ביולוגית מולקולרית עם רגישות אנליטי אופטימלי ביחס HBV DNA ו RNA בזכות בדיקות. " 17 מצד שני, אמצעי האחסון גבוה • תנאי הוכיחה להיות בשום אופן חסרון מצפני HBsAg בזכות, נגד HIV על ידי ערכות בשימוש בכל רחבי ההערכה. "זיהוי HBsAg חומרים חיוביים של דם מלא eluates הצליח עם רגישות של 98.6% במידה גבוהה באופן דומה כמו מחקרים קודמים, אשר השתמשה באופן חלקי נפח • תנאי קטן בהרבה של 100 µl, 250 µl, או 600 µl או 500 µl"17 ,36, 45, 46. הרגישות של 97.8% נקבע בחקירת זוגות סרום/DBS 179 עבור בזכות נוגדנים תאמו התוצאות שכבר קיימים דוחות24, 44, 47, 48, 49, אשר עבד עם אמצעי אחסון • תנאי זה היה נמוך פי 5 עד 10. "בנוסף, הפרוטוקולים לגילוי בזכות היה כבר כראוי ממוטב. מאת הקובעת נקודות ניתוק משלהם"17, 24, 48, 49 "או על-ידי הגברת אמצעי האחסון מדגם של 20 µl כדי 100 µl" בן 17, 49 . סוף סוף, ירידה לפרטים אנליטי רגישות (100% כל אחת) הוקמה לגילוי HIV אנטי היו שווה או גבוהה ממנו מאפייני ביצועים של אחרים immunoassays המותאמים במיוחד DBS בדיקות50, 51 "או של stepwise נוהל עם השימוש בשילוב של מספר בדיקות האיידס"17,52. "הם, אכן, גם חריגה תיעוד ביצועים assay זה היה מיוחד פותחה, ממוטב עבור זיהוי נוגדנים נגד HIV ב DBS eluates (Q-למנוע HIV 1 + 2 מקיט DBS)." 17, 53  

יחדיו, את הפרוטוקול צעד אחר צעד מקיף שהוצגו בתקשורת זו התבררה כלי ידידותי למשתמש ריאלי הכנה ועיבוד DBS ואת, לכן, ניתן להשתמש בצורה אמינה וירולוגיה אבחון. זה מאפשר גישות באמצעות אוטומציה 54 , בשל מאפייניו ביצועים מצוינים יש פוטנציאל לשמש סוג של אבן-היסוד עבור פרוטוקול בעתיד הסכמה כללית מקובלת בתחום הגלובלי DBS בדיקות מעבדה הרפואה.

Disclosures

בעבר, RSR קיבל מענק כבוד להעברת הרצאות, תמיכה כספית עבור עבודתו המדעית של אבוט אבחון. NG ואום מצהירים שאין להם שום אינטרסים סותרים.

Acknowledgments

תקשורת זו מבוססת על התוצאות שפורסמו קודם לכן וירולוגיה יומן17 במצב גישה פתוחה תחת תנאי Creative Commons רישיון (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) עם אחראית המרכזי בתור ברישיון. המחברים בהכרת תודה לאשר שיתוף פעולה פורה במסגרת של מטיס המחקר "סמים, כרונית מחלות זיהומיות" ("מחקר דרוק") עם מרקוס בארצות הברית, וו קאי, ג'אנג ו ר צימרמן של רוברט קוך-המכון (ברלין, גרמניה), הם אסירי תודה על Moyrer ס' עבור מצלם את התאספו איור 1 גם באשר ד פ Whybrew, ph. d., (גטינגן, גרמניה) לתיקון כתב היד. הם גם לבטא את ההערכה שלהם לקבלת סיוע טכני מיומן כדי ג'יי אקרמן, Bayrambasi א, U. Büttner, Dziubek ס', אני Jakobsche, B. Krellenberg, קרון ה, עמ' Kusimski, א מטקלף, ג'יי Piejek, סער ס', מסיה שרטר, ק' סיידל. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק של משרד הבריאות, הפניה למרכז הלאומי הגרמני עבור הפטיטיס c.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Latex rubber gloves Hartmann #4049500041515
70% isopropyl alcohol Bode Chemie #9768050
Mulifly safety cannula Sarstedt #85.1638
EDTA blood collection tube Sarstedt #02.1066.001
Adhesive bandage Hartmann #2994163
Dry gauze pad Hartmann #143213
Singel-use safety lancet Owen Mumford #3802421
Filter paper card Whatman/sigmaaldrich #10534612 Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips Starlab #S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag Flexico #20219
Mini desiccant bag Tropack #-
Disposable Punch pfmmedical #48601 6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps Servoprax #H7301
12 Well Cell Culture Plate Greiner #665180
PBS Buffer Gibco #14190-136
Tween 20 Applichem #A1389.0500
Sodium Azide Merck #66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf #30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative) Abbott #6C3642
ARCHITECT anti-HBc II Abbott #8L4425
ARCHITECT anti-HBs Abbott #7C1825
ARCHITECT anti-HCV Abbott #6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Abbott #4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit Roche #6374891001
artus HBV LC PCR Kit Qiagen #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD Siemens Healthcare #2554311

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schmidt, V. Ivar Christian Bang (1869 - 1918), founder of modern clinical microchemistry. Clin Chem. 32 (1), 213-215 (1986).
  2. Hannon, W. H., Therell, B. L. Overview of the history and applications of dried blood spot samples. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 3-15 (2014).
  3. Bang, I., Bergmann, J. F. Der Blutzucker. , Wiesbaden. Available from: https://archive.org/details/derblutzucker00bang (1913).
  4. Chapman, O. D. The complement-fixation test for syphilis. Use of patient's whole blood dried on filter paper. Arch Derm Syphilol. 9 (5), Available from: http://archderm.jamanetwork.com/article.aspx?articleid=495323 607-611 (1924).
  5. Smit, P. W., Elliott, I., Peeling, R. W., Mabey, D., Newton, P. N. An overview of the clinical use of filter paper in the diagnosis of tropical diseases. Am J Trop Med Hyg. 90 (2), 195-210 (2014).
  6. Kuehn, B. M. After 50 years, newborn screening continues to yield public health gains. JAMA. 309 (12), 1215-1217 (2013).
  7. Guthrie, R. Blood Screening for Phenylketonuria. JAMA. 178 (8), Available from: http://jama.jamanetwork.com/article.aspx?articleid=332184 863 (1961).
  8. Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
  9. Snijdewind, I. J., van Kampen, J. J., Fraaij, P. L., vander Ende, M. E., Osterhaus, A. D., Gruters, R. A. Current and future applications of dried blood spots in viral disease management. Antiviral Res. 93 (3), 309-321 (2012).
  10. Demirev, P. A. Dried blood spots: analysis and applications. Anal Chem. 85 (2), 779-789 (2013).
  11. Li, W., Lee, M. S. Preface. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. VIII-IX (2014).
  12. Guder, W. G., Narayanan, S., Wisser, H., Zawta, B. Diagnostic Samples: From the Patient to the Laboratory. The Impact of Preanalytical Variables on the Quality of Laboratory Results. , 4th edition, Wiley-VHC. Weinheim. (2009).
  13. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J Nutr. 131 (5), 1632S-1636S (2001).
  14. NBS01-A6. Blood Collection on Filter Paper for Newborn Screening Programs; Approved Standard-Sixth Edition. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available at: http://shop.clsi.org/c.1253739/site/Sample_pdf/NBS01A6_sample.pdf (2013).
  15. WHO manual for HIV drug resistance testing using dried blood spot specimens. , World Health Organisation (WHO). Available at: http://www.who.int/hiv/pub/drugresistance/dried_blood_spots/en/ (2012).
  16. Mei, J., Lee, M. S. Dried blood spots sample collection, storage, and transportation. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 21-31 (2014).
  17. Ross, R. S., et al. Detection of infections with hepatitis B virus, hepatitis C virus, and human immunodeficiency virus by analyses of dried blood spots. Performance characteristics of the ARCHITECT system and two commercial assays for nucleic acid amplification. Virol J. 10 (72), (2013).
  18. Zimmermann, R. DRUCK-Studie – Drogen und chronische Infektionskrankheiten in Deutschland. Ergebnisse der Pilotierung eines Sero- und Verhaltenssurveys bei i. v. Drogengebrauchern. Epidemiol Bull. 33, Available from: http://www.rki.de/DE/Content/Infekt/EpidBull/Archiv/2012/Ausgaben/33_12.pdf?__blob=publicationFile 335-339 (2012).
  19. World Medical Association, Declaration of Helsinki. Ethical principles for medical research involving human subjects. JAMA. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  20. Young, D. S., Bermes, E. W., et al. Specimen collection and processing; sources of biological variation. Tietz textbook of clinical chemistry. Burtis, C. A., Ashwood, E. R. 58, 2nd edition, W. B. Saunders Company. Philadelphia. 58-101 (1994).
  21. H3-A6. Procedures for the collection of diagnostic blood specimens by venipuncture. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available from: http://shop.clsi.org/site/Sample_pdf/H3A6_sample.pdf (2007).
  22. H04-A6. Procedures and devices for the collection of diagnostic capillary blood specimens. , Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Wayne, PA. Available from: http://shop.clsi.org/site/Sample_pdf/H04-A6.pdf (2008).
  23. McDade, T. W. Development and validation of assay protocols for use with dried blood spot samples. Am J Hum Biol. 26 (1), 1-9 (2014).
  24. Judd, A., et al. Evaluation of a modified commercial assay in detecting antibody to hepatitis C virus in oral fluids and dried blood spots. J Med Virol. 71 (1), 49-55 (2003).
  25. Zweig, M. H., Campbell, G. Receiver-operating characteristic (ROC) plots: A fundamental evaluation tool in clinical medicine. Clin Chem. 39 (4), 561-577 (1993).
  26. Greiner, M., Pfeiffer, D., Smith, R. D. Principles and practical application of the receiver-operating characteristic analysis for diagnostic tests. Prev Vet Med. 45 (1-2), 23-24 (2000).
  27. Clopper, C. J., Pearson, E. S. The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of the binominal. Biometrika. 26 (4), Available from: http://www.bios.unc.edu/~mhudgens/bios/662/2007fall/clopper.pdf 404-413 (1934).
  28. Mei, J. V., Zobel, S. D., Hall, E. M., De Jesús, V. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Performance properties of filter paper devices for whole blood collection. Bioanalysis. 2 (8), 1403-1410 (2010).
  29. Masciotra, S., et al. Evaluation of blood collection filter papers for HIV-1 DNA PCR. J Clin Virol. 55 (2), 101-106 (2012).
  30. Li, F., Zulkoski, J., Fast, D., Michael, S. Perforated dried blood spots: a novel format for accurate microsampling. Bioanalysis. 3 (20), 2321-2333 (2011).
  31. Li, Y., Henion, J., Abbott, R., Wang, P. The use of a membrane filtration device to form dried plasma spots for the quantitative determination of guanfacine in whole blood. Rapid Commun Mass Spectrom. 26 (10), 1208-1212 (2012).
  32. Basavaraju, S. V., Pitman, J. P. Dried blood spots for use in HIV-related epidemiological studies in resource-limited settings. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 76-94 (2014).
  33. Chace, D. H., Spitzer, A. R., De Jesus, V. R. Applications of dried blood spots in newborn and metabolic screening. Dried blood spots for use in HIV-related epidemiological studies in resource-limited settings. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 53-75 (2014).
  34. Gakhar, H., Holodniy, M. Use of dried blood spot samples in HCV-, HBV-, and influenza-related epidemiological studies. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. 3, Wiley. Hoboken. 95-113 (2014).
  35. Villa, E., Cartolari, R., Bellentani, S., Rivasi, P., Casolo, G., Manenti, F. Hepatitis B virus markers on dried blood spots. A new tool for epidemiological research. J Clin Pathol. 34 (7), 809-812 (1981).
  36. Villar, L. M., de Oliveira, J. C., Cruz, H. M., Yoshida, C. F. T., Lampe, E., Lewis-Ximenez, L. L. Assessment of dried blood spot samples as a simple method for detection of hepatitis B virus markers. J Med Virol. 83 (9), 1529-1510 (2011).
  37. Lira, R., et al. Use of dried blood samples for monitoring hepatitis B virus infection. Virol J. 6 (1), 153 (2009).
  38. Jardi, R., et al. Usefulness of dried blood samples for quantification and molecular characterization of HBV-DNA. Hepatology. 40 (1), 133-139 (2004).
  39. Marques, B. L., et al. Dried blood spot samples: optimization of commercial EIAs for hepatitis C antibody detection and stability under different storage conditions. J Med Virol. 84 (10), 1600-1607 (2012).
  40. Larrat, S., et al. Performance of an antigen–antibody combined assay for hepatitis C virus testing without venipuncture. J Clin Virol. 55 (3), 220-225 (2012).
  41. Brandao, C. P., et al. Simultaneous detection of hepatitis C virus antigen and antibodies in dried blood spots. J Clin Virol. 57 (2), 98-102 (2013).
  42. Bennett, S., et al. Detection of hepatitis C virus RNA in dried blood spots. J Clin Virol. 54 (2), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22418454 106-109 (2012).
  43. Abe, K., Konomi, N. Hepatitis C virus RNA in dried serum spotted onto filter paper is stable at room temperature. J Clin Microbiol. 36 (10), 3070-3072 (1998).
  44. Croom, H. A., et al. Commercial enzyme immunoassay adapted for the detection of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spots. J Clin Virol. 36 (1), 68-71 (2006).
  45. Mendy, M., et al. Hepatitis B surface antigenaemia and alpha-foetoprotein detection from dried blood spots: applications to field-based studies and to clinical care in hepatitis B virus endemic areas. J Viral Hepat. 12 (6), 642-647 (2005).
  46. Komas, N. P., Baï-Sepou, S., Manirakiza, A., Léal, J., Béré, A., Le Faou, A. The prevalence of hepatitis B virus markers in a cohort of students in Bangui, Central African Republic. BMC Infect Dis. 10, 226 (2010).
  47. Parker, S. P., Cubitt, W. D., Ades, A. E. A method for the detection and confirmation of antibodies to hepatitis C virus in dried blood spots. J Virol Methods. 68 (2), 199-205 (1997).
  48. McCarron, B., et al. Hepatitis C antibody detection in dried blood spots. J Viral Hepat. 6 (6), Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10607263 453-456 (1999).
  49. Tuaillon, E., et al. Dried blood spot for hepatitis C virus serology and molecular testing. Hepatolog. 51 (3), 752-758 (2010).
  50. Solomon, S. S., et al. Dried blood spots (DBS): a valuable tool for HIV surveillance in developing/tropical countries. Int J STD AIDS. 13 (1), 25-28 (2002).
  51. Lakshmi, V., Sudha, T., Bhanurekha, M., Dandona, L. Evaluation of the Murex HIV Ag/Ab Combination assay when used with dried blood spots. Clin Microbiol Infect. 13 (11), 1136-1110 (2007).
  52. Sarge-Njie, R., et al. Evaluation of the dried blood spot filter paper technology and five testing strategies of HIV-1 and HIV-2 infections in West Africa. Scand J Infect Dis. 38 (11-12), 1050-1056 (2006).
  53. de Castro, A. C., Borges, L. G. dosA., de Souza, R. daS., Grudzinski, M., D’Azevedo, P. A. Evaluation of the human immunodeficiency virus type 1 and 2 antibodies detection in dried whole blood spots (DBS) samples. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 50 (3), 151-156 (2006).
  54. Fan, L., Wan, K., Kavetskaia, O., Wu, H. Automation in dried blood spot sample collection, processing, and analysis for quantitative bioanalysis in pharmaceutical industry. Dried blood spots. Applications and techniques. Li, W., Lee, M. S. , Wiley. Hoboken. 229-234 (2014).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 97 יבשים דם כתמים כרטיסי נייר סינון אחסון הדגימה מחלות זיהומיות וירוס הפטיטיס B הפטיטיס C וירוס וירוס הכשל החיסוני האנושי
כתמי דם מיובשים - הכנה ועיבוד לשימוש ב- Immunoassays וב -טכניקות מולקולריות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grüner, N., Stambouli, O.,… More

Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques. J. Vis. Exp. (97), e52619, doi:10.3791/52619 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter