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Biology

Macchie di sangue essiccato - preparazione ed elaborazione per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari

Published: March 13, 2015 doi: 10.3791/52619
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Virology, National Reference Centre for Hepatitis C, Essen University Hospital, University of Duisburg-Essen

Summary

La preparazione e il trattamento delle macchie di sangue essiccato (DBS) per la loro analisi finale sono ancora poco standardizzati per la maggior parte delle applicazioni diagnostiche. Per ovviare a questa lacuna, un protocollo completo di passo-passo è suggerito e successivamente valutato per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di markers di infezioni virali.

Abstract

L'idea di raccolta di sangue su una carta di carta e successivamente usando le macchie di sangue essiccato (DBS) per scopi diagnostici, è nato un secolo fa. Da allora, DBS test per decenni è rimasta prevalentemente focalizzata sulla diagnosi delle malattie infettive, soprattutto nelle impostazioni di risorse limitate o sistematica di screening dei neonati per malattie metaboliche ereditarie e solo recentemente hanno una varietà di nuove e innovative applicazioni DBS cominciate ad emergere. Per molti anni, le variabili pre-analitiche sono state considerate solo impropriamente nel campo di prova di DBS e ancora oggi, con l'eccezione di screening, l'intera fase di pre-analitica, che comprende la preparazione e la lavorazione di DBS per neonato loro analisi finale non sono stato standardizzato. Dato questo sfondo, un protocollo completo di passo-passo, che si estende alle fasi essenziali, è proposto, cioè, raccolta di sangue; preparazione delle macchie di sangue; essiccazione delle macchie di sangue; stoccaggio e trasporto di DBS; eluizione di DBS e infine le analisi di eluati DBS. L'efficacia del presente protocollo in primo luogo è stata valutata con coppie di 1.762 accoppiati del siero/DBS per la rilevazione di marcatori del virus dell'epatite B, epatite C virus e infezioni da virus dell'immunodeficienza umana su una piattaforma analitica automatizzata. In una seconda fase, il protocollo è stato utilizzato nel corso di uno studio pilota, che è stato condotto sui tossicodipendenti attivi nelle città tedesche di Berlino ed Essen.

Introduction

L'idea di utilizzare campioni di sangue prelevati su una carta di carta di cellulosa è attribuita a Ivar Christian Bang (1869-1918), il padre della moderna clinica microanalisi1, 2. Nel 1913, Bang determinato glucosio dalle misurazioni di azoto eluati di sangue secco macchie (DBS)3 e, successivamente, anche eseguiti utilizzando il metodo di Kjeldahl con questo filtro carta tecnica2. Successivamente, parecchi ricercatori hanno riferito sull'uso di DBS per test sierologici per la diagnosi di sifilide2. Come presto come nel 1924, Chapman riepilogato i vantaggi di DBS test quando ha particolarmente sottolineato quattro elementi, che sono ancora validi oggi: venipuntura rispetto al convenzionale (1), è necessario meno volume di sangue e questo fatto era più importante in pediatrica diagnostica; (2) raccolta del sangue è semplice, non invasivo e poco costoso; (3) il rischio di contaminazione batterica o di emolisi è minimo; e DBS (4) può essere conservato per lunghi periodi con quasi nessun deterioramento degli analiti2, 4. Oltre al suo uso in fase di test per la sifilide, ulteriormente prime applicazioni della tecnica DBS includevano, ad esempio, la rilevazione degli anticorpi contro morbillo, parotite, poliovirus, virus parainfluenzali e virus respiratorio sinciziale (RSV) nel 19532, l'identificazione di Shigella nelle feci essiccate su carta da filtro e spediti per posta ordinaria dall'Indonesia a Leida, nei Paesi Bassi, nonché la rilevazione di anticorpi anti-Schistosoma in DBS presi nelle zone endemiche ed analizzati più di tre mesi più tardi5 . Nel 1963, cinquant'anni dopo di Bang originale comunicazione2, 6, Guthrie ha finalmente pubblicato il suo famoso metodo per la diagnosi di fenilchetonuria da DBS ottenuti da una puntura di tacco da neonati7, 8.

Anche se da quel momento in poi, DBS erano considerati un metodo comunemente applicabile per la raccolta, stoccaggio, trasporto e analizzare una varietà di liquidi organici umani5, loro uso nella diagnostica ancora rimasto principalmente focalizzata sulla diagnosi di infezioni soprattutto nelle impostazioni di risorse limitate e lo screening sistematico dei neonati per disordini metabolici ereditati per decenni9, 10. Dal 2005, tuttavia, una varietà di nuove e innovative applicazioni DBS hanno cominciato ad emergere. Ciò ha provocato un aumento quasi esponenziale del numero delle rispettive pubblicazioni scientifiche su DBS da circa 50 a quasi 450 annualmente al momento. Tra le applicazioni emergenti sono tali campi vari come tossico - e gli studi farmacocinetici, profiling metabolico, monitoraggio terapeutico del farmaco, tossicologia forense o contaminazione ambientale controllo10, 11.

DBS test ha, così, di fatto una marcia trionfale attraverso diagnostica clinica di laboratorio nel corso degli ultimi 100 anni2. Come in chimica clinica12, tuttavia, durante questa marcia variabili pre-analitiche non erano adeguatamente considerate per molti anni. Infatti, ancora oggi, dopo tali attività eminente come carta da filtro valutazione progetto13 del CDC o la formulazione di una norma nazionale per la raccolta di sangue su carta da filtro nel quadro del neonato di screening14, la fase pre-analitica è ancora in gran parte sottovalutato nella maggior parte degli altri campi, in cui DBS test è applicata di5, 10.

Dato questo sfondo, un protocollo completo passo passo14-16 per l'uso in test immunologici e tecniche molecolari, che copre tutti i passaggi essenziali, è suggerito per la preparazione e l'elaborazione di DBS nella seguente comunicazione: (1) raccolta di sangue; (2) preparazione di macchie di sangue; (3) essiccazione delle macchie di sangue; (4) stoccaggio e trasporto; (5) eluizione di DBS; e infine (6) analisi di eluati DBS. L'efficacia del protocollo in primo luogo è stata valutata con coppie di 1.762 accoppiati del siero/DBS per la rilevazione dell'epatite B (HBV) virus antigene di superficie (HBsAg), anticorpi anti-antigene "core" dell'HBV (anti-HBc), gli anticorpi all'antigene di superficie dell'HBV (anti-HBs), HBV DNA, anticorpi per il virus dell'epatite C (HCV) (anti-HCV), HCV RNA e virus dell'immunodeficienza umana (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 utilizzando una piattaforma completamente automatizzata o dell'acido nucleico qualitativa sensibile test. 17. in una seconda fase, il protocollo è stato utilizzato nello studio pilota "droghe e malattie infettive croniche" ("studio DRUCK") che è stato condotto da Robert Koch-Istituto in stretta collaborazione con il centro di referenza nazionale per l'epatite C su attivo di stupefacenti nelle città tedesche di Berlino ed Essen18.

Protocol

Poiché il protocollo è progettato per l'uso nella diagnostica medica, l'applicazione deve seguire i principi della dichiarazione di Helsinki19. Per la prima parte dei risultati presentati in questa comunicazione, sia un accordo separato dai pazienti e approvazione di un comitato etico sembrava essere superflua per due motivi: (1) "al momento del ricovero" all'ospedale dell'Università di Essen, "ogni paziente fornisce consenso scritto di tutte le indagini biochimiche, batteriologiche e virologiche necessarie." 17 (2) "tutti i campioni utilizzati durante la valutazione di DBS test sono stati inviati per l'Istituto di virologia nel processo di diagnostica clinica di routine. Così, nessuno degli esemplari sono stati raccolti specificamente ai fini dello studio, non un singolo aggiuntiva venipuntura è stato effettuato e nessuno dei materiali è stato testato per qualsiasi parametro diverso da quelli richiesti dai medici nel corso del normale work-up diagnostico." 17 lo studio "Droghe e malattie infettive croniche" (studio DRUCK")18, in cui DBS test infine è stato usato nelle città tedesche di Berlino ed Essen per valutare le persone che hanno attivamente iniettano farmaci, è stato approvato dal Commissario federale per i dati Protezione e libertà di informazione (Berlino, Germania) e anche come dal comitato etico del Charité Medical University, (Berlino, Germania).

1. raccolta del sangue

  1. Prelievo venoso14, 15, 20, 21
    1. Indossare guanti monouso in lattice di gomma e pulire l'area del sito di puntura previsto (preferibilmente la vena cubitale mediana nella fossa antecubitale) con un disinfettante appropriato, ad esempio, alcool isopropilico al 70%.
    2. Applicare un laccio emostatico 4 – 6 pollici sopra il sito di puntura putativo per distendere le vene. Guidare l'ago nella vena del paziente e, una volta che è in atto, delicatamente riempire la provetta di sangue collegato, che contiene EDTA come anticoagulante.
    3. Appena venipuntura è completa, rilasciare il laccio emostatico e ritirare l'ago. Quindi, premere un tampone di garza asciutta sul sito della puntura, che successivamente può essere tenuto in posizione da una benda.
  2. Puntura della pelle (Figura 1A)13-15, 20, 22, 23
    1. Mettere su un paio di guanti monouso in lattice di gomma.
    2. Prima della puntura della pelle, il paziente dovrebbe scaldare il suo mani. Il dito è massaggiato anterograda arricchire il sangue fluire verso al sito di puntura.
    3. Pulire la pelle del lato palmar della falange distale di punta del terzo o quarto dito della mano non-scrittura con un disinfettante adatto, per esempio, alcol isopropilico al 70%. Forare la pelle di una lancetta monouso di sicurezza. Il dito dovrebbe tenersi in posizione tale che la gravità facilita la raccolta di sangue sul polpastrello.
    4. Quando la raccolta di sangue capillare da puntura della pelle è completa, posizionare una fasciatura sulla punta del dito.

2. preparazione di macchie di sangue

  1. Preparazione da sangue prelevati tramite prelievo venoso15
    1. Individuare i raccolti anticoagulato (EDTA) sangue intero venoso sulle carte filtro appena possibile. Non preparare macchie di sangue secco, più di 24 ore dopo il prelievo venoso.
    2. Mettere tutte le informazioni necessarie per l'identificazione del paziente sulla scheda filtro. Una carta dovrebbe essere individuata solo con il sangue di un singolo individuo.
    3. Indossare guanti monouso in lattice di gomma.
    4. Capovolgere delicatamente la provetta 2-4 volte e successivamente aprire il tappo con cautela.
    5. Aspirare 50 µ l di sangue intero venoso utilizzando una pipetta con punta monouso. Trasferire il sangue al centro di un cerchio senza toccare la carta da filtro direttamente con la punta della pipetta. Tenta di saturare completamente il cerchio.
    6. Ripetere questa procedura per riempire tutti i cerchi richiesti della carta.
  2. Preparazione da sangue raccolti dalla pelle puntura (figure 1B e 1C)13-16, 23
    1. Eliminare la prima goccia di sangue con un tampone di garza perché può contenere liquidi dei tessuti in eccesso. Massaggiare il dito per aumentare il flusso sanguigno al sito di puntura. Trasferire la goccia seguente in uno dei circoli di una carta filtro senza toccare la superficie direttamente con il polpastrello. Permettere al sangue di essere immersi nella trama del filtro da forze capillari solo.
    2. Lasciate che la prossima grande goccia di forma di sangue capillare sulla punta del dito e raccoglierlo nel cerchio successivo. Continuare questa procedura fino a quando tutti i cerchi necessari sono pieni o si interrompe il flusso di sangue.
    3. Non spremere o "latte" il dito eccessivamente se il flusso di sangue non è sufficiente a riempire tutti i cerchi richiesti della carta filtro. Se si interrompe il flusso di sangue è possibile inserire una benda sulla punta delle dita. Eseguire una seconda puntura della pelle su un altro dito se più sangue è necessaria per l'esame.

3. asciugatura di macchie di sangue

  1. Per asciugare le macchie di sangue, mettere il filtro carte su una carta pulita asciugamano in un armadietto di sicurezza biohazard e lasciarli asciugare, preferibilmente O/N (ma per almeno 4 ore), a RT in assenza di qualsiasi fonte esterna di calore. Quando il processo di essiccazione è completo, le macchie di sangue hanno un colore marrone scuro uniforme e zone rosse non sono visibili piu ' (Figura 1)13, 15, 16.

4. stoccaggio e trasporto di macchie di sangue essiccato (DBS)

Nota: L'elaborazione delle macchie di sangue può essere interrotto dopo l'essiccazione. Le carte di filtro possono ora essere memorizzati13-16, 23.

  1. Per deposito, mettere la scheda di carta da filtro in un sacchetto di chiusura lampo singolo, gas-impermeabile, contenente 1-2 bustine essiccante per proteggere gli esemplari da umidità (Figura 1E). Facoltativamente, aggiungere una scheda di indicatore di umidità.
  2. Trasferire questa borsa per un congelatore con una temperatura di-20 ° C o inferiore appena possibile. Se non sono disponibili in condizioni di campo congelatori, deposito-4 ° c o anche a temperatura ambiente è fattibile fino a 14 giorni.
  3. Trasporto campioni congelati di DBS su ghiaccio secco. Per filtro carte inizialmente mantenuti a temperatura ambiente, utilizzare un sistema di confezionamento triple, che consiste la cerniera borsa (s) come i contenitori dei interna come pure un'interiore e una busta esterna. Nessun contenuto marcature sono tenute sulla busta esterna per la spedizione per posta ordinaria, ma il simbolo di rischio biologico internazionale deve essere apposto il contenitore primario interno16.
  4. Escludere le carte filtro da ulteriore elaborazione se i dessiccante e/o la scheda di indicatore di umidità ulteriori assume un colore rosa.

5. eluizione di sangue essiccato punti13, 15, 16, 23

  1. Punch out uno spot con un dispositivo monouso 6 mm da ogni cerchio intrisa di sangue della scheda filtro Grade 903 (Figura 1F). Trasferimento tutti i pugni macchie di sangue secco da un singolo paziente per un pozzetto della piastra 12-pozzetti.
  2. Riempire il pozzetto con tampone fosfato salino contenente 0.05% Tween 20 e 0,08% di sodio azide (Figura 1). Adattare il volume del buffer aggiunto ai minimi requisiti rispettivi del dosaggio utilizzato per la successiva analisi di eluati di macchie di sangue essiccato.
  3. Ripetere questi passaggi per ottenere una seconda serie di eluati chiazza di sangue essiccato al fine di eseguire analisi molecolari.
  4. Mettere la piastra di coltura cellulare su un agitatore di laboratorio e lasciate che le macchie di sangue essiccato perforato eluire delicatamente per un minimo di 4 ore o, preferibilmente, O/N (Figura 1 H).
  5. Il giorno successivo, le macchie sono quasi esenti da sangue e surnatanti emolitici hanno formato (Figura 1I). Trasferire questi eluati microcentrifuga. Quindi, di sottoporli a centrifugazione per 2 min a 10.500 x g (Figura 1J) gratuita i surnatanti da eventuali detriti che si era formata durante l'eluizione (Figura 1 K).

6. analisi degli eluati

  1. Centrifugato di eluati sono ora pronti per essere utilizzati per le analisi previste. Indagare gli eluati marcatori del virus dell'epatite B, virus dell'epatite C e l'infezione da HIV usando i kit disponibili in commercio e seguire attentamente le istruzioni dei rispettivi produttori (Figura 1 L).

Figure 1
Figura 1. Riepilogo grafico del protocollo proposto nella presente comunicazione per preparazione e del trattamento di macchie di sangue essiccato essere utilizzato nei immunoassays e mediante tecniche molecolari. Sangue intero venoso e sangue capillare, ottenuto a seguito di iniezione in vena o puntura della pelle di una lancetta (A) possono servire come campioni per analisi chiazza di sangue essiccato. Dopo il trasferimento del sangue ai cerchi di una carta di filtro Grade 903 (B, C), i campioni dovrebbero essere asciugati preferibilmente O/N a temperatura ambiente in un armadietto a macchie di forma di un colore uniformemente marrone senza qualsiasi interspersion di rosso di sicurezza biohazard aree (D). Quando l'essiccazione delle macchie di sangue è completo e deposito è necessario, le carte di filtro possono essere confezionate in sacchetti di cerniera gas-impermeabile contenente 1-2 bustine di essiccante (E). Ulteriore elaborazione di laboratorio della DBS comprendono la generazione di pugni di un dispositivo monouso 6 mm dal centro dei cerchi (F, G), l'eluizione dei pugni in un buffer basato su PBS per un minimo di 4 ore o, preferibilmente, O/N su un agitatore (H ), il recupero di eluati (io) e, infine, centrifugazione delle tazze del laboratorio (J) gratuita Gli eluati DBS da eventuali detriti che potrebbero aver avuto origine durante il processo di eluizione (K). Successivamente, gli eluati DBS sono pronti per le analisi, che sono state eseguite da una piattaforma completamente automatizzata (L) al fine di individuare indicatori sierologici di HBV, HCV e HIV infezioni, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Representative Results

L'efficacia del protocollo suggerito per la preparazione e lavorazione di DBS in primo luogo è stata valutata analizzando 1.762 coppie accoppiati del siero/DBS per marcatori di infezione da HBV, HCV e HIV. 17. per questo scopo, DBS sono stati preparati da 100 µ l di sangue intero venoso (cfr punti 2.1.1 – 2.1.6 del protocollo precedente) e sono stati eluiti con 1.000 µ l di PBS-based buffer, ciascuno, (cfr punti 5.1-5.5 del suddetto protocollo) per completare il processo per tutti i sette parametri in due operazioni distinte. Tale approccio senza un'attenta ottimizzazione delle condizioni di eluizione per ogni singolo analita sembrava essere inevitabile perché un throughput di campione piuttosto alto era previsto in un tempo relativamente breve durante lo studio di campo prossimo "droghe e cronica Malattie infettive"("studio DRUCK").

Tutte le misurazioni aderito alle raccomandazioni del produttore nel corso di analisi DBS, ma ha dovuto essere modificata per quanto riguarda le determinazioni di HBsAg e anti-HBs per compensare per l'effetto del hemolysis o il risultato di diluizione. Con un valore di cut-off di 0,05 IU/ml, HBsAg test di DBS eluati piombo ad un tasso di falsi positivi del 14,7% (52 su 354) rispetto al siero campioni (Figura 2A). Funzionamento (caratteristici ROC) analisi25, 26 dei dati del ricevitore indicato che una separazione ideale di HBsAg-positivi da HBsAg-negativi (0.986 [sensibilità], 0.000 [1-specificità], comporterebbe un aumento della soglia di 0,15 UI/ml Figura 2B). D'altra parte, con un cut-off di 10 UI/l per la quantificazione di anti-HBs anticorpi che un tasso di falsi-negativi misurazioni del 14,2% (47 su 331) è stato registrato (Figura 2). Quindi, a seguito di analisi ROC nuovamente, questo taglio è stato abbassato a 1,5 IU/l per ottenere una discriminazione ottima dei valori (0.917 [sensibilità], 0,007 [1-specificità], Figura 2D).

Figure 2
Figura 2. HBsAg e anti-HBs in eluati DBS (modificati da17) test. L'aumento di ROC-guida del valore di cut-off per la quantificazione di HBsAg da 0,05 IU/ml (A) a 0,15 IU/ml (B) riduce il tasso di risultati falsi-positivi dal 14,7% a 0%. Allo stesso modo, l'analisi ROC delle concentrazioni di anti-HBs ha suggerito una diminuzione della rispettiva soglia da 10 IU/l (C) a 1,5 IU/l (D), quindi completamente eliminando falsi negativi, inizialmente pari al 14,2% di tutte le determinazioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

I risultati delle analisi accoppiati del siero/DBS sono riassunti in tabella 117. Nessun non-specificità è stata registrata nel corso della DBS test per uno qualsiasi dei sette analiti.

Quando gli eluati DBS sono stati studiati per la presenza di HBsAg, cioè il parametro key sierologico dell'infezione sia acuta che cronica con HBV, è stata determinata una sensibilità analitica del 98,6%. Le concentrazioni di HBsAg nei due sieri falsamente negativi erano 749 IU/ml e 6 UI/ml, rispettivamente. Anticorpi anti-HBc con successo sono stati rilevati in 176 su 204 (i. e 86,3%) Eluati DBS. Ventidue fuori i 28 esemplari che non sono stati rilevati dalle misure ha provenute da individui co-infettati con HIV. Così, se gli individui HIV-positivi sono stati esclusi dal calcolo, una sensibilità del 97,1% è stata realizzata per il recupero di anticorpi anti-HBc da sangue intero venoso secco eluiti. Osservazioni simili valeva per la determinazione degli anticorpi anti-HBs. Anche dopo la regolazione del valore di cut-off del saggio ad 1,5 IU/l, nove discrepanti siero DBS risultati si sono presentati. Nei pazienti non co-infettati con HIV, le concentrazioni di siero anti-HBs di 11 – 26 IU/l sono state trovate, che erano troppo basse per consentire il rilevamento dopo eluizione di sangue essiccato.

Anticorpi anti-HCV sono indicativi di infezione acuta o cronica o risolta. Solo quattro risultati di falsamente negativo anti-HCV (i. e. 2.2%) sono stati determinati da eluati DBS e ulteriori analisi sierologiche e molecolare ha dimostrato chiaramente che i rispettivi sieri molto probabilmente sono stati presi dai pazienti, cui infezioni da lungo tempo erano stato risolto.

La ricerca di anticorpi anti-HIV in eluati DBS con il sistema completamente automatizzato è stato un processo completamente liscio che ha reso una sensibilità analitica del 100%.

"Concentrazione media dell'HBV DNA da sangue intero eluati è stata effettuata su 100 esemplari (concentrazione di DNA media: 1.573.898 IU/ml, range: < 357 - > 17,860,000 IU/ml) e ha dato un valore di 93,0%. Così, sette campioni con concentrazioni di HBV DNA del siero basso tra 409 e 3.643 IU/ml non sono stati rilevati da DBS test. Di 100 sieri che avevano dimostrato di essere positivo del RNA di HCV (HCV RNA concentrazione media: 1.415.944 IU/ml, range: 2.479 - > 7.692.000 IU/ml), corrispondenti aliquote di sangue intero erano disponibili. L'indagine comparativa ha provocato una sensibilità analitica del 100% per le determinazioni di RNA di HCV da eluati DBS". 17

Per testare il protocollo delineato per la preparazione e l'elaborazione di DBS in condizioni di campo, è stato usato in stretta collaborazione con l'Istituto Robert Koch-(Berlino, Germania) durante la fase pilota dello studio "Droghe e malattie infettive croniche", che era condotti sui tossicodipendenti attivi nelle città tedesche di Berlino ed Essen18. Tutti i 534 partecipanti iscritti (433 uomini e 101 donne) hanno subito il prelievo di sangue capillare come descritto in dettaglio nelle sezioni 2.2.1 – 2.2.3 del protocollo precedente, e DBS erano, ancora una volta, eluita mediante aggiunta di 1.000 µ l di tampone PBS-basato.

Due individui sono stati diagnosticati per essere cronicamente infettato con HBV, e 39 ha mostrato il modello sierologico di un'infezione da HBV risolto. Inoltre, quindici partecipanti erano positivi per anti-HBs (lo stato dopo la vaccinazione) e otto sono stati trovati per essere positivi per anti-HBc isolato. La prevalenza di anti-HCV tra i partecipanti era 57,3% (N = 193) a Berlino e 73.0% (N = 144) a Essen. Dall'anticorpo-positivo campioni 65% (N = 125) e 62% (N = 89) erano anche viremici. Venti-cinque fuori gli 534 individui risultati positivi per anti-HIV. Diciannove delle infezioni erano già conosciuti e 24 di questi individui sono stati co-infettati con HCV.

I risultati ottenuti dai test di DBS con attenzione sono stati confrontati con i dati anamnestic dei partecipanti di studio per quanto riguarda lo stato auto-riferito di HBV e HCV. Questo confronto in combinazione con i risultati dei test accoppiato coppie siero/DBS hanno portate a modifiche minori dell'algoritmo test per la fase principale dello "Studio DRUCK", che sarà iscrivere gli utenti di droga attiva in sei ulteriori grandi città tedesche: "gli individui infettati con HIV sarà sempre testato per la presenza di HBV DNA. Partecipanti di cui eluati DBS sono positivi per anti-HBc o anti-HBs dovrebbero essere sottoposti a un prelievo venoso durante una seconda fase di consultazione al fine di chiarire sicuramente il loro status di anti-HBc/anti-HBs e, infine, tutti gli eluati DBS saranno proiettati per l'HCV RNA indipendentemente dai risultati dei test anti-HCV". 17

Parametri Sieri accoppiati/DBS eluati (N) Risultati discrepanti (N) Motivo delle discrepanze tra test siero ed eluati DBS
HBV
HBsAg 299 2 Due pazienti con infezione cronica da HBV. Entrambi erano sotto trattamento antivirale e uno di loro era co-infettato con HIV. Le concentrazioni di HBsAg nel siero: 749 IU/ml e 6 UI/ml, rispettivamente.
Anti-HBc 305 28 Nel siero, ventidue pazienti hanno avuti un'infezione HBV risolta. Sei individui hanno mostrato il reperto sierologico "anti-HBc alone". Ventidue dei pazienti erano co-infettati con HIV. Da "i resolver HBV", venti sono stati valutati come "Anti-HBs positivi solo" testando DBS e, quindi, sono stati erroneamente classificati come "condizione dopo la vaccinazione".
Anti-HBs 310 9 I quattro pazienti non co-infetti con HIV hanno avuti concentrazioni di siero anti-HBs di 11 ‑ 26 IU/l, che erano troppo basse per consentire il rilevamento di anticorpi dopo eluizione delle macchie di sangue essiccato.
HBV DNA 150 7 I rispettivi sieri erano stati ottenuti da sette pazienti con concentrazioni di HBV DNA basso del siero che variano da 409 IU/ml a 3.643 IU/ml.
HCV
Anti-HCV 339 4 Questi quattro sieri erano stato preso dai pazienti con infezione da HCV risolte da tempo.
HCV RNA 150 0 –
HIV
HIV 1-p24/anti-HIV 1/2 209 0 –

Tabella 1: Risultati ottenuti da 1.762 DBS, che sono stati preparati e trasformati dal successivo di sangue intero venoso il protocollo proposto nella presente comunicazione, confrontano ai risultati nei campioni accoppiati del siero come riferimento.

Discussion

DBS sono stati utilizzati per 100 anni2 ma, sorprendentemente, non ci è ancora consenso generale sulla loro preparazione e l'elaborazione. Ad oggi, una sufficiente standardizzazione di questa importante fase pre-analitica è stata conseguita solo in materia di screening neonatale14, considerando che esiste una varietà di diversi protocolli per tutte le altre applicazioni di DBS test5, 16, 23. Per superare questa eterogeneità notevole, una completa istruzione dettagliata per la preparazione e l'elaborazione di DBS per essere utilizzato nei immunoassays e mediante tecniche molecolari è presentata nella presente comunicazione e valutata per quanto riguarda la sua efficacia per la rilevazione di marcatori d'infezione da HBV, HCV e HIV. L'obiettivo della discussione seguente è posto principalmente sulle diverse fasi del protocollo suggerito.

Nella storia della DBS test molti diversi filtro carta carte sono state usate2 ma oggi solo due fonti commerciali sono approvati dalla FDA come dispositivi medici di classe II per la raccolta di sangue5, 16. Questi sistemi di carta filtro sono altamente uniformi e abbiano caratteristiche di assorbimento molto simili, in modo che i risultati analitici ottenuti da sangue capillare preparato su una di esse non differiscono di oltre il 4%-5%28. Non sorprendentemente, Masciotra e colleghi di lavoro29 pertanto rilevato HIV-1 RNA ugualmente bene con un dosaggio qualitativo dopo eluizione da schede di raccolta di sangue da diverse fonti. Dato questi dati, si può praticamente escludere che qualsiasi delle discrepanze osservate durante il test accoppiato coppie siero/DBS per marcatori dell'HBV, HCV e HIV infezioni17 è stata causata dalla scelta della carta filtro da solo. Tuttavia, quando è indispensabile accurata quantificazione di un analita, source-to-source variazione non potrebbe essere più trascurabile e tecniche più sofisticate, per esempio, perforato DBS (PDB) come un metodo per Microcampionamento30 o la preparazione delle macchie secche del siero (DSS)31 potrebbe essere necessario applicare al posto del convenzionale DBS test10.

Poiché solo piccole quantità di sangue sono usate per DBS test (una goccia di sangue capillare è costituita da circa 50 µ l)5, 16, variazioni del volume di campione sono essenziali e, devo ammettere che, in almeno alcune delle discrepanze tra i risultati sierologici e del partecipante auto-riferito stato HBV e HCV, registrato durante il pilotaggio dello "Studio DRUCK" sono attribuibili a questa variabile. Il singolo fattore più importante per ridurre al minimo le "fluttuazioni" il volume del campione è senza dubbio una tecnica corretta di prelievo di sangue capillare, che può essere raggiunto solo da un'attenta e costante formazione del personale tecnico22. Inoltre, come misura di controllo di qualità, tutti i laboratori che lavorano con DBS dovrebbero già avviato le procedure per l'identificazione e successivamente escluse esemplari DBS che devono essere considerati come insoddisfacente o non valido16.

Gli studi condotti principalmente nel contesto dell'HIV32 e screening neonatale33 hanno dimostrato che alta umidità può portare ad un degrado degli analiti, ma finora nessun consenso è stato raggiunto per quanto riguarda la questione di quanto tempo DBS dovrebbe essere asciugato ad aria . Un intervallo di almeno 4 ore o preferibilmente O/N è proposto nella presente comunicazione, che ha pertanto adottato condizioni che sono state utilizzate nella stragrande maggioranza di tutte le pubblicazioni pertinenti32, 34 dati su storage di DBS per essere utilizzati successivamente per HBV e HCV test sono in conflitto. Nel 1981, Villa e colleghi di lavoro35, che ha applicato le tecniche analitiche contemporanee, ha riferito che deposito presso RT non ha influenzato i risultati delle analisi HBV durante l'intero periodo di osservazione di 180 giorni se titoli dell'anticorpo erano > 1/1.000, ma quel DBS è diventato borderline-positiva o addirittura negativo dopo 15 giorni quando i titoli nel siero erano solo 1/100. Conservazione a-20 ° C o a 4 ° C non ha provocato un miglioramento notevole. Al contrario, uno studio condotto trent'anni più tardi36 testato replica di un campione di HBV-positivi, e gli autori hanno trovato che anti-HBc così come gli anticorpi anti-HBs erano stabili fino a 183 giorni a RT, mentre è diventato HBsAg alle stesse condizioni falso-negativo già dopo 63 giorni. Per quanto riguarda la rilevazione del DNA di HBV da eluati DBS, la concentrazione dell'acido nucleico virale è stato stabile per almeno sette giorni a 37 ° C37 o ha dimostrato di essere "resistenti" al deposito presso RT fino a tre settimane38. Test per anticorpi anti-HCV utilizzando due terza generazione disponibili in commercio test immunologici39 fornito risultati accurati per un periodo di 117 giorni utilizzando DBS campioni conservati a-20 ° C, 2 – 8 ° C e 20 – 25 ° C, rispettivamente. Conservazione a-20 ° C, tuttavia, ha provocato la minima variazione di densità ottica. L'applicazione di una quarta generazione anti-HCV ELISA, cioè, Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, nel contesto della DBS test, Larrat et al. 40 osservata una drastica riduzione nella specificità analitica dopo la memorizzazione gli esemplari DBS per più di tre giorni a TA. D'altra parte, precisi risultati della prova sono stati ottenuti con lo stesso kit che utilizzano campioni depositati per 60 giorni in varie condizioni (-20 ° C, 2 – 8 ° C e 22 – 26 ° C) da Brandao e co-lavoratori41. Osservazioni sul declino delle concentrazioni di RNA di HCV in DBS in varie condizioni di deposito variano da nessuna alterazione significativa a RT per fino a un anno42 a un cambiamento dieci volte dopo quattro settimane a temperatura ambiente43. Prendendo questi dati piuttosto contrastanti sulla stabilità dell'HBV e HCV antigeni, acidi nucleici e anticorpi in considerazione, è sembrato ragionevole per ritrarre in proposta di protocollo per un consenso, che è stata definita in precedenza per il deposito degli esemplari DBS da utilizzarsi per HIV test15, 30: per deposizione a breve termine (fino a due settimane) gli antigeni, acido nucleico virale e gli anticorpi sono considerati come stalla di RT, considerando che congelate condizioni ottimali di conservazione per periodi più lunghi.

Come regola, tre parametri da considerare durante la progettazione di un protocollo di eluizione: (1) il buffer di eluizione; (2) la durata e la temperatura di eluizione; e (3) il volume di eluizione23. La stragrande maggioranza di tutte le pubblicazioni pertinenti tampone fosfato salino (PBS) è stato usato per eluizione DBS, in maggior parte dei autori hanno aggiunto una proteina, per esempio, albumina di siero bovino (BSA) o Tween 20, un tensioattivo, al fine di migliorare il segnale del dosaggio stabilizzando proteine, come vanno in soluzione e contemporaneamente blocco di siti di legame non specifico23. Soltanto alcuni rapporti, che confrontano direttamente il buffer di eluizione diverse nel contesto della DBS test, sono disponibili. Villar et al. 36, per esempio, registrato capacità di eluizione quasi equivalenti per tutti i buffer usati, ma PBS/BSA 0.5% ha provocato il più basso livello di reattività aspecifica. Un'osservazione molto simile è stata fatta da Croom e colleghi di lavoro44 quando si applica il diluente della genetica sistemi rLAV EIA per l'eluizione di anticorpi anti-HCV da DBS. Poiché il rischio di degradazione del campione è eccessivamente basso nelle prime ore dopo la preparazione della DBS (Vedi sopra), è stato deciso per incubare le macchie O/N a temperatura ambiente e a sostenere il processo di eluizione di miscelazione delicata estremità sopra. Questo approccio ha il vantaggio che gli esemplari perforati con il precedente giorno possa essere trasferito direttamente per la diagnostica di routine presto la mattina successiva23. Il volume di tampone di eluizione dovrebbe essere adattato ai minimi requisiti rispettivi dosaggi utilizzati per analisi successive al fine di mantenere il fattore di diluizione più bassa possibile. Tuttavia, un'attenta ottimizzazione delle condizioni di eluizione per ogni singolo analita non era possibile nella valutazione precedente perché un throughput elevato campione doveva essere garantito in un tempo relativamente breve durante il "DRUCK studio"17. Di conseguenza, il volume piuttosto sfavorevole di 1.000 µ l di tampone PBS-base è stato utilizzato al fine di completare il processo di eluizione intero per tutti i parametri in due operazioni distinte.

Questo approccio uno una parte non riesce "completamente nel sistema anti-HBc/anti-HBs per quegli individui infettati con l'HIV a causa delle concentrazioni di anticorpi Bassi; ... e ha richiesto procedure biologiche molecolari con sensibilità analitica ottimale per quanto riguarda il DNA di HBV e HCV RNA test. " 17 d'altra parte, il volume di eluizione elevato dimostrato di essere in alcun modo svantaggioso per la determinazione di HBsAg, anti-HCV e anti-HIV di kit utilizzato durante la valutazione. "La rilevazione dell'HBsAg positivi materiali da sangue intero eluati è riusciti con una sensibilità del 98,6% ad un grado elevato allo stesso modo come in studi precedenti, che in parte aveva usato un volume di eluizione molto più piccolo di 100 µ l, 250 µ l, o 600 µ l o 500 µ l"17 ,36, 45, 46. La sensibilità del 97,8% determinato nell'inchiesta di 179 coppie siero/DBS per anticorpi anti-HCV corrispondevano ai risultati già esistenti rapporti24, 44, 47, 48, 49, che aveva lavorato con un volume di eluizione è stata inferiore di un fattore di 5-10. "Inoltre, i protocolli per il rilevamento di anti-HCV erano stato opportunamente ottimizzati... stabilendo i propri punti di cut-off",17, 24, 48 e 49 "o aumentando i volumi di campione da 20 µ l a 100 µ l." 17, 49 infine, la specificità analitica e la sensibilità (100%) stabilito per il rilevamento di anti-HIV erano pari o superiori alle caratteristiche delle prestazioni di altri test immunodiagnostici specificamente adattati per DBS test50, 51 "o un graduale procedura con l'uso combinato di diversi test anti-HIV"17,52. "Essi, infatti, anche superato il record di prestazioni di un'analisi che erano stati appositamente sviluppato e ottimizzato per il rilevamento di anticorpi anti-HIV in eluati DBS (Q-prevenire l'HIV 1 + 2 kit di DBS)." 17, 53  

Presi insieme, il protocollo passo-passo completo presentato in questa comunicazione ha dimostrato di essere uno strumento fattibile e facile da usare per la preparazione e l'elaborazione di DBS e, quindi, utilizzabile in modo affidabile in virologia diagnostica. Permette approcci utilizzando automazione 54 e per le sue caratteristiche di prestazione eccellente ha il potenziale per servire come una sorta di fondamento-pietra per un protocollo futuro consenso generalmente accettati nel settore globale della DBS test in laboratorio medicina.

Disclosures

In passato, RSR ha ricevuto un onorario per fornire lezioni e sostegno finanziario per il suo lavoro scientifico da Abbott Diagnostics. NG e OM dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.

Acknowledgments

La presente comunicazione si basa sui risultati precedentemente pubblicati nel giornale di virologia17 in modalità di accesso aperto sotto i termini della Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) con BioMed Central come un Licenziatario. Gli autori riconoscono con gratitudine la proficua collaborazione nel quadro di pilotare lo studio "Droghe e malattie infettive croniche" ("studio DRUCK") con U. Marcus, W. Cai, Zhang W. e R. Zimmermann dall'Istituto Robert Koch-(Berlino, Germania) e sono grato a S. Moyrer per scattare le fotografie assemblati in Figura 1 , nonché per quanto riguarda D. F. Whybrew, Ph.D., (Gottinga, Germania) per la correzione del manoscritto. Esse esprimono anche il loro apprezzamento per l'assistenza tecnica sapiente di J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, r. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter e K. Seidel. Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione del Ministero tedesco della sanità per il centro di referenza nazionale per l'epatite c.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Latex rubber gloves Hartmann #4049500041515
70% isopropyl alcohol Bode Chemie #9768050
Mulifly safety cannula Sarstedt #85.1638
EDTA blood collection tube Sarstedt #02.1066.001
Adhesive bandage Hartmann #2994163
Dry gauze pad Hartmann #143213
Singel-use safety lancet Owen Mumford #3802421
Filter paper card Whatman/sigmaaldrich #10534612 Filter paper card Grade 903
Disposable pipette tips Starlab #S1126-7810, #S1120-8810
Zipper bag Flexico #20219
Mini desiccant bag Tropack #-
Disposable Punch pfmmedical #48601 6.0 mm Disposable Biopsy Punch
Disposable Forceps Servoprax #H7301
12 Well Cell Culture Plate Greiner #665180
PBS Buffer Gibco #14190-136
Tween 20 Applichem #A1389.0500
Sodium Azide Merck #66880250
Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf #30120086
ARCHITECT HBsAg (Quantitative) Abbott #6C3642
ARCHITECT anti-HBc II Abbott #8L4425
ARCHITECT anti-HBs Abbott #7C1825
ARCHITECT anti-HCV Abbott #6C3725
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo Abbott #4J2727
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit Roche #6374891001
artus HBV LC PCR Kit Qiagen #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests)
VERSANT HCV TMA Assay IVD Siemens Healthcare #2554311

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Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried Blood Spots - Preparing and Processing for Use in Immunoassays and in Molecular Techniques. J. Vis. Exp. (97), e52619, doi:10.3791/52619 (2015).

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