Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת craniotomy חד צדדי גדול מעל האזורים הזמניים הקודקודית של קליפת מוח עכבר המוחין. תכונה זו שימושית במיוחד עבור הדמיה בזמן אמת על פני שטח רחב ידיים של חצי הכדור קליפת המוח.
Abstract
את craniotomy היא הליך ביצע פקודות כדי לחשוף את המוח לניסויים in vivo. במחקר העכבר, רוב המעבדות לנצל craniotomy קטן, בדרך כלל 3 מ"מ x 3 מ"מ. פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת חלון גולגולתי משמעותית גדול 7 מ"מ x 6 מ"מ החשיפה ביותר של מוח גדול מעל הקורטקס הזמני הקודקודית העכבר (למשל, גבחת 2.5 - 4.5 מ"מ, 0 לרוחב - מ"מ 6). כדי לבצע את הניתוח הזה, הראש חייב להיות מוטה כ 30 ° ועוד הרבה של השריר הזמני חייב להיות חזר בו. בשל הכמות הגדולה של הסרת עצם, הליך זה נועד רק עבור ניסויים חריפים עם החיה הרדימה לאורך הניתוח ולהתנסות.
היתרון העיקרי של חלון גולגולתי לרוחב הגדול חדשני זו הוא לספק גישה בו זמנית בשני התחומים המדיאלי לרוחב של קליפת המוח. חלון גולגולתי חד צדדי גדול זה יכול לשמש כדי ללמוד את הדינמיקה העצבית בין התאים,כמו גם בין אזורים בקליפת מוח השונים על ידי שילוב הקלטות אלקטרו רבה-אלקטרודה, הדמיה של פעילות עצבית (למשל, הדמיה מהותית או חיצונית), וכן גירוי optogenetic. בנוסף, פתיחת גולגולת גדולה זו גם חושפת שטח גדול של כלי דם בקליפת מוח, המאפשרת מניפולציה ישירה של כלי הדם לרוחב קליפת המוח.
Introduction
את craniotomy הוא הליך סטנדרטי המשמש ידי חוקרי מוח כדי לחשוף חלק של המוח. מאז שחר אלקטרופיזיולוגיה, את craniotomy אפשרה פריצות דרך חסרת תקדים בתחום מדעי המוח. מיפוי צפוף של קליפת המוח עם אלקטרודות הוביל השערות ניסויים ותאוריות המבוססות על מפות אלה. נכנסנו לאחרונה עידן חדש שבו craniotomy הוא מנוצל עבור in vivo הדמיה של זרימת דם קליפת מוח 1, 2, 3 ו עצבים וכלי דם ארכיטקטורה 4, המאפשר ויזואליזציה בזמן אמת של פעילות קליפת המוח בתוך האזורים החשופים 5, 6, 7. למרות שמחקרים רבים להשתמש craniotomies בשילוב עם טכניקות הדמיה אופטית in vivo ללמוד את המבנה והתפקוד של נוירונים בקליפת המוח, גליה, ואת קור8 כלי הדם tical, 9, חקירות נוספות מוגבלים על ידי אזורים קטנים של קליפת המוח חשוף (אך ראה 10).
מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה ליצירת craniotomy לרוחב גדול, חושף לקורטקס קו האמצע עד עצם squamosal, והארכה מעבר גבחת ו למבדה. פתיחת גולגולת גדולה זה מאפשרת צפייה בו זמנית של הקורטקס האסוציאטיבי (retrosplenial, cingulate, הקודקודית), מנוע יסודי ותיכון, חושית, ויזואלי, ואת קליפת המוח השמיעתית. שיטה זו כבר מצמידה בעבר עם הדמיה לצבוע מתח רגיש (VSDI) לחקור כיצד מרובה אזורים בקליפת המוח לתקשר אחד עם השני במהלך פעילות קליפת מוח ספונטנית מושרה גירוי 5, 11, 12. ההיבטים המאתגרים ביותר של הליך זה כוללים הצבת הראששל החיה, מתקן את פלטת הראש, והימנעות דימום תוך הפרדה בין השרירים הזמניים מן העצם הקודקוד. טיפול צריך גם לקחת במהלך תהליכי הקידוח בגולגולת שיוסר עקומות הגולגולת בזויה אלכסוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הבאים כדלקמן מאוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים Lethbridge (ACC) הנחיות, והוא נערך בהתאם לתקנים של המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים (CCAC).
אופן ההכנה 1.
- במשך תקופות מחקר ממושכות, חיטוי כל הציוד כירורגי נפתח להבטיח סטריליות כי נשמרות לאורך כל הניתוח. אם מספר ניתוחים נדרשים, חיטוי בין ניתוחים.
- ודא שיש מספיק חיץ המוח על היד (לפחות 50 מ"ל). הפתרון מורכב כלוריד נתרן 134 מ"מ, אשלגן 5.4 מ"מ, 1 מ"מ hexahydrate מגנזיום כלוריד, 1.8 מ"מ מימית כלוריד סידן, ו 5 HEPES מ"מ נתרן, pH מאוזן כדי 7.4 עם 5 M מימן כלורי.
- מניחים את העכבר בתא אינדוקציה להרדים עם 3 - isoflurane 4%. עקוב עם 1.0 - 2.0% isoflurane לצורך תחזוקה במהלך הניתוח. לצמצם עוד יותר לרמה נמוכה של 0.4 - 0.8% במהלך הדמיהs = "Xref"> 5, 13, 14, 15, הרדמה תקינה ספקה נשמרת. רמות הנמוכות אלה של הרדמה דורשות ניטור המשמר התכוף של העכבר (על כל 5 דקות) כדי להבטיח שהוא נשאר areflexic לגירוי מכאיב.
הערה: התייבשות יכולה להיות בעייתית בשל המשטח הגבוה יחס נפח של העכבר והתגברה עקב שימוש ממושך של isoflurane.- השתמשו זריקות תת עוריות של מלוחים, 0.1 מ"ל לכל משקל גוף 10 גרם, כל 1 - h 2. כאשר hydrated כראוי, העכבר יהיה להשתין פעם 1 - 2 h.
- מעקב מקרוב אחר בעכבר כדי להבטיח הרדמה עקבית לאורך ניתוח והדמיה. אל תשאיר את העכבר השגחה ולטפל כי זה אף פעם להכרתו.
- העברת העכבר הרדים את הגדרת בעל הראש ומניחים על משטח חימום התרמו-ויסות מוגדר 37 ° C. אבטח את teet העליוןח ב בעל שיניים.
- סובב את ראשו של העכבר לכיוון השמאל כ 30 ° לחשוף את הצד לרוחב ימין של הראש ולאבטח את ראשו של העכבר עם הקצה הקהה של ברי אוזן (איור 1A).
- החל משחת עיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית.
- כדי להפחית בצקת מוחית, להזריק dexamethasone (4 מ"ג / ק"ג) לשריר.
- נגב את העור מעל אזור הניתוח עם צמר גפן טבול כלורהקסידין 4% (3 פעמים) ו 70% אתנול (3 פעמים). השתמש בכל מקלון צמר גפן רק פעם אחת.
- דון כפפות מנתחים לכסות את החיה בניילון דביק. ספקו הרדמה מקומית באמצעות הזרקת לידוקאין (8 - 10 מ"ג / ק"ג; אפינפרין 2%) תת-עורית על האתר craniotomy. חכו 3 - 5 דקות עבור התרופה להיספג לתוך הרקמה.
2. הסרת העור ו קירוב השרירים מהגולגולת
- בצע כמעט כל התהליכים האלה תוך כדי צפיית הגולגולת תחתמיקרוסקופ לנתח (למשל, 0.7 - 4.5x כוח, בהתאם למצב).
- הרם את העור 1 מ"מ שנותר קו האמצע (ממש מאחורי האוזן) עם מלקחיים ולעשות חתך אופקי קטן עם מספריים כירורגיות.
- הפוך 5 - קיצוץ רוחבי מ"מ 6 לכיוון האוזן הימנית, ולאחר מכן לחתוך לקראת הסוף המקורי של הראש.
- בנקודה החתך הראשוני, להכניס את המספריים וחותכים 10 מ"מ rostrally.
- חותכים את העור סביב האוזן הימנית ליד עין שמאל כדי לחשוף את הצד הימני של הגולגולת שרירים הזמני. ודא כי החלק הרחב ביותר של האזור החשוף הוא לפחות 7 מ"מ. חתוך את העור עוד יותר אם את אזור הניתוח צריך להיות מורחב.
- תקן את העור סביב החתך על ידי הצבת כמה טיפות של דבק cyanoacrylate בוטיל בין הגולגולת לבין העור. ודא הרקמה כבר מיובש בעבר עם אפליקטורים אוזניים או רקמות התגלגלו להגדיל את היעילות של הדבק.
- באמצעות מקלון צמר גפן, לשפשף את פני השטחשל הגולגולת בתנועה מעגלית כדי להסיר את periosteum מן הגולגולת. ודא שאף אחד נשאר על ידי ייבוש הגולגולת לחלוטין.
- בעזרת מספריים האביב מלקחיים, להפריד את השריר הזמני מן הגולגולת; לחתוך לבטל את השריר רוחבית עד להגיע עצם squamosal ( איור 1 ג ). הקפידו מאוד שלא לפגוע ברוח הזמני השטחי המתמשך לאורך רמת העצם הסקומוסלית ליד העין, אחרת עלול להתרחש דימום.
- בקרת דימום עם קצף ג'ל מראש ספוגה במאגר המוח. עבור דימום רציני להשתמש cuterizer חום. זרוק בוטיל cyanoacrylate דבק על אתרי דימום בעקבות הטיפול עם החום cuterizer. ודא את השטח מיובש מראש באמצעות כותנה היטה applicators או רקמות מגולגל כדי להגביר את היעילות של דבק.
3. קרניוטומיה
הערה: המנתח חייב להישאר חרוץ במהלך הסרת הגולגולתדורא כדי למנוע סיבוכים מיותרים. שלבים לפתרון בעיה כלולים צריכים סיבוכים להתעורר.
- סמן את המיקום של גבחת או בטוש טיפ נאה או לחתוך קלטת חתיכת משולש קטנה להצביע פינה בבית גבחת (איור 2 א) כדי לכוון את האזורים במוח הבסיסיים.
- לפני הדבקת הצלחת הראש להבטיח את הגולגולת היא יבשה לחלוטין. הגולגולת תשודר יבשה במהירות לאחר היישום של קצף ג'ל ספוג חיץ מוח, אם יותר ייבוש נדרש, להשתמש מטליות קצה כותנה. שלב זה הוא קריטי עבור קיבוע צלחת הראש (איור 1B).
הערה: אם יש שמאל הפריאוסט על הגולגולת, או אם הגולגולת אינה יבשה לפני הדבקת על צלחת הראש, זה יהיה סביר לנתק. אם זה יקר, להסיר בעדינות את צלחת הראש ולהתחיל מחדש. הדימום עלול להתרחש במהלך תהליך זה; המתין מספר דקות עד לקרישה, ולאחר מכן להסיר בעדינות. תהליך זה אינו מומלץ לחזור יותר מפעמיים. <li> החל דבק cyanoacrylate אתיל מסביב לקצה התחתון של צלחת ראש 16, ודבק הצלחת הראש מעל האזור פתיחת הגולגולת (איור 1D & איור 2A). - למלא את חלל הפתיחה בין צלחת הגולגולת והראש במלט שיניים ומשאיר רק את אזור פתיחת הגולגולת חשופה. חכו מלט שיניים להתייבש ולהתקשות, בדרך כלל 5 - 10 דק '(איור 2B).
- לאחר המלט מוגדר, בקצרה למלא את הבאר עם חיץ המוח ולאפשר להשרות במשך 3 - 5 דקות. השתמש רקמות התגלגלו להסיר חיץ מוח לפני הקידוח (איור 2C).
- מתאר את אזור הניתוח על ידי בקלילות בקיע פני השטח של הגולגולת עם מקדח שיניים. השתמש מקדח פניאומטי (מוגדר מקסימלית של 20 PSI), עם FG ¼ Burr, ונשלט עם רגלית מהירות משתנה.
- בעדינות להתחקות התרגיל לאורך הניקוד המקורי להעמיק אותו, דוארnsuring התרגיל אינו חודר דרך הגולגולת לתוך המוח (איור 2 ד). מתחלף מדי כמה דקות בין הקידוח טובל את פני גולגולת עם רקמות התגלגלו טבולות. זה יקטין חימום וייבוש של הגולגולת מן החיכוך המכני וחשיפה ממושכת.
הערה: הגולגולת תשודר יבשה במהירות לאחר היישום של קצף ג'ל הרטוב. אם יותר ייבוש נדרש, להשתמש מטליות קצה כותנה.
זהירות: הגולגולת אינה אחידה בעובי. לדוגמא, הרכס זמני-הקודקודית הוא האזור העבה, בעוד אזורי גולגולת ליד קו האמצע ציוני squamosal הם דקים יחסית. - במהלך הקידוח, מעת לעת לבדוק קריסה של הגולגולת על ידי לחיצה עדינה על זה עם מלקחיים או המקדח שאינו זז. כאשר העצם מתחיל לקרוס, להפסיק קידוח לטבול את החלון כולו במאגר המוח.
הערה: אם דם פורץ מתוך שטח, זה יכול לרמז על כך ההדור נפגם. אם זה המקרה, להציב SEMi-רטוב ג'ל קצף על פני השטח ולנסות לספוג את הדם תוך הפעלת לחץ בעדינות אל קצף ג'ל עם ספוגית קצה כותנה. - חכה לפחות 5 דקות לפני הסרת גולגולת כדי לרכך את העצם כדי להקטין את הסיכוי של הדורה הדבקה העצם, מה שהופך את תהליך הסרת הגולגולת קלה.
- בצע את תהליך גולגולת ההסרה תוך הגולגולת היא שקועה חיץ מוח.
הערה: אם חלק הגולגולת נשאר מחובר בעקשנות, להב סכין מנתחים # 11 יכול לשמש להבקיע הגולגולת בעדינות. תשמור קיצוני שלא לנקב את הלהב דרך הגולגולת לתוך המוח. - החל מהקצה הקדמי, לחטט הגולגולת הרופפת בעדינות מן הדורה באמצעות מלקחיים.
הערה: אם כמות קטנה של דימום במהלך תהליך הסרת הגולגולת, להסיר את החיץ עם העברת פיפטה או מזרק, ולאחר מכן להחליף עם חיץ חדש. - ברגע העצם הוא רופף "צף" על הדורה, אחיזה בחוזקה העצם עם מלקחיים להרים את העצם מןהדורה. ודא העצם לא חודר לתוך המוח.
- כדי לשלוט דימום, לגלגל את הפינה של רקמה לתוך צבע ולהסיר ביותר של החיץ מהבאר גולגולתי. הפעלה מהירה של קצף ג'ל, ספוגות מראש במאגר, לאזור דימום תוך הוספת לחץ קל מאוד עם ספוגית קצה כותנה.
הערה: דימום בדרך כלל מגיע מקצה העצם או על פני השטח של דורה; בשני המקרים הם נורמלים דימום יפסיק מהר אם אין כלי דם גדולים ניזוקים. אם הדימום ממשיך, דם עשוי למלא את כל החלון, ויצר גיליון קריש מעל אזור ההדמיה.- כדי להסיר את הגיליון קריש, בזהירות להרים חתיכות של דם קרוש מאזור הדמיה תוך השארת קריש דם שלם סביב מקור כלי דם מקרע. תשמור על עצמך כדי לא להסיר את קריש הדם ממקור bleed מאחר והדבר עלול לגרום אפילו יותר אובדן דם. להשקות את פני השטח של המוח עם חיץ מוח כדי לשטוף את כל דם.
- תשמור על עצמך כדי להימנע מלגעתרקמת המוח העדינה או הוספת חומר זר למוח; לחזור עד הדימום פסק, עבור כ 2 - 5 דק '(איור 2E).
הערה: בשלב זה, את craniotomy מוכנה להכנת החלון גולגולתי (ראה שלב 5). במידת הצורך, להסיר את הדורה לפני השתלת החלון גולגולתי (ראה שלב 4).
הסרת 4. דורא
הערה: הסרת דורא מחייבת זהירות רבה, ועלולה להשתלט 15 דקות.
- תיקו חוץ חיץ עודף מן פתיחת הגולגולת. בעוד ששמירה על משטח לח, לתפוס פיסה קטנה של דורה עם מלקחיים בעדינות לקרוע הדורה.
- שימוש במלקחיים ואביב מספרי לקרוע בעדינות וחתך את הדורה.
- זרוק חיץ מוח יותר על פני שטח המוח לצוף הדורה ולעזור זה להפריד מהמוח. המשך עד שכל הדורה הוסרה מאתר החלון גולגולתי. כאשר ביצעו כראוי את המוח יופיע להיות מאוד נקי עם BL מובחנתכלי אוד לא פגמים (להשוות 2E איור עם 2F).
זהירות: יש אזורים של הדורה צורף arterioles הקטן על פני השטח של המוח (למשל, ליד הפרוקסימלי קו האמצע לאזור העמותה הקודקודית), והסרה כזה יכול לקרוע את עוֹרְקִיק. במקרים כאלה, זה יכול להיות טוב יותר כדי להשאיר חתיכה קטנה של דורה שלמה מעל גב עוֹרְקִיק. VSD לא יכול לחדור כי שטח קטן, אבל זה העדיף שיש דימום מג'ורי. - תקן את משטח המוח agarose בהקדם האפשרי כדי למזער את התנועה מן הפעימה ולמנוע נפיחות נוספת (ראה שלב 5).
5. הכנת גולגולתי חלון
- תרסיס הזכוכית המכסה עם אתנול 70% ולהשתמש מיכל אוויר יבש בעדינות. ודא הזכוכית נקיה לחלוטין ללא כתמים או בהווה אבק.
- הכן agarose 1.3% על ידי חימום 200 מ"ג של אבקת agarose מומס 15 מ"ל של חיץ המוח. הגדר את למיקרוגליםותעיף לגבוה וחום במשך 10 - 15 שניות בכל פעם, תוך בחישה בעדינות בין, עד שכל אגר מומס.
הערה: ודא שאין בועות או חלקיקים נוכחות, כמו אלה יפריעו הדמיה. - מניח מד חום על agarose החם לקרר את agarose עד קצת מעל לחיזוק טמפרטורה (~ 40 ° C).
שים לב: הפעלת מים קרים על הצד החיצוני של מיכל agarose עלול להאיץ את תהליך הקירור. בעדינות ומערבבים ברציפות כדי להבטיח שאין בועות או חלקיקים נוכחים. - מיד לפני החלת אגר, להסיר את החיץ המוח מהבאר גולגולתי. צייר את agarose עם טפטפת העברה ושחררת את agarose ישירות על המוח. למקם את התלוש לכסות במהירות מעל פני השטח ולהדק את התלוש לכסות עם agarose טיפות על הפינות.
6. המתת חסד
הערה: מניסיוננו, הליך זה לוקח מנתחים מנוסים לפחות 3 - 4 ניתוחים בפועל כדי להשיג יותר מ 90%שיעור הצלחה. פחות מנתחים מנוסים עשויים לדרוש אפילו יותר בפועל. במהלך פתיחת הגולגולת או durotomy, המוח עלול להיגרם נזק, כגון אם אגרופים תרגיל דרך העצם לתוך המוח. כמה נזק מינורי בקצה פתיחת הגולגולת עשויה להיות מותרת. עם זאת, אם המוח אינו נראה "נקי" עם כלי דם ניזוק אדומים בוהקים ואת קליפת לבן, הניסוי ייתכן שיהיה הצורך הסתיים. דוגמאות של הכנות עניות כוללות אלה עם כלי דם מתים, או כאשר קליפת המוח מסומן עם כלי דם קרועים או פגומים. אם כל הסימנים הללו קיימים, הניסוי יניב סביר נתונים באיכות גבוהות. בין אם הניתוח / הניסוי היה מוצלח או לא, להרדים את העכבר בצורה הומאנית על השלמת הניסוי.
- עמוק להרדים עם isoflurane 3.5% לפחות. ואז, לתת זריקה intraperitoneal של pentobarbital נתרן ב 300 מ"ג / ק"ג. באופן אידיאלי, אם המחט מוחדרת לתוך הכבד, מוות יהיה מאוד מהירות (<1 דקות).
- אם זלוף נדרש, לוודא כי החיה היא בהרדמה עמוקה לפני שתמשיך (ראה שלב 1.3).
- לחלופין, אם זלוף אינו נדרש, לחכות מינימום של 5 דקות ולאחר מכן לוודא כי העכבר הוא מת. אשר בהיעדר הנשימה, דפיקות לב, כמו גם חוסר נסיגת כאב ורפלקסים קרני. כמו כן, להתבונן לצביעת כחול / לבן חיוור של גפיים מחשיכים של כלי דם על פני קליפת המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי ללמוד את יחסי הגומלין בין אזורים בקליפת המוח בתוך חצי כדור יחיד, השתמשנו פתיחת גולגולת גדולה המשתרעת על פני סינוס sagittal ו 5 - לרוחב 6 מ"מ. חלון גולגולתי זו כללה העיקרי (מנוע, החושית, חזותי, שמיעתי), משנית (מנוע, ויזואלי), והתאגדות (retrosplenial, cingulate, העמותה הקודקודית) הקורטקס של ההמיספרות של המוח הימני (איור 3A). עבור עבודה זו השתמשנו צבע רגיש מתח (VSD) הדמיה, אשר משקפת שינויים בקרום 3 הפוטנציאל. פרוטוקול זה גם יהיה שימושי עבור חיצוניים אחרים (למשל, 17 סידן הדמיה גלוטמט 18) או ניסויי הדמיה מהותיים. כאשר גירוי hindlimb, forelimb, שפם, חזותי, או מערכת השמיעה של עכברים הרדים בקלילות באמצעות 0.5% isoflurane, צפינו דפוסי הסכמה של שלילת קוטביות קליפת המוח (> איור 3B). בקנה אחד עם מחקרים קודמים 5, 19, 20, 21, 22, מצאנו כי גירוי מישוש קצר של קליפת מוח לחבית C2 הוביל הפעלה של אזורים חושיים עיקריים, כמו גם "אי" של תגובות בתוך אזורים הקשורים מבחינה תפקודית. לדוגמא, הקורטקס המוטורי הראשוני (M1) או ייצוג משני של קליפה החושית (S2; איור 3Bi). יחיד 1 ms הטון PIP (25 kHz) גירוי הוביל את ההפעלה של קליפת המוח השמיעתית העיקרי (A1) כ 20 מילישניות לאחר הגירוי השמיעתי (איור 3Bii). במהלך האלפיות הקרובים, שלילת הקוטביויות המפוזרים על פני קליפת המוח השמיעתית והעבירו קליפה חושית משנית שכנות. כ 25 מילישניות לאחר תחילת טון, שלילת קוטביות קליפת מוח משנית תגיח, הממוקם 1.07; 0.2 המדיאלי מ"מ ו 1.9 ± 0.1 מ"מ ביחס אחורי גבחת (n = 9 עכברים). זהו בערך את המיקום של אזור העמותה הקודקודית (PTA). אות VSD אז מופצת לאזור קו האמצע שבו אזורי עמותת קליפת המוח אחרים ממוקמים כולל retrosplenial (RS) ו פיתול חגורה (CG). לכן, גירוי שמיעתי הוביל את ההפעלה של שני אזורים נפרדים מוקד, שממנו גלי נסיעה של התפשטות שלילת קוטביות VSD שטח נרחב יותר בתוך קליפת קו אמצע. גירוי מרחק של העין הנגדית עם ירוק 1 ms LED דופק, הוביל הפעלה של קליפת הראייה העיקרית בתוך 40 מילישניות (איור 3Bv). הפעלה ראשונית זו של קליפת המוח החזותית אחריו: (1) הרחבת מרחבית של שלילת קוטביות VSD לתחומי שכנות הממוקם מדיאלית, רוחבי, ו קדמי לאזור המופעל הראשוני; (2) שלילת קוטביות של אזור קליפת המוח המדיאלי השני כ 50 מילישניות לאחר הגירוי (n = 8 ניסויים) ממוקם לאורך sa תפר gittal. זה היה דומה לגירוי סנסורי של forelimb ( איור 3Biii ), hindlimb ( איור 3Biv ), שפם C2, או אודישן. התגובות VSDI עורר מן הגירוי החושי של forelimb, hindlimb או אודישן הפעילו בתחילה את הקורטקס הסנסורי הראשי בהתאמה, ואחריו התפשטות פעילות anisotropic, כמו גם הפעלת קו האמצע של קליפת המוח סביב 20 - 40 אלפיות השנייה לאחר גירוי. תוצאה זו היתה דומה לתגובות של גירוי חזותי ושפם. התפשטות הפעילות החושית לאורך נתיבי קו האמצע וההפעלה התדירה של אותם אזורים על ידי פעילות ספונטנית 6 עשויים להצביע על כך שאזורים אלה הם המרכז המרכזי של ליבת החיבור של קליפת המוח, שבה המידע החושי עשוי להשתלב בפעילות ספונטנית של קליפת המוח.
2fig1.jpg"/>
איור 1. התקנה ולאחר הכנת כירורגים. (א) ראש העכבר מגולח, נקי, מסובב כ 30 ° לחשיפה לרוחב, ומאובטח עם הקצה הקהה של ברי אוזן. הרדמת Isoflurane מועברת באמצעות פיסת אף בעל שיניים. העכבר הוא מכוסה בניילון נצמד דביק על סטריליות וחמימות מוגברות. (ב) עור תקריב מראה ו הפריאוסט יוסר צלחת הגולגולת הקודקודית, השריר הזמני לא נגע. (ג) השריר הזמני הוסר שחשף את המשטח הזמני ועצם squamosal, לציין את הווריד השטחי לא ניזוק. (ד) טרם קיבועו, צלחת הראש ממוקמת לתוך המיקום הנכון עם שעווה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
n-page = "1"> 
איור 2. צעד אחר צעד הליך כירורגי. (א) צלחת הראש מחוברת הגולגולת עם דבק cyanoacrylate אתיל במיקומים הקדמי וגם האחורי. שים לב למיקום של גבחת (חתיכת שחור של קלטת משולשת). (ב) החלון גולגולתי הוא הוכן על ידי החלת מלט שיניים התעבה בין הצלחת-ראש הגולגולת. שים לב גבחת וציוני הדרך squamosal נשארים גלויים. (ג) בעקבות ייבוש של מלט, חיץ המוח מתווסף לרכך את הגולגולת כדי למנוע הדבקה של הדורה. רקמה התגלגלה תעזור הסרת מוח חיץ לפני הקידוח. (ד) הקצוות של פתיחת הגולגולת כבר הבקיע. הערה בכלי הדם נתפס יותר בקלות דרך העצם הדליל ליד קצות מלט שיניים. (ה) צלחות הקודקודית גולגולת זמנית כבר removאד ההדור גלוי. הערה פגמים של דם על הדורה מן דימום מינורי, וזה נורמלי. בחינה קפדנית תחת 2 - גדלת 4X תחשוף שתי שכבות של כלי דם, אחד הדורה והשנייה פיא. (F) דורת מוסר חושף קליפה וטהורה. כלי דם pial הוא אדום בהיר ללא פגמים נוכחיים. הערת החתיכות התועות של דורה בצבע לבנה בקצוות של החלון גולגולתי. בדוגמה זו, חלה bleed dural קטין על החלק האחורי של החלון גולגולתי, אשר נקרש מהר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. דפוסים ייחודיים וכן הפעלת הקונצנזוס במהלך צורות שונות של חושי גירוי. < / strong> (א) סכמטי של פתיחת הגולגולת חד צדדית המציגה את אזורים בקליפת המוח הדמיה. (ב) Photomicrograph של פתיחת הגולגולת חד צדדית רחב עם גבחת יצוין באמצעות עיגול לבן בכל תמונה. דפוסי ההפעלה קליפת המוח מוצגים עכבר הרדים עם isoflurane (0.5%) לאחר (i) גירוי (סטים) של זיף C2 הנגדי, (ii) גירוי שמיעתי, (iii) גירוי forelimb הנגדי, (iv) גירוי hindlimb הנגדי ו (נ) גירוי חזותי של העין הנגדית עם (LED) אור דיודה. היה הפעלת קו האמצע לאחר כל הצורות של גירוי חושי (חצים לבנים) בשעה 10 - 25 מילישניות לאחר הפעלת בקליפה המוטורית הראשונית. התגובות הן הממוצעות של 20 ניסויים. התמונה השנייה משמאל בשורה השנייה (ii) מציין את הקדמי (א), אחורי (P), המדיאלי (M) ו לרוחב (L) הכיוונים. Modified באישור מהאג'ראני, et al., 2013."Target = 'p_upload / 52,642 / 52642fig3large.jpg _ blank'> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול חדשני זה עבור חלון גולגולת גדול מאפשר הדמיה סימולטני על השטחים הזמניים הקודקודית של קליפת המוח. בשילוב עם הדמיה אופטית, זה יכול לעזור כדי לחשוף דינמיקה עצבית בתוך אזורים בקליפת מוח במהלך פעילות ספונטנית מושרה גירוי. פתיחת הגולגולת מרחיבה זו גם חושפת הרחבה גדולה של רשת כלי הדם בקליפת המוח, כולל סוף הפרוקסימלי של עורק המוח האמצעי (MCA), מה שמאפשר in vivo הדמיה של זרימת דם מניפולציה ישירה של כלי לרוחב עבור דגמים איסכמי. טכניקה זו תהיה תועלת רבה עבור קווים שפותחו לאחרונה בעכברי המבטאים חלבוני מתח מחוון סידן 23. עכברים אלה מציעים יתרון המעשי תוך עקיפת הצורך דוגר צבעי מתח רגישים על קליפת המוח. צבעים חיצוניים אלה לוקחים זמן לחדור לרקמת המוח כראוי (~ 60 - 90 דקות) ו מוגבלים על ידי הרעילויות המתונות שלהם. יש craniotomies הגדול גםנוצל בעבר כדי ללמוד את מוח העכברוש מתפתח עם VSDI 11. יש חולדות יילוד ראש גדול בהרבה והוא דומה בגודלו עם עכברים בוגרים. פעולה זו פותחת פתח לחוקרי הזדמנות ייחודית ללמוד בעיות התפתחותיות במדעי המוח, אם כי לא עם עכברים מהונדסים.
המגבלות העיקריות של שיטה זו הן החוסר לניסויים כרוניים. העקמומיות של הגולגולת הופכת את תהליך הקידוח יותר מאתגר זמן רב יותר מאשר craniotomies הקטן. עבור פתיחת גולגולת גדולה זו, הוא חיוני, כדי למקם את הראש עם הציונים דרך התפר ו squamosal המרכזיים להיות מקביל למישור המיקוד של העדשה. בעוד כמה עיוות של המוח צפוי מן העקמומיות של המוח, אלה הם להתגבר על ידי התמקדות לתוך בשכבות השטחיות של קליפת המוח. בעיה זו מקלה עוד יותר על ידי קבלת חזרות רבות של גירוי והעמיד ממוצע. לסיכום, טכניקת פתיחת הגולגולת הגדולה שלנו היא נרחב אפליקציהlicable לחקר בעיות הנוכחיות בנוירוביולוגיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) דיסקברי גרנט # 40,352, קמפוס אלברטה עבור חדשנות תוכנית יו"ר, אלברטה אלצהיימר מחקר תוכנית כדי MHM, ו NSERC ליצור BIF דוקטורט ואחווה לתואר AIHS לח"כ. אנו מודים פו מין וואנג לפיתוח פרוטוקול זה ועבור הכשרה כירורגית, ו Behroo מירזה אגא Di שאו לגידול.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
