Summary
Detta protokoll presenterar en metod för att skapa en stor ensidig kraniotomi under de temporala och parietala områdena av mus-cerebral cortex. Detta är särskilt användbart för realtidsavbildning över ett expansivt område med en kortikal halvklotet.
Abstract
Kraniotomi är ett vanligt utfört förfarande för att exponera hjärnan för in vivo-experiment. I mus forskning, de flesta laboratorium utnyttjar en liten kraniotomi, typiskt 3 mm x 3 mm. Detta protokoll introducerar en metod för att skapa en väsentligen större 7 mm x 6 mm kraniala fönster exponerar det mesta av en cerebrala hemisfären över mus temporala och parietala cortex (t.ex. bregma under 2,5 - 4,5 mm, lateralt till 0 - 6 mm). Att utföra denna operation, måste huvudet lutas cirka 30 ° och mycket av den temporala muskeln måste dras tillbaka. Grund av den stora mängden av avlägsnande ben, är detta förfarande endast avsett för akuta experiment med djuret bedövades under hela operationen och experiment.
Den största fördelen med denna innovativa stora laterala kraniell fönster är att ge samtidig tillgång till både mediala och laterala delar av hjärnbarken. Denna stora ensidiga kraniell fönster kan användas för att studera neurala dynamiken mellan celler,såväl som mellan olika kortikala områden genom att kombinera flerelektrodelektrofysiologiska inspelningar, avbildning av neuronal aktivitet (t.ex. inre eller yttre avbildning), och optogenetic stimulering. Dessutom denna stora kraniotomi utsätter också ett stort område av kortikala blodkärl, vilket möjliggör direkt manipulation av den laterala kortikala kärl.
Introduction
Kraniotomi är en standardprocedur som används av neuroforskare för att avslöja en del av hjärnan. Sedan början av elektro har kraniotomi tillåts utan motstycke genombrott inom neurovetenskap. Tät kartläggning av hjärnbarken med elektroder har lett till försök att testa hypoteser och teorier baserade på dessa kartor. Vi har nyligen gått in i en ny era där kraniotomi är utnyttjas för in vivo avbildning av kortikalt blodflöde 1, 2, 3 och neurovaskulära arkitektur 4, som möjliggör realtidsvisualisering av kortikalt aktivitet inom de exponerade områdena 5, 6, 7. Även om många studier använder craniotomies kombinerat med in vivo optiska avbildningstekniker för att studera strukturen och funktionen av kortikala neuroner, glia, och cortiska vaskulatur 8, 9, är ytterligare undersökningar begränsas av små områden av exponerat cortex (men se 10).
Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla en metod för att skapa en stor lateral kraniotomi, utsätta hjärnbarken från mittlinjen till squamosal benet, och som sträcker sig bortom bregma och lambda. Denna stora kraniotomi möjliggör samtidig visning av associations cortex (retrosplenial, cingulate, och parietal), primär och sekundär motor, somatosensoriska, visuell och hörselbarken. Denna metod har tidigare tillsammans med spänningskänsligt färgämne imaging (VSDI) för att undersöka hur flera kortikala områden interagerar med varandra under spontan och stimulus-inducerad kortikal aktivitet 5, 11, 12. De mest utmanande aspekterna av detta förfarande inkluderar att placera huvudethos djuret, fixering av huvudplattan, och att undvika blödning medan separera den temporala muskeln från parietala benet. Försiktighet måste också tas under borrning och skallen borttagningsprocesser som skallen kurvor vid en sned vinkel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll följer University of Lethbridge Djurvård kommittén (ACC) riktlinjer och genomförs i enlighet med normerna i den kanadensiska rådet om Animal Care (CCAC).
1. Framställning
- Under långa studieperioder, autoklav alla öppnade kirurgiska förnödenheter och se till att sterilitet upprätthålls under hela operationen. Om flera operationer krävs autoklav mellan operationer.
- Se till att det finns gott om hjärnan buffert på hand (minst 50 ml). Lösningen består av 134 mM natriumklorid, 5,4 mM kalium, 1 mM magnesiumklorid-hexahydrat, 1,8 mM kalciumklorid-dihydrat, och 5 mM HEPES natrium, pH balanserad till 7,4 med 5 M väteklorid.
- Placera musen i en induktionskammare och söva med 3-4% isofluran. Följa med 1,0 - 2,0% isofluran för underhåll under operationen. Ytterligare minska till så lågt som 0,4 - 0,8% under avbildnings = "xref"> 5, 13, 14, 15, förutsatt korrekt anestesi upprätthålls. Dessa låga nivåer av anestesi kräver vaksamma och regelbunden kontroll av musen (om varje 5 min) för att säkerställa att det förblir areflexic till smärtsamma stimuli.
OBS: Uttorkning kan bli problematisk på grund av den höga förhållande yta: volym av musen och förvärras av långvarig användning av isofluran.- Använda subkutana injektioner av saltlösning, 0,1 ml per 10 g kroppsvikt, varje 1 - 2 h. När väl hydrerad kommer musen urinera en gång varje 1-2 h.
- Noga övervaka musen för att säkerställa konsekventa anestesi under kirurgi och bildhantering. Lämna inte musen utan uppsikt och se till att det aldrig återfår medvetandet.
- Överföra sövda musen till den huvudhållaren set-up och placera på en termoreglerande värmedyna inställd på 37 ° C. Säkra de övre teetH i en tänderhållare.
- Vrid muskets huvud mot vänster ca 30 ° för att exponera höger sida av huvudet och säkra musens huvud med den ojämna änden av öronstängerna ( Figur 1A ).
- Applicera oftalmisk salva för att förhindra kornealtorkning.
- För att minska hjärnödem, injicera dexametason (4 mg / kg) intramuskulärt.
- Torka huden över det kirurgiska området med bomullsvattor doppade i 4% klorhexidin (3 gånger) och 70% etanol (3 gånger). Använd bara en bomullspinne en gång.
- Don kirurgiska handskar och täck djuret med plastplast. Ge lokalbedövning genom att injicera lidokain (8 - 10 mg / kg, 2% epinefrin) subkutant över kraniotomi-stället. Vänta 3 - 5 min för att läkemedlet ska absorberas i vävnaden.
2. Ta bort huden och dra muskeln tillbaka från skallen
- Utför nästan alla dessa procedurer medan du tittar på skalle under adissekera mikroskop (t ex 0,7 - 4.5X effekt, beroende på omständigheterna).
- Lyft upp huden 1 mm till vänster om mittlinjen (precis bakom örat) med pincett och gör ett litet horisontellt snitt med kirurgiska saxar.
- Göra en 5-6 mm lateralt snitt i riktning mot det högra örat, och skars sedan mot den rostrala änden av huvudet.
- Vid den initiala snittet punkten, sätt saxen och skär 10 mm rostrally.
- Skär huden runt höger öra och nära det högra ögat för att exponera den högra sidan av skallen och tids muskler. Säkerställa att den bredaste delen av det exponerade området är minst 7 mm. Trimma huden ytterligare om operationsområdet måste utökas.
- Fixa huden runt snittet genom att sätta några droppar butylcyanoakrylat lim mellan skallen och huden. Säkerställa vävnaden tidigare torkats med bomulls tippas applikatorer eller valsade vävnader för att öka effekten av bindemedlet.
- Med hjälp av en bomullspinne, gnugga ytanav skallen i en cirkelrörelse för att ta bort benhinnan från skallen. Säkerställa att ingen förblir genom torkning skallen helt.
- Med användning av fjäder sax och pincett, separera den temporala muskeln från skallen; skära och dra tillbaka muskeln lateralt tills de når squamosal ben (Figur 1C). Var mycket noga med att inte skada ytliga temporala ven som löper längs nivån på squamosal benet nära ögat, annars blödningen kan uppstå.
- Kontroll blödning med gel skum förväg indränkt i hjärnan buffert. För allvarliga blödningar använda en värme cauterizer. Släppa butylcyanoakrylat lim på de blödande områden efter behandling med värme cauterizer. Säkerställa området torkas i förväg genom att använda bomulls tippas applikatorer eller valsade vävnader för att öka effekten av bindemedlet.
3. Kraniotomi
OBS: Kirurgen måste förbli flitig under avlägsnande av skallen ochdura för att undvika onödiga komplikationer. Felsökningssteg ingår bör komplikationer uppstår.
- Markera platsen för bregma antingen med en fin spets markör eller skär ett litet triangulärt stycke tejp och led a hörnet vid bregma (figur 2A) för att orientera de underliggande hjärnregioner.
- Före fastsättning av huvudplattan säkerställa skallen är helt torr. Skallen kommer snabbt lufttorka efter applicering av gelén skum indränkt i hjärnan buffert, om det behövs mer torkning, använda bomullsspetspinnar. Detta steg är avgörande för huvudplatta fixering (Figur 1B).
OBS: Om det finns benhinnan vänster på skallen, eller om skallen är inte torr innan limning på huvudplattan, kommer det sannolikt lossnar. Om detta händer, försiktigt bort huvudplattan och börja om. Blödningar kan förekomma under denna process; Det tar några minuter för den att koagulera och sedan försiktigt bort. Denna process rekommenderas inte att upprepas mer än två gånger. <li> Applicera etylcyanoakrylat lim runt den nedre kanten av huvudplattan 16, och limma huvudplattan över kraniotomi område (Figur 1D & Figur 2A). - Fylla öppningen utrymmet mellan skallen och huvudplattan med dentalcement lämnar endast kraniotomi området exponeras. Vänta på dentala cement för att torka och härda, typiskt 5 - 10 min (Figur 2B).
- När cementen sätts kortfattat fylla brunnen med hjärnan buffert och låt dra i 3-5 minuter. Använda en rullad vävnad för att avlägsna hjärnbuffert före borrning (figur 2C).
- Disposition operationsområdet genom att lätt poäng ytan av skallen med en tandläkarborr. Använda en pneumatisk borr (inställd på maximalt 20 PSI), med en FG ¼ Burr, och regleras med en variabel hastighet fotpedal.
- spåra försiktigt borra längs den ursprungliga poäng att fördjupa det, ensuring borren tränger inte genom skallen in i hjärnan (figur 2D). Turas några minuters mellanrum mellan borrning och badda skallen ytan med fuktade rullade vävnader. Detta kommer att minska uppvärmning och torkning av skallen från mekanisk friktion och långvarig exponering.
OBS: skallen kommer snabbt lufttorka efter applicering av den våta gelén skum. Om det behövs mer torkning, använda bomull spets pinnar.
Varning: Skallen är ojämn i tjocklek. Till exempel är det parietalceller-temporala ås den tjockaste området, medan skallen regioner nära mittlinjen och squamosal landmärken är relativt tunn. - Under borrning med jämna mellanrum kontrollera om knäck av skallen genom att försiktigt trycka på det med pincett eller icke-rörliga borr. När benet börjar spänne, stoppa borrning och sänk hela fönstret i hjärnan buffert.
OBS: Om blodet rusar ut ur ett område, kan det föreslå att dura har skadats. Om så är fallet, placera en semi-våt gel skum över området och försök att dra upp blod under försiktig applicering av tryck på gelén skum med en bomullsspets pinne. - Vänta minst 5 minuter innan skallen avlägsnande för att mjuka upp benet och för att minska risken av dura att klibba till benet, vilket gör skallen borttagningsprocessen enklare.
- Utföra skallen borttagningsprocessen medan skallen är nedsänkt i hjärnan buffert.
OBS: Om en del av skallen förblir envist fäst, kan en # 11 skalpell blad användas för att försiktigt poäng skallen. Var mycket noga med att inte punktera bladet genom skallen och in i hjärnan. - Med början från den främre kanten, försiktigt bända loss skallen från dura med pincett.
OBS: Om en liten mängd blödning sker under skallen borttagningen bort bufferten med en överföringspipett eller spruta, och sedan ersätta med ny buffert. - När benet är lös och "flytande" på dura, fast grepp benet med pincett och lyft ben fråndura. Se till att benet tränger aldrig in i hjärnan.
- Att kontrollera blödning, rulla i hörnet av en vävnad i en punkt och avlägsna det mesta av buffert från den kraniala brunn. Snabbt tillämpa gel skum, förblötta i buffert, till det blödande området under tillsats mycket lätt tryck med en bomullsspets pinne.
OBS: blödning kommer vanligtvis från kanten av benet eller ytan av dura; båda fallen är normala och blödning kommer snabbt stoppas om några större blodkärl är skadade. Om blödningen fortsätter, kan blod fyller hela fönstret och bildar ett koagel blad över avbildningsområdet.- Att avlägsna proppen arket, försiktigt plocka upp bitar av levrat blod från avbildningsområdet medan den lämnar blodpropp intakt runt källan av den brustna blodkärl. Var noga med att inte ta bort blodpropp från avtappningskällan eftersom detta kan orsaka ännu mer blodförlust. Spola ytan av hjärnan med hjärnbuffert för att tvätta bort något blod.
- Var noga med att undvika att röra viddelikat hjärnvävnad eller lägga främmande material till hjärnan; upprepa tills blödningen har upphört, för ca 2 - 5 min (figur 2E).
OBS: Vid denna punkt, är redo för att förbereda hjärn fönstret kraniotomi (se steg 5). Vid behov, ta bort dura innan implantera hjärn fönstret (se steg 4).
4. Dura Avlägsnande
OBS: Dura borttagning kräver extrem försiktighet och kan ta över 15 min.
- Dra bort överskottsbuffert från kraniotomi. Under upprätthållande av en fuktig yta, ta en liten bit av dura med pincett och försiktigt riva dura.
- Använd pincett och sax våren för att försiktigt riva och skära bort dura.
- Drop mer hjärna buffert på hjärnans yta att flyta dura och hjälpa den separat från hjärnan. Fortsätt tills all dura tas bort från hjärnfönsterplatsen. När utförs korrekt hjärnan ser ut att vara mycket ren med tydlig blood fartyg och inga fläckar (jämför figur 2E med 2F).
Försiktighet: Vissa områden av dura är bundna till små arterioler på ytan av hjärnan (t.ex., nära mittlinjen proximalt till parietala föreningsområdet), och avlägsnande av sådant kan spräcka arteriolen. I sådana fall kan det vara bättre att lämna en liten bit av dura intakt över toppen av arteriole. Frekvensomriktaren får inte tränga det litet område, men det är att föredra att ha större blödning. - Fixera hjärnans yta i agaros så snart som möjligt för att minimera rörelse från pulsering och för att förhindra ytterligare svullnad (se steg 5).
5. Förberedelse Kraniell fönster
- Spraya täckglaset med 70% etanol och använda en luftbehållare för att försiktigt torka. Se till att glaset är helt ren utan fläckar eller damm förekommer.
- Förbereda 1,3% agaros genom upphettning 200 mg av agaros pulver löst i 15 ml hjärna-buffert. Ställ in microave till hög och värme i 10 - 15 s vid en tidpunkt, försiktigt omrörning i mellan, tills all agar är upplöst.
Notera: Se till att inga bubblor eller partiklar är närvarande, eftersom dessa kommer att interferera med avbildning. - Placera en termometer i den varma agaros och kyla agarosen ner till precis ovanför stelningstemperaturen (~ 40 ° C).
OBS: Rinnande kallt vatten över utsidan av agarosen behållaren kan påskynda kylprocessen. rör om försiktigt kontinuerligt för att garantera att inga bubblor eller partiklar är närvarande. - Omedelbart före applicering av agar, ta bort hjärnan buffert från hjärn brunn. Upprätta agarosen med en pipett och släppa agarosen direkt på hjärnan. Snabbt placera locket glida över ytan och fäst locket glida med agaros droppar i hörnen.
6. Eutanasi
OBS: Enligt vår erfarenhet tar denna procedur erfarna kirurger minst 3-4 praxis operationer för att uppnå mer än 90%framgång. Mindre erfarna kirurger kan kräva ännu mer praktik. Under kraniotomi eller durotomy kan hjärnan skadas, till exempel om borr slag genom benet in i hjärnan. Några mindre skador vid kanten av kraniotomi kan vara tillåtet. Om hjärnan inte ser "ren" med röda oskadade blodkärl och vit cortex, kan försöket måste avslutas. Exempel på dåliga förberedelser inkluderar de med döda blodkärl, eller när cortex är märkt med trasiga eller skadade blodkärl. Om något av dessa tecken är närvarande, kommer experimentet osannolikt ge data av hög kvalitet. Huruvida operationen / experiment lyckades eller inte, humant euthanize musen vid slutförandet av experimentet.
- Djupt söva med minst 3,5% isofluran. Sedan, ge en intraperitoneal injektion av natriumpentobarbital vid 300 mg / kg. Helst om nålen är införd i levern, kommer döden vara mycket snabb (<1 min).
- Om perfusion krävs kontrollera att djuret är djupt sövd innan du fortsätter (se steg 1,3).
- Alternativt, om perfusion inte krävs, vänta i minst 5 minuter och sedan kontrollera att musen är död. Bekräfta avsaknad av andning, hjärtslag, liksom en brist på smärttillbakadragande och hornhinnan reflexer. Också observera för blek blå / vit färgning av extremiteter och mörknande av blodkärlen över cortex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Att studera interaktioner mellan kortikala områden inom en enda halvklotet, använde vi en stor kraniotomi sträcker sig tvärs över sinus sagittalis och 5 - 6 mm lateral. Denna kraniell fönster ingår primära (motor, somatosensoriska, visuell, auditiv), sekundär (motor, visuell), och förenings (retrosplenial, cingulate, parietal association) cortex av högra hjärnhalvorna (Figur 3A). För detta arbete har vi använt spänningskänsligt färgämne (VSD) avbildning, som avspeglar variationer i membranpotentialen 3. Detta protokoll skulle också vara användbara för andra yttre (t.ex. kalcium 17 och glutamat 18 imaging) eller inneboende avbildning experiment. När stimulering av bakben, forelimb, whiskers, visuell, eller hörselsystem av lätt bedövade möss genom användning av 0,5% isofluran, observerade vi konsensusmönster kortikal depolarisering (> Figur 3B). Överensstämmer med tidigare studier 5, 19, 20, 21, 22, fann vi att korthet taktil stimulering av C2 fat cortex ledde till aktivering av primära somatosensoriska områden, såväl som "öar" av svar inom funktionellt besläktade områden. Till exempel, den primära motoriska cortex (M1) eller sekundär representation av somatosensoriska cortex (S2; Figur 3Bi). En enda 1 ms tonen pip (25 kHz) stimulering ledde till aktivering av primära hörselbarken (A1) ungefär 20 ms efter auditiv stimulering (Figur 3Bii). Under de närmaste millisekunder, depolariseringen spridda över hörselbarken och skickas till grann sekundär somatosensoriska cortex. Ungefär 25 ms efter tonen insjuknandet, skulle en sekundär kortikal depolarisation växa fram, som ligger 1,07; 0,2 mm medialt och 1,9 ± 0,1 mm posteriort i förhållande till bregma (n = 9 möss). Detta är ungefär platsen för parietal föreningsområdet (PTA). VSD-signalen fortplantas sedan till mittlinjen område där andra kortikala associationsområdena är belägna inklusive retrosplenial (RS) och cingulate cortex (CG). Därför ledde auditiv stimulering till aktivering av två separata fokusområden, från vilken reser vågor av VSD depolarisering spred sig till ett större område inuti mittlinjen cortex. Fokal stimulering av det kontralaterala ögat med en 1 ms grön LED puls, ledde till aktivering av den primära visuella cortex inom 40 ms (fig 3Bv). Detta primära aktivering av syncentrum följdes av: (1) Rumslig expansion av VSD depolarisation till angränsande områden som ligger medialt, lateralt, och anterior till den initiala aktiverade området; (2) Depolarisering av en andra medial kortikal regionen ungefär 50 ms efter stimulering (n = 8 experiment) belägen längs sa gittal sutur. Denna var liknande sensoriska stimuli av forelimb (Figur 3Biii), bakbens (Figur 3Biv), C2 whisker eller provspelning. Framkallade VSDI svar från sensorisk stimulering av forelimb, bakbenen eller audition initialt aktiveras de respektive primära sensoriska cortex, följt av en anisotrop spridning av aktivitet, såväl som mittlinjen aktivering av cortex runt 20 - 40 ms efter stimulering. Detta resultat var liknande svar från visuella och morrhår stimulans. Förökning av sensorisk framkallade aktiviteten längs dessa mittlinjen rutter och frekvent aktivering av samma regioner av spontan aktivitet 6 kan tyda på att dessa regioner är det centrala navet av anslutnings kärnan i mus kortex, i vilken sensorisk information kan integreras med spontan kortikal aktivitet.
2fig1.jpg"/>
Figur 1. Kirurgisk Setup och Framställning. (A) Mouse huvudet rakas, renas, roteras ungefär 30 ° för exponering sidled, och säkras med den trubbiga änden av örat barer. Isofluran bedövningsmedel levereras via ett nosstycke och tänder hållare. Musen är täckt med självhäftande plastfolie för ökad sterilitet och värme. (B) närbild som visar hud och benhinna avlägsnas från parietalceller skallen plattan, är den temporala muskeln orörd. (C) Den temporala muskeln avlägsnas exponera den temporala plattan och squamosal ben, notera den ytliga venen är oskadad. (D) före fixering, är huvudplattan placerad i rätt läge med vax. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Steg-för-steg Kirurgisk procedur. (A) Den huvudplattan är fäst vid skallen med etyl-cyanoakrylatlim på de främre och bakre lägen. Notera placeringen av bregma (svart bit triangulära band). (B) Den kraniala fönstret framställs genom att applicera förtjockade dentalcement mellan huvudet-plattan och skalle. Observera att bregma och squamosal landmärken förblir synliga. (C) Efter torkning av cement, är hjärn buffert tillsättes för att mjuka skallen och att förhindra vidhäftning av dura. En valsad vävnad kommer att hjälpa att ta bort hjärnan buffert före borrning. (D) Kanterna hos kraniotomi har scored. Observera kärl lättare ses genom den förtunnade benet nära dentalcement kanter. (E) De parietala och temporala skalle plåtar har varit Avtagbared och dura är synlig. Notera fläckar av blod på dura från mindre blödningar, vilket är normalt. Noggrann undersökning under 2 - 4X förstoring kommer att avslöja två lager av blodkärl, en i dura och den andra i pia. (F) Dura är avlägsnas avslöjar en ren cortex. Pial kärl är klarröd utan fläckar närvarande. Notera herrelösa bitar av vit färgad dura vid kanterna av hjärn fönstret. I detta exempel, det var en mindre dural blödning vid den bakre delen av den kraniala fönstret, som snabbt koagulerat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Unika och Consensus aktiveringsmönster under flera former av sensorisk stimulering. < / strong> (A) Schematisk av den ensidiga kraniotomi visar de avbildade kortikala regioner. (B) Mikrofotografi av den breda ensidiga kraniotomi med bregma indikeras med en vit cirkel i varje bild. Mönster av kortikal aktivering visas i en mus bedövades med isofluran (0,5%) efter (i) stimulering (stim) hos den kontra C2 whisker, (ii) auditiv stimulering, (iii) kontra forelimb stimulering, (iv) kontrabakbens stimulering och (v) visuell stimulering av det kontralaterala ögat med en ljusemitterande diod (LED). Det fanns mittlinjen aktivering efter alla former av sensorisk stimulering (vita pilar) på 10 - 25 ms efter primär sensorisk cortex aktivering. Svaren är medelvärdet av 20 försök. Bilden andra från vänster i den andra raden (ii) indikerar den främre (A), bakre (P), mediala (M) och laterala (L) riktningar. Modifierad med tillstånd från Mohajerani, et al., 2013.p_upload / 52.642 / 52642fig3large.jpg" target = '_ blank'> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna innovativa protokoll för en stor kraniell fönster möjliggör samtidig avbildning över de temporala och parietala områden av hjärnbarken. Kombinerat med optisk avbildning, kan det hjälpa att avslöja neurala dynamiken i kortikala områden under spontan och stimulus-inducerad aktivitet. Denna expansiva kraniotomi exponerar också ett stort förlängning av den kortikala vaskulaturen nätverket, inklusive den proximala änden av den mellersta hjärnartären (MCA), som möjliggör in vivo-avbildning av blodflödet och direkt manipulering av laterala kärl för ischemiska modeller. Denna teknik kommer att vara till stor nytta för nyligen utvecklade linjer av möss som uttrycker spännings och kalciumindikatorproteiner 23. Dessa möss ger den praktiska fördelen att kringgå behovet av inkubering spänningskänsliga färgämnen på cortex. Dessa yttre färgämnen tar tid för att adekvat penetrera hjärnvävnad (~ 60-90 min) och är begränsade av deras milda toxicitet. Stora craniotomies har ocksåtidigare utnyttjats för att studera utvecklingen av råtthjäma med VSDI 11. Nyfödda råttor har en mycket större huvud och är jämförbar i storlek med vuxna möss. Detta ger forskarna en unik möjlighet att studera utvecklingsproblem inom neurovetenskap, om än inte med transgena möss.
De huvudsakliga begränsningarna med denna metod är oförmågan för kroniska experiment. Krökningen av skallen gör borrningsprocessen mer utmanande och tidskrävande än mindre craniotomies. För denna stora kraniotomi, är det viktigt att placera huvudet med den centrala sutur och squamosal landmärken för att vara parallell med fokuseringsplan linsen. Medan viss snedvridning av hjärnan förväntas från krökning av hjärnan, är dessa övervinnas genom att fokusera i de ytliga lagren av hjärnbarken. Detta problem ytterligare lindras genom att erhålla ett stort antal upprepningar av stimulans och medelvärdes. Sammanfattningsvis är vår stora kraniotomi teknik allmänt appLicable för studien av nuvarande problem inom neurobiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av en naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) Discovery Grant # 40352, Campus Alberta för innovation Chair, Alberta Alzheimer Research Program till MHM och NSERC SKAPA i BIF doktorandstipendium och AIHS forskarutbildning gemenskap till MK. Vi tackar Pu Min Wang för utvecklingen av detta protokoll och för kirurgisk utbildning och Behroo Mirza Agha och Di Shao för djurhållning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
