Summary
Bu protokol, fare serebral korteksinin temporal hem de parietal bölgelerinde üzerinde büyük tek taraflı kraniyotomi oluşturmak için bir yöntem sunulur. Bu kortikal yarımkürenin geniş alan üzerinde gerçek zamanlı görüntüleme için özellikle yararlıdır.
Abstract
Kraniyotomi in vivo deneyler için beyin ortaya çıkarmak için sıkça uygulanan bir yöntemdir. Fare araştırmada, çok laboratuvar küçük kraniyotomi, tipik olarak 3 mm x 3 mm kullanmaktadır. Bu protokol, fare temporal hem de parietal korteks üzerinde bir serebral hemisfer en açığa büyük ölçüde daha büyük bir 7 mm x 6 mm kafatası pencere oluşturmak için bir yöntem sağlar (- yan 4.5 mm, 0-6 mm, örneğin 2.5 bregmaya). Bu ameliyatı gerçekleştirmek için, kafa, yaklaşık 30 derece eğik olmalıdır ve temporal kas çok geri çekilmesi gerekir. Nedeniyle kemik kaldırma miktarının büyüklüğü nedeniyle, bu prosedür sadece cerrahi ve deney boyunca anestezi hayvanla akut deneyler için tasarlanmıştır.
Bu yenilikçi büyük yanal kafatası pencerenin temel avantajı korteksin Lateral ve medial alanlar eşzamanlı erişim sağlamaktır. Bu büyük tek taraflı kafatası pencere hücreleri arasındaki sinirsel dinamiklerini incelemek için kullanılabilir,hem de çoklu elektrod elektrofizyolojik kayıtları, nöronal aktivite (örneğin, içsel veya dışsal görüntüleme) ve Optogenetic stimülasyon görüntüleme birleştirerek farklı kortikal alanlar arasındaki olarak. Buna ek olarak, bu büyük kraniyotomi yanal kortikal damar doğrudan kontrol sağlayan, kortikal kan damarlarının geniş bir alanı gösterir.
Introduction
kranyotomi beynin bir bölümünü ortaya çıkartmak üzere Sinirbilimcilerce kullanılan standart bir prosedürdür. elektrofizyoloji başlangıcından beri, kraniotomi nörobilim alanında benzeri görülmemiş atılımlar sağladı. elektrotlar ile serebral korteksin Yoğun haritalama bu haritalara dayalı deneyler test hipotezler ve teoriler yol açmıştır. Son zamanlarda kraniyotomi maruz kalan bölgelerde 5, 6, 7 içinde kortikal aktivite gerçek zamanlı görünebilirliğini mümkün kılan, kortikal kan akışı, 1, 2, 3 ve nörovasküler mimarisi 4 in vivo görüntüleme için kullanılan olan yeni bir dönem girmiştir. Çok sayıda çalışma yapısı ve kortikal nöronlar, glia fonksiyonu ve cor çalışma, in vivo optik görüntüleme teknikleri ile bir arada kraniyotomi kullanmasına rağmentical damar 8, 9, daha ileri araştırmalar maruz korteksin küçük alanlar ile sınırlı (fakat 10) vardır.
Bu protokolün amacı, büyük bir yanal kraniyotomi oluşturma skuamöz kemiğe orta hat serebral korteks tutulması ve bregma ve lambda ötesine uzanan için bir yöntem temin etmektir. Bu büyük kraniyotomi eşzamanlı Birleşim kortislerinin görüntüleme (retrosplenial, singulat ve parietal), birinci ve ikinci motor, somatosensör, görsel, işitsel korteks sağlar. Bu yöntem, daha önce kortikal alanlar kendiliğinden ve uyarıcı indüklenmiş kortikal aktivite 5, 11, 12 boyunca birbiriyle nasıl etkileşime birden fazla araştırmak için voltaja duyarlı boya görüntüleme (VSDI) ile birleştirilmiştir. Bu prosedürün en zor yönleri kafasının konumlandırılması içerirHayvanın, kafa sabitleme plakası ve parietal kemik zamansal kas ayıran kanama önler. Bakım ayrıca eğik bir açıda kafatası eğrileri olarak delme ve kafatası çıkarma işlemleri sırasında alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki protokol Lethbridge Hayvan Bakım Komitesi Üniversitesi (ACC) kılavuzları takip ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi (ccac) standartlarına uygun olarak yürütülür.
1. Hazırlık
- uzamış çalışma süreleri için, tüm açılmış cerrahi malzemeleri otoklav ve bu kısırlık ameliyatı boyunca korunmasını sağlamak. Birden ameliyatları gerekiyorsa, ameliyat arasındaki otoklav.
- Ancak beyin tampon maddesi bol (en az 50 mL) içinde olduğundan emin olun. Çözelti 134 mM sodyum klorid, 5.4 mM potasyum, 1 mM magnezyum klorür hekzahidrat, 1.8 mM kalsiyum klorür dihidrat ve 5 mM HEPES, sodyum, 5 M hidrojen klorür ile 7.4'e dengelenmiş pH oluşur.
- indüksiyon odasında fare yerleştirin ve 3 ile anestezi - 4% izofluran. Ameliyat sırasında bakım için% 2.0 izofluran - 1.0 ile izleyin. görüntüleme sırasında% 0.8 - daha düşük 0.4 şekilde azaltmaks = "xref"> 5, 13, 14, 15, Resim Uygun anestezi yapılmaktadır. Anestezinin Bu düşük seviyeler bu ağrılı uyaranlara areflexic kalmasını sağlamak için fare (yaklaşık her 5 dakika) uyanık ve sık kontrol edilmesi gereken.
NOT: Dehidrasyon fare hacim oranına bağlı olarak yüksek yüzey sorunlu hale gelir ve izofluran uzun süreli kullanımı şiddetlenir olabilir.- 2 saat - tuzlu su deri altından enjeksiyonlar, 10 g vücut ağırlığı başına 0.1 mi, her 1 kullanın. 2 saat - yeterince hidrate, fare kez her 1 idrar edecektir.
- Yakından cerrahi ve görüntüleme boyunca tutarlı anestezi sağlamak için fareyi izler. gözetimsiz fareyi bırakın ve bu bilinci yerine asla özen vermeyin.
- 37 ° C olarak ayarlanmış bir termo-regüle ısıtma yastığı kafa tutucu set-up ve yere anestezi fare aktarın. Üst Teet elde edinH bir diş tutucusundayız.
- Farenin başını başın sağ yan tarafını ortaya çıkarmak için yaklaşık 30 ° sola döndürün ve farenin başını kulak çubuklarının kör ucuyla sabitleyin ( Şekil 1A ).
- Korneanın kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.
- Serebral ödemi azaltmak için, intramusküler olarak deksametazon (4 mg / kg) enjekte edin.
- % 4 klorheksidin (3 kez) ve% 70 etanol (3 kez) batırılmış pamuklu bezle cerrahi alanın üstündeki cildi silin. Her pamuk çubukunu yalnızca bir kez kullanın.
- Cerrahi eldivenleri giyin ve hayvanı yapışkan plastik sarıyla örtün. Lokomotomi alanına subkütan olarak lidokain (8 - 10 mg / kg;% 2 epinefrin) enjekte ederek lokal anestezi sağlayın. İlaç dokuya emilmesi için 3-5 dakika bekleyin.
2. Derinin Çıkarılması ve Kasın Kafatasına Çıkması
- Bu işlemlerin neredeyse tamamı gerçekleştirilirken kafatasını birdiseksiyon mikroskobu (örneğin 0.7 - 4.5x güç, duruma bağlı olarak).
- forseps ile (sadece kulağın arkasında) orta hattın hemen solundaki cilt 1 mm yukarı kaldırın ve cerrahi makas ile küçük bir yatay kesi yapar.
- sağ kulağa doğru 6 mm yanal kesim ve sonra başın rostral sonuna doğru kesti - 5 yapın.
- ilk kesi noktada, makas takıp rostral 10 mm kesti.
- Sağ kulak çevresinde cildi kesin ve sağ göz yakın kafatası ve temporal kas sağ tarafını ortaya çıkarmak için. maruz alanının en geniş kısmı en az 7 mm olduğundan emin olun. cerrahi alan genişletilmiş gerekiyorsa daha da cildi Trim.
- kafatası ve deri arasındaki bütil siyanoakrilat yapıştırıcı bir kaç damla koyarak kesik etrafında deri sabitleyin. doku sağlanması, daha önce yapışkan etkinliğini geliştirmek için pamuk uçlu aplikatörler ya da rulo dokuları ile kurutulmuştur.
- pamuklu bir bez kullanılarak, yüzey ovmakdairesel hareketlerle kafatası kafatası periost kaldırın. hiçbiri tamamen kafatası kurutarak kalmasını sağlayın.
- Yay makasları ve forsepsler kullanılarak, kafatası zamansal kas ayrı; kesme ve skuamöz kemik (Şekil 1C) ulaşana kadar yanal olarak kas çekin. , Gözün yakın skuamöz kemik seviyesinde boyunca uzanan yüzeysel zamansal damarı zarar vermemeye azami dikkat aksi durumda oluşabilecek kanamalıyım.
- Kontrol jel, köpük, beyin tampon maddesi içinde önceden ıslatılmış olan kanama. Ciddi kanama için bir ısı cauterizer kullanın. Isı cauterizer ile tedavi sonrası kanama siteleri üzerine bütil siyanoakrilat yapıştırıcı bırakın. Alan yapıştırıcı etkinliğini geliştirmek için pamuk uçlu aplikatörler ya da rulo dokuları kullanılarak daha önce kurutulur emin olun.
3. Kraniotomi
NOT: Cerrah kafatasının çıkarılması sırasında gayretli kalmalıdır vedura gereksiz komplikasyonları önlemek için. Sorun giderme adımları komplikasyonlar ortaya gerektiği dahildir.
- Marka bregma konumu bir ince uçlu kalem ile ya da altta yatan beyin bölgeleri yönlendirmek için (Şekil 2A), küçük bir üçgen parça bandı kesilmiş ve bregma bir köşe noktası ya da.
- kafa plakası tutturulmasına önce kafatası tamamen kuru olduğundan emin olun. daha çok kurutma gerekli olup olmadığını beyin tampon maddesi içinde ıslatılmış jel köpük uygulanmasından sonra, pamuk uçlu çubuk kullanmayın kafatası hızlı bir şekilde, kuru hava olacak. Bu adım, kafa plakası tespit edilmiştir (Şekil 1B) için çok önemlidir.
NOT: Orada periost sol kafatasında, ya kafatası kafa plaka üzerinde yapıştırma önce kuru değilse, o ayırmak olasılıkla olacaktır. Böyle bir durumda, hafifçe kafa plaka kaldırmak ve baştan başlayın. Bu işlem sırasında oluşabilecek kanama; o pıhtı için birkaç dakika bekleyin ve sonra yavaşça çıkarın. Bu süreç iki katından daha fazla tekrarlanması tavsiye edilmez. <li> kafa plakası 16 alt kenarı etrafında etil siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak ve kraniyotomi alan (Şekil 1D ve Şekil 2A) üzerinde kafa plakası tutkal. - Diş çimento sadece Kranyotomi alanı açıkta bırakarak ile kafatası ve kafa plaka arasında açıklık boşluğu doldurun. 10 dakika (Şekil 2B) - Diş kuru çimento ve sertleşmesine, tipik olarak 5 bekleyin.
- Çimento ayarlandıktan sonra, kısa bir süre için, beyin tampon maddesi ile dolgunun ve 3 bekletin - 5 dakika. (Şekil 2C) açılmadan önce beyin tampon kaldırmak için bir rulo dokusu kullanın.
- Hafifçe bir diş matkapla kafatasının yüzeyini puanlama cerrahi alanınızı belirleyin. Bir FG ¼ çapak ile, (20 PSI maksimum değerine ayarlanmış) bir pnömatik matkap kullanın ve bir değişken hız ayak pedalı kontrollü.
- Yavaşça derinleştirmek orijinal puanlama boyunca matkap iz, ematkap güvence altına almak beyinde (Şekil 2B) içine kafatası yoluyla nüfuz etmez. Al sondaj ve nemlendirilmiş haddelenmiş dokuları ile kafatası yüzeyi dabbing arasında her birkaç dakikada döner. Bu mekanik sürtünme ve uzun süreli maruziyetten kafatası ısıtma ve kurutma azaltacaktır.
Not: kafatası hızlı ıslak jel köpük uygulanmasından sonra kuru hava olacak. daha kuruma ihtiyaç duyulursa, pamuk uçlu çubuk kullanmayın.
Dikkat: kafatası kalınlığı eşit değildir. Kafatası orta çizgiye yakın bölge ve skuamöz görülecek nispeten ince Örneğin, paryetal temporal sırt, kalın bir alandır. - Sondaj sırasında, periyodik olarak hafifçe forseps veya olmayan hareketli matkap ile üzerine basarak kafatası burkulma kontrol edin. Kemik toka başladığı zaman, sondaj durdurmak ve beyin tampon maddesi içinde tüm pencereyi bırakın.
NOT: Kan bir alanın dışarı atılıyor, bu Dura zarar gördüğü önerebilir. Bu durumda, bir sem yerleştirmeki-ıslak alan üzerinde jel köpüğü ve yavaşça bir pamuk uçlu çubuk ile jel köpüğe basınç uygularken kan emmek için deneyin. - kemik yumuşatmak için ve kafatası çıkarma işlemini kolaylaştırma, kemiğe yapışmasını dura olasılığını azaltmak için kafatası çıkarıldıktan önce en az 5 dakika bekleyin.
- kafatası beyin tampon maddesi içinde batırılmış durumdayken kafatası kaldırma işlemini gerçekleştirin.
NOT: Kafatasının bir bölümü inatla bağlı kalmaya devam ederse, # 11 neşter bıçağı yavaşça kafatası skor kullanılabilir. kafatasını ve beynin içine bıçak delinme değil aşırı özen gösterin. - ön kenarından başlayarak, yavaşça forseps kullanılarak, dura 'dan gevşek kafatası kaldırın.
Not: kanama az miktarda kafatası kaldırma işlemi sırasında ortaya çıkarsa, bir transfer pipet veya şırınga ile tampon kaldırmak ve daha sonra, yeni tamponu ile değiştirin. - Kemik gevşek ve sonra forseps ile kemik, dura üzerine sıkıca kavrama "yüzen" ve kemiği kaldırınDura. Kemik asla beyne nüfuz olun.
- kanamayı kontrol etmek için, bir nokta şeklinde bir dokunun köşe rulo ve kafatası kuyudan tampon en çıkarmak. Bir pamuk uçlu çubuk ile çok hafif bir basınç eklenirken hızla kanama alanına, jel köpüğü, tampon içinde ön ıslatmaya uygulanır.
Not: kanama genellikle kemik veya dura yüzeyin kenarı gelir; Her iki olguda normaldir ve hiçbir önemli kan damarları zarar görür ise kanama hızla duracaktır. Kanama devam ederse, kan görüntüleme alanı üzerinde bir pıhtı yaprağının oluşturulması, tüm pencereyi doldurabilir.- dikkatli bir şekilde, pıhtı levha kaldırmak rüptüre kan damarının kaynağı etrafında sağlam kan pıhtısı bırakırken görüntüleme alanından pıhtılaşmış kan parçaları almak için. Bu daha da kan kaybına neden olabileceğinden kanama kaynağından kan pıhtısı kaldırmaz özen gösterin. herhangi bir kan yıkayacak beyin tampon maddesi ile beynin yüzey yıkayın.
- dokunmamak için özenhassas beyin dokusu ya da beyne yabancı maddelerin eklenmesi; 5 dakika boyunca (Şekil 2E) - kanama yaklaşık 2, durana kadar yineleyin.
NOT: kraniotomi kranial pencereyi hazırlamak için hazır Bu noktada (adım 5). Gerekirse, kranial pencereyi (Adım 4) takılmasından önce dura kaldırın.
4. Dura Kaldırma
NOT: Dura kaldırma aşırı dikkat gerektirir ve üzeri 15 dk sürebilir.
- kraniyotomi aşırı tampon uzak çizin. nemli bir yüzeye korurken, forseps ile dura küçük bir parça kapmak ve yavaşça dura gözyaşı.
- hafifçe yırtılma ve dura kesip forseps ve yay makas kullanın.
- dura yüzer ve beyinden ayrılması için beyin yüzeyi üzerinde daha fazla beyin tampon bırakın. Tüm Dura kafa penceresi sitesinden çıkarılana kadar devam edin. Doğru yapıldığında beyin farklı bl ile çok temiz olması görünecektirood kaplar ve herhangi bir leke (2F Şekil 2E karşılaştırın).
Dikkat: dura bazı alanlarda (parietal ilişki alanına orta hat proksimal yakınında örneğin,), beyin yüzeyinde küçük arteryollerin bağlı olan ve bu çıkarılması arteriolden bozulabilir. Böyle durumlarda, arteriol üstünden bozulmamış dura küçük bir parça bırakmak daha iyi olabilir. VSD bu küçük alanı nüfuz edebilir, ancak bu büyük kanama olan tercih edilir. - kısa sürede pulsasyon gelen hareketi en aza indirmek için ve şişme daha önlemek için mümkün olduğu kadar agaroz beyin yüzeyi saptamak (adım 5).
5. kraniyal Pencere hazırlanması
- % 70 etanol ile cam kapak Sprey ve yavaşça kuru bir hava kutuyu kullanın. Cam bir noktalar veya tozun tamamen temiz olduğundan emin olun.
- beyin tampon maddesi 15 mL agaroz tozunun 200 mg ısıtılarak% 1.3 agaroz hazırlayın. Mikrodalga fırın ayarlayınBütün agar eriyene kadar, yavaşça arasında karıştırılarak, her seferinde 15 saniye - 10 için yüksek ve ısıya ave.
Not: Bu görüntüleme ile engel olacak şekilde, hava kabarcığı veya partiküllerin bulunma olduğundan emin olun. - Sıcak agaroz bir termometre yerleştirilir ve aşağı doğru agaroz soğumaya sadece sıcaklık katılaşan yukarıda (~ 40 ° C).
Not: Agaroz kabın dış tarafı üzerine soğuk su çalıştırma soğutma işlemini hızlandırabilir. Yavaşça bir kabarcıkları sağlamak için, sürekli karıştırma veya partiküllerin bulunmaktadır. - Hemen agar uygulamadan önce, kafatası kuyudan beyin tampon çıkarın. Bir transfer pipet ile agaroz kadar çizin ve beyin üzerinde doğrudan agaroz bırakın. Hızlı bir şekilde yüzey üzerinde kapak kayma yerleştirin ve agaroz ile kapak kayma köşelerinde damla sıkıştırın.
6. Ötenazi
NOT: Deneyimlerimize göre, bu prosedür deneyimli alır cerrahlar en az 3-4 uygulama ameliyatları% 90'ından fazlasını elde etmekbaşarı oranı. Az deneyimli cerrahlar bile fazla deneyim gerektirir. kraniyotomi veya durotomy sırasında, beyin, beyin içine, kemiğin içinden matkap zımbalar gibi hasar sürdürmek olabilir. kraniyotomi kenarında Bazı küçük bir hasar izin verilebilir. Beyin parlak kırmızı hasarsız kan damarları ve beyaz korteks ile "temiz" görünmüyor Ancak, deney sonlandırılır gerekebilir. kötü preparatların örnekleri arasında, ölü kan damarları ile olanlar yer alır, veya korteks yırtık veya hasar görmüş kan damarları ile işaretlenmesi. Bu bulgulardan herhangi biri varsa, deney olası yüksek kalitede veri verecektir. Ameliyat / deneme başarılı olup olmadığı, insanca Deneyin tamamlanmasında fare euthanize.
- Derinden en az% 3.5 izofluran ile uyutmak. Daha sonra, 300 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitonal enjeksiyon ile verir. İğne karaciğer içine sokulur İdeal olarak, ölüm çok hızlı (<1 dakika) olur.
- perfüzyon gerekiyorsa, hayvan (adım 1.3) ilerlemeden önce derin anestezi olduğundan emin olun.
- perfüzyon gerekli değildir Alternatif olarak, 5 dakika en az bekleyin ve sonra fare ölmüş olduğundan emin olun. solunum, kalp atışı yokluğunun, hem de ağrı geri çekilmesi ve kornea refleksleri eksikliği teyit edin. Ayrıca, korteks üzerinde kan damarlarının soluk mavi / beyaz ekstremite renklendirme ve karartma için gözlemleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
6 mm yanal - tek bir yarım küre içinde kortikal alanlar arasındaki etkileşimi incelemek için, sagital sinüs ve 5 boyunca uzanan bir geniş kraniyotomi kullanılır. Bu kafa penceresi birinci (motor, somatosensör, görsel, işitsel), sekonder (motor, görsel) ve ilişki (retrosplenial, singulat, paryetal derneği) sağ beyin hemisfer (Şekil 3A) korteks dahil. Bu iş için, biz 3 zardaki potansiyel değişiklikleri yansıtır voltaja duyarlı bir boya (VSD), görüntüleme, kullanmıştır. Bu protokol, aynı zamanda, diğer dışsal (örneğin, kalsiyum 17 ve glutamat 18 görüntüleme) ya da iç görüntüleme deneyleri için yararlı olacaktır. hindlimb, ön ayakları, bıyık, görsel, ya da% 0.5 izofluran ile hafif anestezi farelerin işitme sistemi uyarıcı zaman, (kortikal depolarizasyon konsensüs kalıpları gözlenen> Şekil 3B). Önceki çalışmalarla uyumlu olarak 5, 19, 20, 21, 22, hem C2 namlu korteksin kısa dokunsal stimülasyonu Primer somatosensori alanlarında aktivasyonu, aynı zamanda işlevsel olarak ilgili alanlarda tepkilerinin "adaları" yol açtığını bulduk. Örneğin, primer motor korteks (M-1) ya da somatosensori korteksin ikinci gösterimi (S2 Şekil 3Bi). Tek bir 1 ms ton pip (25 kHz) uyarma primer işitsel korteks (A1) yaklaşık 20 ms işitsel stimülasyonu (Şekil 3Bii) sonra aktivasyonuna yol açtı. Önümüzdeki birkaç milisaniye içinde, depolarizasyon işitsel kortekste yayılmış ve komşu ikincil somatosensorial korteksine geçti. Yaklaşık olarak 25 ms ton başlangıcından sonra, ikinci bir kortikal depolarizasyon 1.0 bulunan, ortaya çıkacak7; 0.2 mm medyal ve 1.9 ± 0.1 mm arka rölatif (n = 9 fare) bregmaya göre. Bu, yaklaşık pariyetal ilişki alanı (PTA) konumudur. VSD sinyal daha sonra, diğer kortikal birleşme alanları retrosplenial, (RS) de dahil olmak üzere yer alır orta hat alanı ve singulat kortekste (CG) yayılır. Bu nedenle, ses uyarı olan VSD depolarizasyon yayılmasının ilerleyen dalgalar orta hat korteks içinde daha büyük bir alana iki ayrı odak alanı aktivasyonu, yol açmıştır. 1 ms yeşili ile diğer göz odak uyarımı, nabız LED 40 ms (Şekil 3Bv) içindeki birincil görsel korteks aktivasyonuna yol açtı. görsel korteksin Bu birincil aktivasyon izledi: medial bulunan komşu alanlara VSD depolarizasyon (1) Alan genleşme, yanal olarak ve ilk aktif alan anterior; (2) ikinci bir orta korteks bölgesinin depolarizasyon yaklaşık 50 ms uyarılması (n = 8 deney) sa boyunca yer sonra gittal sütür. Bu duyusal ön ayakları uyarımlar (Şekil 3Biii), arka bacağın (Şekil 3Biv), C2-whisker veya seçmeler için benzerdi. uyarılmasından sonra 40 ms - ön ayakları, arka bacağın veya seçmeler duyusal stimülasyondan Uyarılmış VSDI tepkiler ilk olarak bir faaliyetin anizotropik yayılması, aynı zamanda yaklaşık 20 korteksin orta hat aktivasyonu ile ilgili birincil duyu korteks, aktive edildi. Bu sonuç, görsel ve visker uyarılmasından yanıtları benzerdir. Spontan aktivite 6, bu orta hat yolları ve aynı bölgelerin sıkça aktivasyonu boyunca duyu uyarılmış aktivitesinin yayılma bu bölgeler duyusal bilgilerin spontan kortikal aktivite ile entegre olabilecek olan fare korteksi bağlantı çekirdeğin merkez noktası olduğunu düşündürmektedir.
2fig1.jpg"/>
Şekil 1. Cerrahi Kurulum ve hazırlanması. (A), fare kafası, temizlenmiş, traş yan maruz kalma yaklaşık 30 ° döndürülmüş ve kulak çubukları küt ucu ile sabitlenir. İzofluran anestezi bir burun parçası ve diş tutucu ile teslim edilir. Fare artan kısırlık ve ısınmak için kendinden yapışkanlı plastik film ile kaplıdır. (B) yakın çekim gösteren deri ve paryetal kafatası plakadan çıkarılır, periost, şakak kas bakir. (C), şakak kas zamansal plaka ve skuamöz kemik açığa çıkarılır gezgin yüzeysel ven hasarsız not edin. Düzeltilmeden önce (D), kafa plakası balmumu ile doğru konuma yerleştirilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2 . Adım Adım Cerrahi Prosedür. (A) Baş plakası kafatasına ön ve arka lokasyonlarda etil siyanoakrilat tutkalla tutturulmuştur. Bregma'nın yerini (üçgen banttan siyah parça) not edin. (B) Kafa penceresi baş plakası ve kafatası arasında kalınlaştırılmış diş çimentosu uygulanarak hazırlanır. Bregma ve squamosal yer işaretleri görünür kalır unutmayın. (C) Çimentonun kurutulmasından sonra kafatasını yumuşatmak ve duranın yapışmasını önlemek için beyin tamponu ilave edilir. Bir rulo doku, sondajdan önce beyin tamponunu çıkarmaya yardımcı olacaktır. (D) Kraniyotomi kenarları atılmıştır. Diş çimentosu kenarlarına yakın inceltilmiş kemik vaskülatürü daha kolay görür. (E) Parietal ve temporal kafatası plakaları çıkarılmışEd ve dura görülebilir. Küçük kanamalardan duranda kan lekeleri not edin, normaldir. 2 - 4X büyütme altında dikkatli muayene, biri durada ve diğeri piya'da olmak üzere iki damar kan damarı ortaya çıkaracaktır. (F) Dura, bozulmamış bir kortek açığa çıkarılır. Piyal vaskülatür parlak kırmızıdır ve leke yoktur. Kafa penceresinin kenarlarındaki beyaz renkli duranın dikkatsiz kısımlarına dikkat edin. Bu örnekte, kafa penceresinin arka kısmında, hızlı bir şekilde pıhtılaşmış küçük bir dural kanama vardı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3 . Duyusal Uyarımın Birden Çok Biçimde Benzersiz ve Konuşma Etkinleştirme Desenleri. < / strong> (A) şematik tek taraflı kraniyotominin görüntülü kortikal bölgelerini gösteren. Her bir görüntüdeki bir çember ile gösterilen bregma geniş tek taraflı kranyotomi (B) fotomikrograflarını. kortikal aktivasyon örüntüleri, (i) uyarma karşı C2 bıyık (stimülasyonu), (ii), işitsel stimülasyon, (iii) karşı ön ayakları stimülasyon, (iv) karşı arka ayak uyarılması ve sonra izofluran (% 0.5) ile anestezi bir farede gösterilmiştir (v) bir ışık-yayan diyot (LED) ile karşı gözün görme uyarılması. birincil duyu korteks aktivasyonundan sonra 25 ms - 10 duyu stimülasyon her türlü (beyaz oklar) sonra orta hat aktivasyon oluştu. yanıtları 20 deney ortalamasıdır. İkinci satırda, (ii) kalan ikinci görüntü anterior, (A), arka (P), orta (M) ve yan (L) yön işaret eder. , Et al. 2013 Mohajerani izni ile modifiye edilmiştir.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg" target = '_ blank'> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Büyük bir kafa penceresi için bu yenilikçi protokol, serebral korteksin temporal ve parietal alanlarında eşzamanlı görüntülemeyi mümkün kılar. Optik görüntüleme ile birleşince, spontan ve stimulus tarafından tetiklenen aktivite sırasında kortikal alanlardaki sinirsel dinamikleri açığa çıkarmaya yardımcı olabilir. Bu geniş kraniotomi ayrıca, orta serebral arterin (MCA) proksimal ucu da dahil olmak üzere, kortikal vaskülatür ağının geniş bir uzantısı ortaya çıkararak, in vivo kan akışının görüntülenmesini ve iskemik modeller için yanal damarların doğrudan manipülasyonunu mümkün kılar. Bu teknik, voltaj ve kalsiyum indikatör proteinleri 23 ifade eden farelerin yeni geliştirilmiş çizgileri için büyük yarar sağlayacaktır. Bu fareler, kortekste gerilim duyarlı boyaları inkübe etme ihtiyacını ortadan kaldırmanın pratik avantajını sunar. Bu ekstrinsik boyalar, beyin dokusuna yeterince nüfuz etmek için zaman alırlar (~ 60-90 dakika) ve hafif toksisitesi ile sınırlandırılırlar. Büyük kraniyotomiler de var.VSDI 11 ile gelişmekte olan sıçan beynini incelemek için daha önce kullanılmıştır. Yenidoğan sıçanların farları daha büyüktür ve yetişkin farelerle karşılaştırılabilir boyuttadır. Bu, araştırmacılara transjenik fareler olmasa da sinirbilisindeki gelişimsel sorunları incelemek için eşsiz bir fırsat veriyor.
Bu yöntemin ana sınırlamaları kronik deneylerin başarısız olmasıdır. Kafatasının eğriliği, delme işlemini küçük kraniyotomilere göre daha zorlu ve zaman alıcı yapar. Bu büyük kraniotomi için, kafayı lensin odaklanma düzlemine paralel olacak şekilde merkezi dikiş ve skuamozal yerler ile konumlandırmak hayati önem taşır. Beynin eğriliğinden beynin bir miktar bozulması beklenirken, bunlar korteksin yüzeysel katmanlarına odaklanarak üstesinden gelir. Bu problem, uyarı ve ortalamaların sayısız tekrarlarını elde ederek daha da hafifletir. Özetle, büyük kraniotomi tekniği yaygın bir uygulamanörobiyoloji mevcut sorunların çalışma için licable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery Grant # 40352, Yenilik Program Başkanı Campus Alberta, MHM Alberta Alzheimer Araştırma Programı ve BKF Doktora Arkadaşlık ve AIHS lisansüstü bursu için NSERC CREATE tarafından desteklenmiştir. Bu protokolün geliştirilmesi için Pu Min Wang'a, cerrahi eğitim için ve Behroo Mirza Ağa ve Di Shao'nun hayvancılık için teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating Pad | FHC | 40-90-2 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2 or more pairs are recommended |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00, 15000-10 | 1 pair should be designated for dura removal |
| Jet tooth shade powder | LANG Dental | Jet Tooth Shade Powder | to be mixed with the Jet Liquid |
| Jet tooth shade liquid | LANG Dental | Jet Tooth Shade Liquid | to be mixed wihth the Jet Powder |
| Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 | Midwest Dental | 385201 | |
| Agarose Powder | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Gelfoam | Sinclair Dental Canada | Pfizer Gelfoam | |
| Isoflurane | Western Drug Distribution Centre Ltd | 124125 | |
| Lidocaine 2% Epinephrine | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125299 | |
| Dexamethazone 5 mg/mL | Western Drug Distribution Centre Ltd | 125231 | |
| Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) | Western Drug Distribution Centre Ltd | 12612 |
References
- Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11759-11764 (2009).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5 (11), 874-885 (2004).
- Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12670-12675 (2010).
- Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16 (10), 1426-1435 (2013).
- Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30 (10), 3745-3751 (2010).
- Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98 (1), 502-512 (2007).
- Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7 (6), 449-463 (2006).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9 (3), 195-205 (2008).
- Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31 (12), 2221-2233 (2010).
- McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32 (32), 10982-10994 (2012).
- Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32 (15), 5132-5143 (2012).
- Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11 (12), 1951-1955 (2016).
- Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
- Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
- Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34 (48), 15931-15946 (2014).
- Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
- Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
- Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
- Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56 (5), 907-923 (2007).
- Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (22), E183-E191 (2011).
- Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85 (5), 942-958 (2015).
