Summary

Génération de microparticules lymphocytaire et détection de leur effet pro-apoptotique sur les cellules épithéliales des voies aériennes

Published: February 20, 2015
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Summary

Microparticules membranaires hangar cellulaires (PM) sont des vésicules biologiques actifs qui peuvent être isolés et leurs effets physiopathologiques étudiés dans différents modèles. Nous décrivons ici un procédé pour générer PM dérivées de lymphocytes T (PMT) et pour mettre en évidence leur effet pro-apoptotique sur les cellules epitheliales des voies respiratoires.

Abstract

L'intérêt pour les rôles biologiques des cellules vésicules membranaires dérivés dans la communication cellulaire a augmenté ces dernières années. Des microparticules (MP) sont un tel type de vésicules, de diamètre allant de 0,1 um à 1 um, et typiquement libéré de la membrane plasmique de cellules eucaryotes en cours de l'activation ou de l'apoptose. Nous décrivons ici la génération de microparticules de lymphocytes T dérivés (PMT) à partir de cellules T CEM apoptotiques stimulées par actinomycine D. PMT sont isolés par un processus de centrifugation différentielle en plusieurs étapes et caractérisé par cytométrie de flux. Ce protocole présente également un procédé de détection in situ de la mort cellulaire pour démontrer l'effet pro-apoptotique de PMT sur les cellules épithéliales bronchiques dérivés d'explants de souris primaires de tissus respiratoires bronchiques. Procédés décrits ici prévoient une procédure reproductible pour isoler des quantités abondantes de PMT à partir de lymphocytes apoptotiques in vitro. PMT dérivéde cette manière peut être utilisé pour évaluer les caractéristiques des différents modèles de maladies et de la pharmacologie et de tests de toxicologie. Étant donné que l'épithélium des voies aériennes offre une barrière de protection physique et fonctionnelle entre l'environnement externe et les tissus sous-jacents, l'utilisation d'explants de tissus bronchiques plutôt que des lignées de cellules epitheliales immortalisées fournit un modèle efficace pour les enquêtes qui nécessitent des tissus des voies respiratoires des voies.

Introduction

Microparticles (MPs) are biologically active submicron membrane vesicles released following cell activation or apoptosis. MPs are derived from both healthy and damaged cells and are implicated in many physiological and pathological processes.1 MPs have been detected not only in human plasma, but also in inflammatory and apoptotic tissue. The biological utility of cell membrane–derived MPs has been demonstrated in various settings, including cell signalling models and as pharmacological tools.2,3 We previously demonstrated that LMPs derived from T lymphocytes following actinomycin D stimulation (to induce apoptosis) suppress angiogenesis and inhibit endothelial cell survival and proliferation.4,5 The antiangiogenic effects of LMPs may vary significantly depending on the stimuli used to activate T lymphocytes in vitro.6

The airway epithelium functions as a protective physical and functional barrier. Increased numbers of T lymphocytes in the airway can contribute to cell damage and airway inflammation.7 We have shown that LMPs induce apoptosis of human bronchial epithelial cells,8 which indicated LMPs may change barrier function of bronchial epithelium in vivo. Apoptotic cells can be identified using the TUNEL method, which detects in situ DNA fragmentation.

The overall goal of this protocol is to illustrate the in vitro production of LMPs from a T lymphocyte cell line, and to demonstrate their proapoptotic effect on airway epithelial cells. In situ cell death detection demonstrated that LMPs strongly induce airway bronchial epithelial cell death, suggesting that LMPs-mediated injury to the airway epithelium may impact barrier function of the damaged epithelium.

Protocol

REMARQUE: Homme souris C57BL / 6 (ancienne 5-7 semaines) sont de Charles River Laboratories International, Inc. (St-Constant, Québec, Canada.) Et manipulés selon des protocoles approuvés par la Sainte-Justine Comité de protection des animaux CHU. Souris explants de tissus bronchiques constituent une bonne source de cellules épithéliales bronchiques primaires pour étudier les effets pro-apoptotiques de PMT sur les cellules épithéliales. Ce protocole décrit la génération in vitro de PMT, ainsi qu'…

Representative Results

PMT ont été caractérisés avec de l'annexine V coloration 10 par la cellule activé par fluorescence (FACS) analyse et fermée en utilisant une um perles dans lequel 97% des députés (≤1 um) ont été annexine-V-Cy5 positive (figure 1A et 1B). Typiquement, environ 2,5 mg de PMT ont été obtenus à la suite de ce protocole. Explants de tissus bronchiques de souris C57BL / 6 ont été soumis à un traitement véhicule et PMT. L'analyse histopathologique des sections bronchiques r…

Discussion

Les députés sont des médiateurs actifs de diaphonie intercellulaire et leur étude est prometteur dans de nombreux domaines de la science. 11 Cette étude a présenté un protocole détaillé pour in vitro production à grande échelle de PMT issues d'une lignée de cellules T apoptotique. Ces députés expriment un large répertoire de molécules de lymphocytes et sont biologiquement impliqués dans la régulation de l'homéostasie cellulaire et tissulaire. Cependant, PMT provenant de dif…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail est soutenu par des subventions des Instituts de recherche en santé (178 918), le Fonds de recherche en santé du Québec du Canada – Réseau de recherche sur la santé visuelle.

Materials

LMPs production and characterization
CEM T cells  ATCC  CCL-119
X-VIVO 15 medium  Cambrex, Walkersville 04-744Q
Flask T75 Sarstedt 83.1813.502
Flask T175 Sarstedt 83.1812.502
Actinomycin D  Sigma Chemical Co. A9415-2mg
PBS Lifetechnologies 14190-144
0.22µm filter Sarstedt 83.1826.001
Annexin-VCy5 BD Pharmagen  559933
FACS flow solution BD Bio-sciences 342003
Fluorescent microbeads (1 um) Molecular Probes  T8880
Polysterene counting beads (7 um) Bangs laboratories PS06N/6994
Polypropylene FACS tubes Falcon 352058
1 ml pipet Fisher 13-678-11B
5 ml pipet Falcon 357543
25 ml pipet Ultident DL-357551
1,5 ml conical polypropylene micro tube Sarstedt 72.690
15 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.554.205
50 ml conical polypropylene tube Sarstedt 62.547.205
50 ml high speed polypropylene copolymer tube Nalgene 3119-0050
250 ml high speed polypropylene bottle Beckman 356011
Protein assay (Bradford assay) Bio-Rad Laboratories 500-0006
Protein assay standard II Bio-Rad Laboratories 500-0007
Test tube 16×100 VWR 47729-576
Test tube 12×75 Ultident 170-14100005B
Cell incubator  Mandel Heracell 150
Low speed centrifuge IEC Centra8R
High speed centrifuge Beckman Avanti J8
High speed rotor for 250ml bottle Beckman JLA16.250
High speed rotor for 50ml tube Beckman JA30.50
Fow cytometry  BD Bio-sciences FACS Calibur
Spectrophotometer Beckman Series 600
Bronchial tissue explants and sections 
C57BL/6 mice (5-7 weeks old)   Charles River Laboratories, Inc. 
Mouse Airway PrimaCell™ System: CHI Scientific, Inc. 2-82001
 Rib-Back Carbon Steel Scalpel Blades Becton Dickinson AcuteCare 371310 #10
Scalpel Handle Fine Science Tools Inc.  10003-12 #7
phase-contrast inverted microscope Olympus Optical CO., LTD.    CK2
high O2 gas mixture  VitalAire Canada Inc.
modular incubator chamber Billups-Rothenberg Inc. MIC-101
MaxQ 4000 incubated orbital shaker Barnstead Lab-Line,  SHKA4000-7
12-well tissue culture plate Becton Dickinson and Company 353043
Plastic tissue culture dishes (100 mm) Sarstedt, Inc. 83.1802
Surgical scissors Fine Science Tools Inc.  14060-09 Straight, sharp, 9cm longth
Half-curved Graefe forceps Fine Science Tools Inc.  11052-10
humidified CO2 incubator Mandel Scientific Company Inc.  SVH-51023421
 Histopathological examination 
formalin formaldehyde Sigma-Aldrich, Inc.  HT5011
paraffin Fisher scientific  International, Inc. T555
ethyl alcohol Merck KGaA, Darmstadt EX0278-1
 glutaraldehyde  Sigma-Aldrich, Inc.  G6403
Cacodylate Sigma-Aldrich, Inc.  31533
microscope slides VWR Scientific Inc.  48300-025 25x75mm
Xylene Fisher scientific  International, Inc. X5-4
Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich, Inc.  MHS16 Funnel with filter paper  
HCl  Fisher scientific  International, Inc.   A144s-500
eosin  Sigma-Aldrich, Inc.  HT110116 Funnel with filter paper  
Permount™ Mounting Medium Thermo Fisher Scientific Inc.  SP15-100
glass coverslip surgipath medical industries, Inc. 84503 24×24 #1 
TUNEL detection kit In Situ Cell Death Detection, POD 11 684 817 910
oven Despatch Industries Inc. LEB-1-20
rotary Microtome Leica Microsystems Inc. RM2145
filter paper Whatman International Ltd. 1003150 #3
Microscope Nikon Imaging Japan Inc. E800
staining dish complete Wheaton Industries, Inc. 900200 including dish, rack, cover
1.5 ml eppendorf tube Sarstedt Inc.  72.69 39x10mm
Orbital and Reciprocating Water Bath ExpotechUSA ORS200
phosphate buffered saline   GIBCO 14190-144
fume hood Nicram RD Service 3707E

References

  1. Tushuizen, M. E., Diamant, M., Sturk, A., Nieuwland, R. Cell-derived microparticles in the pathogenesis of cardiovascular disease: friend or foe. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 4-9 (2011).
  2. Martinez, M. C., Tual-Chalot, S., Leonetti, D., Andriantsitohaina, R. Microparticles: targets and tools in cardiovascular disease. Trends Pharmacol Sci. 32 (11), 659-665 (2011).
  3. Benameur, T., Andriantsitohaina, R., Martinez, M. C. Therapeutic potential of plasma membrane-derived microparticles. Pharmacol Rep. 61 (1), 49-57 (2009).
  4. Yang, C., et al. Lymphocytic microparticles inhibit angiogenesis by stimulating oxidative stress and negatively regulating VEGF-induced pathways. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 294 (2), 467-476 (2008).
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Cite This Article
Yang, C., Xiong, W., Qiu, Q., Tahiri, H., Gagnon, C., Liu, G., Hardy, P. Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (96), e52651, doi:10.3791/52651 (2015).

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